3. A proteaszóma szerkezete és működése

A proteaszóma az eddig ismert legösszetettebb fehérjebontó enzim komplexum. Labilis szerkezet, mely magrészecskére és szabályozó részecskékre válhat szét. A proteaszóma proteolitikusan aktív részei a magrészecskében vannak, jól elkülönítve e henger alakú szerkezet belsejében. A fehérjék a henger két végén lévő csatornákon léphetnek be a részecskébe. Szabad magrészecske azonban nem bont le ubiquitin-fehérje konjugátumokat, csak szabályozó részecskével kapcsolódva (3.1. ábra).

Az ubiquitin-proteaszóma rendszer összefoglaló színes ábrája.

3.1. ábra Az ubiquitin-proteaszóma rendszer

A 26S proteaszóma

  • 2,5 MDa komplexum

  • 20S magrészecske

  • két 19S szabályozó részecske

  • multikatalitikus proteáz (MCP)

Az első leírás egy proteaszóma-szerű tulajdonságokkal rendelkező, cső alakú komplexumról még az 1960-as évek végéről származik. A későbbiekben rengeteg elnevezés született a proteaszómára vonatkozóan, ami jól mutatja, hogy mennyi problémával kellett megküzdeni biokémiai tulajdonságainak és sejten belüli szerepének meghatározása során az eltelt több, mint négy évtized alatt. Enzimológiai vizsgálatokkal egész sereg különböző proteolitikus aktivitást mutattak ki, ami a „multikatalitikus proteáz” (multicatalytic protease, MCP) egységes elnevezésre vezetett (Burger és Seth, 2004). Ezt a nevet érdekes módon hamarosan egy újabb váltotta fel, a proteaszóma, mely jobban hangsúlyozza a sejtszervecske méretű molekuláris „gépezet” jellegű tulajdonságait (3.2. ábra).

A 26S proteaszóma sárga és egy riboszóma kékesszürke térkitöltő modellje.

3.2. ábra A 26S proteaszóma térszerkezeti modellje (Baumeister és mtsai., 1998) mellette méretarányként egy riboszóma látható

Elektronmikroszkópos felvételeken a 26S proteaszóma elnyúlt szerkezetnek tűnik, amely kb. 45 nm hosszú. Ez egy központi 20S magrészecskéből áll (3.3. ábra), amelyet egyik vagy mindkét végéről a 19S részecske borít (3.4. ábra).

A 20S proteaszóma szürke elektronmikroszkópos képe.

3.3. ábra Izolált 20S proteaszóma (magrészecske) negatív kontraszttal készült elektronmikroszkópos képe

A 26S proteaszóma szürke elektronmikroszkópos képe.

3.4. ábra Izolált 26S proteaszóma (20S mag- és két 19S szabályozó részecske) negatív kontraszttal készült elektronmikroszkópos képe

Ezek a 19S „sapkák” vagy szabályozó részecskék, melyek emlősökben körülbelül 700 kDa molekulatömegűek (ezért PA700-nak [proteaszóma aktivátor 700 kDa molekulatömeggel] is hívják őket), szolgálják az ubiquitinilált fehérjék felismerését, és ezeket a fehérjéket a 20S magrészecske számára lebontható formába hozzák. A 20S magrészecskéhez kötődve a két 19S „sapka” ellentétes oldalra néz a 20S magrészecske középpontos szimmetriájára utalva. Érdekes, hogy egyszerre léteznek csak egyik vagy mindkét végükön „sapkát” viselő 20S magrészecskék. Igazából nem indokolja semmi a szimmetrikus komplexum szükségességét, sőt az aszimmetrikus felépítés jobban illik a működés folyamatához a szubsztrát felvételét és a termék leadását tekintve.

A 20S proteaszóma szerkezete

  • 28 alegység

  • prokarióta: 7-tagú homo-oligomer [α7β7β7α7]

  • eukarióta: 7-tagú hetero-oligomer [(α1-α7)(β1-β7)(β1-β7)(α1-α7)]

A 20S proteaszóma evolúciója

Az 1970-es években felfedezték, hogy a proteaszómák nemcsak az eukarióta sejtekben fordulnak elő. Felépítésében egyszerűbb, de szerkezetében megdöbbentően hasonló fehérjebontó komplexumot találtak az archebaktériumokhoz tartozó Termoplasma acidophilum-ban, mely később kulcsszerepet kapott a proteaszóma szerkezetének és enzimatikus mechanizmusának megvilágításában. Normál életkörülmények között a proteaszómák vagy proteaszóma-szerű komplexumok nem létfontosságúak a baktériumokban. A Mycobacterium smegmatis sejtek, melyekben törölték a proteaszóma géneket, életképesek és külsőre megkülönböztethetetlenek a vad típusú sejtektől. Ez jól egybeesik azzal a megfigyeléssel, hogy néhány, a közelmúltban meghatározott baktérium genomban nem találtak proteaszóma szerű géneket. Az eukarióta élesztőben egészen más a helyzet, itt a 14 proteaszóma génből bármelyik sérülése az egyed pusztulásával jár (letális).

A legtöbb Archaea és Actinobacteria egyféle α- és egyféle β-típusú alegységgel rendelkezik, de az összetétel változatos lehet: egyféle α- és kétféle β-típus, kétféle α- és egyféle β-típus, valamint kétféle α- és kétféle β-típus. Azokban a fajokban, ahol kétféle β-típusú alegységet szintetizálnak, egyesekről feltételezik, hogy az egyik közülük inaktív (pl. Sulfolobus, Pyrobaculum, Rhodococcus, és Aeropyrum sp., 3.5. ábra).

Különböző fajok 20S proteaszóma alegységeinek és segéd fehérjéiknek táblázatos felsorolása, az α-alegységek kék, a β-alegységek piros színű gömbökként ábrázolva.

3.5. ábra A 20S proteaszóma alegység-összetételének evolúciója

A prokariótákban tapasztalható sokféleséggel ellentétben, minden eukarióta 20S proteaszóma hét különböző α- és hét különböző β-típusú alegységből áll. A hétféle β-alegységből csak három, a β1, β2 és β5, melynek hidrolitikus aktivitása van. Az egyszerű eukariótáknak, mint az élesztőnek, csak egyfajta hét különböző α- és hét különböző β-típusú alegységből álló 20S proteaszómája van. Sok magasabbrendű eukariótának azonban paralóg génjei vannak. Például az Arabidopsis thaliana-ban az α7, β1, β6 és β7 alegységek kivételével mindegyiknek van párhuzamos párja, a Drosophila melanogaster-ben pedig a α3, α4, α6, β2, β4 és β5 paralóg gének csak hímekben fejeződnek ki. Ezeknek a megduplázott géneknek egyelőre ismeretlen a feladata (3.5. ábra).

A magasabbrendű gerinceseknél, így az emlősök esetén is a konstitutív katalitikus alegységek, β1, β2 és β5, γ-interferon (IFNγ) hatására β1i, β2i és β5i alegységekre cserélődnek, melyek immunoproteaszómát képeznek. Az immunoproteaszómának, melynek magasabb a tripszin-szerű és a kimotripszin-szerű aktivitása, mint a normális proteaszómának, fontos szerepe van a peptid antigének darabolásában, hogy alkalmasak legyenek az I-es fő hisztokompatibilitási komplexumon (MHC class I) való bemutatáshoz. A csecsemőmirigyben (thymus) egy másik katalitikus alegység, a β5t, épül be a 20S proteaszómákba a β5 vagy β5i helyett, a β1i és β2i-vel együtt. Ezt a thymus-specifikus proteaszómát thymoproteaszómának nevezik és az MHC class I korlátozott T-sejtek pozitív szelekciójában van alapvető szerepe, ami megnöveli a hasznos T-sejt készletet (3.5. ábra).

Az eukariótáknak vannak a proteaszómák összeszerelését segítő speciális külső chaperon fehérjéik. Ezek az Ump1 vagy UMP1 (ubiquitin-mediated proteolysis 1) és a Pba1-4 (proteasome biogenesis-associated 1-4) vagy PAC1-4 (proteasome assembling chaperone 1-4). A chaperon fehérjék kialakulását az alegység összetétel bonyolultabbá válása indokolja (Murata és mtsai., 2009).

A 20S proteaszóma molekuláris szerkezete

A 20S proteaszóma alapfelépítése megegyezik az archebaktériumoktól az eukariótákig, de eltérő alegység-összetételű. Az archebaktériumok proteaszómája két rokon, de mégis különböző alegység (α és β) 14-14 példányából áll (3.6. ábra).

A Thermoplasma α-alegységének zöld, β-alegységének piros térszerkezeti modellje.

3.6. ábra A Thermoplasma acidophilum 20S proteaszóma katalitikusan inaktív α (zöld) és aktív β (piros) alegységének térszerkezete. Jól látszik a két alegység nagyfokú homológiája. A β-alegység aktív proteolitikus centruma, az esszenciális nukleofil treonin, meg van jelölve (Thr1).

A fő különbség az α és β típusú alegységek között az, hogy az α típusú alegységeknek van egy erősen konzervált kiterjesztésük az aminoterminálisukon, melynek egy része (a 20-30. aminosavig) α-hélixet alkot a központi β-réteg tetején. Az N-terminális kiterjesztés szerepe nem ismert, de az α alegységekből álló gyűrűkön való elhelyezkedése közel az előkamrák bejáratához azt mutatja, hogy fontos lehet a szubsztrát továbbításában vagy a proteaszóma és a szabályozó alegységek közti kapcsolatban. Ehelyett az N-terminális kiterjesztés helyett a β típusú alegységeknek különböző hosszúságú előszekvenciái vannak, melyek a proteaszóma összeszerelődése során lehasadnak, szabadon elérhetővé téve a β-rétegek közötti hasadékot a központi üreg felől (Groll és Clausen, 2003).

Az eukarióta proteaszóma bonyolultabb, ez 14 különböző alegység két-két másolatából szerelődik össze, melyek aminosav sorrendbeli hasonlóságuk alapján α és β típusú csoportba oszthatók (Jung és mtsai., 2009). Az alegységek négy héttagú gyűrűbe rendeződnek, úgy hogy az α típusú alegységek alkotják a két külső gyűrűt és a β típusúak a két belsőt (3.7. ábra).

A 20S proteaszóma alegységeinek térbeli elhelyezkedése, az α-alegységek szürke, a β-alegységek fehér színű gömbökként ábrázolva.

3.7. ábra Az eukarióta 20S proteaszóma modellje. A kékkel bekarikázott β alegységek enzimatikusan aktívak.

Együtt egy henger alakú komplexumot hoznak létre, mely 150 Å hosszú és 115 Å széles, és három belső üreget zár közre; ezek kb. 5 nm átmérőjűek és négy keskeny befűződés határolja őket. A központi katalitikus üreget a két egymás melletti β gyűrű, míg a két külső üreget (előkamrát) egy α és egy β gyűrű közösen alkotja (3.8. ábra) (Pickart és Cohen, 2004).

A 20S proteaszóma szines térszerkezeti szalagmodellje és sárga térkitöltő modelljének hosszmetszete szürke metszéslappal.

3.8. ábra A 20S magrészecske felépítése. Baloldalon az élesztő 20S proteaszómájának szalag modellje látható (PDB accession code: 1RYP) az α- és β-gyűrűk feltüntetésével. Jobb oldalt az élesztő 20S proteaszóma metszete látszik, az atomi koordinátákból számolva 20 Å-os szűréssel. A félbevágott térkitöltő modellen előtűnik a két előkamra és a központi katalitikus kamra.

A lebontandó polipeptideknek belső üregek és szűkületek rendszerén kell átküzdeniük magukat, míg elérik az aktív centrumokat a központi üregben, a bejárati nyílástól legalább 8-10 nm-re, a β gyűrű közepén. A szubsztrát továbbítás mechanizmusa nem ismert, mint ahogyan a két előkamra pontos szerepe sem. Könnyen elképzelhető, hogy ha a 20S proteaszóma a szabályozó komplexumával kapcsolódik, mely ATP függő módon legombolyítja a szubsztrát fehérjéket, a legombolyítás és a polipeptid továbbítás egymással kapcsolt folyamatok és a legombolyított peptidláncot az alegységek „benyomják” a 20S magrészecskébe. Ha in vitro csak legombolyított polipeptidet adunk a 20S proteaszómának, akkor az képes lebontani, tehát a transzlokáció nem szigorúan energiafüggő. A proteaszóma belsejének szerkezeti sajátságai minden bizonnyal befolyásolják a polipeptidlánc véletlenszerű mozgását az aktív centrum hasadékai felé. Az 59 nm3 térfogatú előkamrákban az áthaladó polipeptid legombolyodott formában marad. Lehetséges, hogy a szűkületek, melyek elválasztják az áthaladó polipeptid elejét a végétől, az újra felgombolyodást hivatottak megelőzni.

A központi kamra, mely kevésbé hidrofób, mint az előkamrák, kb. 84 nm3 térfogatú. Ez elméletben lehetővé teszi, hogy egy kb. 70 kDa tömegű felgombolyodott fehérje elférjen benne. A lazán csomagolódott, legombolyodott fehérjék sokkal több helyet igényelnek. Mivel a polipeptidek csak egymás után léphetnek be az üregbe, a központi kamrában rendszerint nem lehet egyszerre egynél több polipeptid. A szerkezeti alapot a proteaszóma lebontó működéséhez a szubsztrát bezárása jelenti ebbe a 6-14 aktív centrumot tartalmazó kamrába. Előbb egy polipeptid lebontását teljesen befejezi, mielőtt megkezdene egy másikat (Cheng, 2009).

Az auto-kompartmentalizáció

A bevezetőben leírt fontossága mellett a fehérje bontás veszélyt is jelent, ezért térben és időben szabályozottnak kell lennie, hogy a le nem bontandó fehérjék degradációja megelőzhető legyen. A fehérjebontás szabályozásának egyik alapvető stratégiája a kompartmentalizáció, azaz a fehérjebontó tevékenység olyan helyekre történő korlátozása, melyekre csak valamilyen lebontási jellel rendelkező fehérjék juthatnak be. Ilyen kompartment lehet egy membránnal határolt sejtszervecske, mint például a lizoszóma, mely a lebontandó fehérjéket specifikus útvonalakon importálja. A feladatot végrehajtó hidrolázok is más fehérjéktől elválasztva, transzport vezikulumok útján jutnak a lizoszómába.

A prokarióta sejtek, melyeknek sem membrán határolt sejtszervecskéik, sem vezikuláris transzportrendszerük nincs, a kompartmentalizáció eltérő formáját alakították ki, nevezetesen az ön- vagy auto-kompartmentalizációt. Ez az alapelv jól működik több, egymástól független proteáznál, amelyek mind hasonló felépítésűek, s melyekben a fehérjebontó alegységek maguktól henger alakú komplexummá állnak össze. Ez belső üregeket zár közre, melyek több nanométer átmérőjűek, és az aktív centrumot foglalják magukba. Ezekbe a belső kompartmentekbe szigorúan csak fel nem gombolyodott polipeptidek kerülhetnek be, melyek át tudnak jutni a bejáratot őrző keskeny lyukakon vagy csatornákon. A célfehérjéknek tehát kapcsolatba kell lépnie egy „gépezettel”, mely képes azokat megkötni és letekert formában a proteolitikus magkomplexumba juttatni. Ez a kapcsolat lehet átmeneti vagy folytonos természetű. Mivel a fehérjék fel- és legombolyodási mechanizmusa igen közel áll egymáshoz, feltételezik, de nem bizonyított, hogy ezt a feladatot olyan ATPáz komplexumok végzik, melyek némileg hasonlítanak a chaperoninokra (ejtsd: saperonin; a hősokk fehérjék egy családja, melyek tagjainak belsejében más fehérjék legombolyodása történik) és ezért „reverz chaperonoknak” vagy „unfoldase-oknak” hívják őket. Mivel a működésükhöz ATP hidrolízise szükséges, a fehérje degradáció energiaigényes folyamattá válik, noha a polipeptidlánc hidrolízise maga energia felszabadulással járó (exoterm) folyamat.

Az auto-kompartmentalizációs proteázok általánosan előfordulnak mind a három fő életformában: archebaktériumokban (Archea), prokariótákban (Bacteria) és eukariótákban (Eukarya) (Pickart és Cohen, 2004). Valójában a sejtszervecskékkel, mint pl. a lizoszóma, ellentétben az auto-kompartmentalizációs molekuláris szerkezetek sokkal nagyobb rugalmasságot tesznek lehetővé: a megfelelő lokalizációs jelekkel felszerelve a sejten belül különféle helyeken alkalmazhatók a citoplazmában vagy a sejtmagban, ahol működésükre éppen szükség van (3.9. ábra).

Az E. coli proteáz lila, a Thermoplasma és az élesztő 20S proteaszóma kék térkitöltő modelljének felülnézete és hosszmetszete fekete metszéslappal.

3.9. ábra Az auto-kompartmentalizációs proteázok galériája: az E.coli ATP-függő kimotripszin-szerű aktivitással rendelkező proteázának (ClpP - caseinolytic peptidase), T. acidophilum 20S proteaszómájának és az élesztő 20S proteaszómájának felülnézete és hosszmetszete. A sárga pöttyök az proteolitikusan aktív alegységeket jelölik. Az elmetszett felület fekete. EK, előkamra; KK, katalitikus kamra

Katalitikus alegységek

  • β1 – post-glutamyl-peptidyl hydrolytic-like activity, kaszpáz-szerű aktivitás (Asp, Glu után)

  • β2 – tripszin-szerű aktivitás (Arg, Lys után)

  • β5 – kimotripszin-szerű aktivitás (Tyr, Phe után)

  • katalitikus nukleofil N-terminális treonin

  • a β7, β3 és β6 alegységek sorban az aktív zsebeket képzik

  • a β4 szerepe ismeretlen

Bár térszerkezetét kezdetben egyedülállónak gondolták, a későbbiekben kiderült, hogy a proteaszóma egy új fehérjecsalád, az úgynevezett Ntn (N-terminális nukleofil) hidrolázok alaptípusa. Az Ntn-hidrolázok közös vonása az „egyetlen oldallánc” aktív centrum, mely a proszekvencia autokatalitikus lehasításával válik szabaddá. Nagy meglepetés volt, amikor a Thermoplasma proteaszóma β alegységének N-terminális treoninját katalitikus nukleofilként is és elsődleges proton akceptorként is sikerült azonosítani, mivel mindaddig a proteaszómát, mint szokatlan fajta szerin proteázt tartották számon.

Hogyan képes a proteaszóma szinte bármilyen fehérjét rövid peptidekre bontani? Mint korábbi elnevezése, a multikatalitikus proteáz is mutatja, ez a komplexum többféle enzimaktivitással is bír. Ezeket rövid ún. fluorogén peptid szubsztrátokkal határozták meg, melyek hasításakor ultraibolya fénnyel gerjeszthető termék keletkezik. A termék által visszasugárzott fény nagy érzékenységgel detektálható, így nagyon kis mennyiségű termék is már mérhető. Az eukarióta proteaszómáknak három fő peptidáz aktivitásuk van: kimotripszin-szerű aktivitás, mely hidrofób; tripszin-szerű aktivitás, mely bázikus; és peptidil-glutamil peptid hidrolizáló vagy kaszpáz-szerű aktivitás, mely savas oldalláncú aminosavak után hasít (3.10. ábra). Emlős proteaszómákban két további specificitás jellemző: elágazó oldalláncú, illetve kis, semleges aminosavak utáni hasítás. A Thermoplasma és a Rhodococcus baktériumok proteaszómáinak csak kimotripszin-szerű aktivitása van, megegyezően azzal a ténnyel, hogy ezekben csak egy fajta aktív centrum található (Groll és Huber, 2004).

A 20S proteaszóma kék térkitöltő modelljének hosszmetszete fehér metszéslappal, az aktív helyek kinagyítva.

3.10. ábra A 20S proteaszóma hosszmetszete és katalitikus alegységeinek aktív centrumai. Az eredeti felszínek világoskékkel, a metszéslap fehérrel jelölt. A sárga pálcika modellek a kristályosítás során jelen levő calpain inhibitort, egyben a fél komplexum három aktív centrumát mutatják. A hasítási preferenciák: β1 alegység - kaszpáz-szerű aktivitás, β2 alegység - tripszin-szerű aktivitás, β5 alegység - kimotripszin-szerű aktivitás. A kinagyított részleteken pálcika modellként fel van tüntetve a nukleofil treonin oldallánc. A szubsztrát kötő zseb felszínének színezése: kék - bázikus, piros - savas, fehér - hidrofób oldalláncok.

Meglepő megfigyelés, hogy a szubsztrátok meglehetősen aspecifikus hasítása ellenére a keletkező termékek igen szűk mérettartományba esnek; átlagosan 7-9 aminosav hosszúak. Ez a tulajdonság, amely általánosan jellemző a prokarióta és eukarióta proteaszómákra, arra a feltételezésre vezetett, hogy egy belső „molekuláris mérce” határozza meg a termék hosszát. Az elképzelés szerint az egyszerre működő aktív centrumok közötti távolság adhat fizikai alapot egy ilyen mércéhez. A Thermoplasma proteaszóma kristályszerkezetében a szomszédos aktív centrumok között 2,8 nm-es távolság mutatkozik, ami kinyújtott konformációban hepta- vagy oktapeptidnek felel meg, vagyis úgy tekinthető, hogy bizonyítékot szolgáltat a molekuláris mérce elméletre. Másfelől viszont a termékek hosszának legutóbbi, még pontosabb analízise, bár az átlagos hosszban megegyezett, nagyobb méretbeli variációt mutatott, amit nehéz lenne pusztán geometriai alapon álló mércével magyarázni.

A fehérjebontó aktív centrum működése

A 3.11. ábrán az élesztő 20S proteaszóma β1-alegységének fehérjebontó aktív centrumának részletes szerkezete látszik (Groll és Clausen, 2003).

A 20S proteaszóma aktív helyének térszerkezeti részlete, a peptidlánc fehér, aminosav oldalláncok színesek.

3.11. ábra Az élesztő 20S proteaszóma β1-alegységének fehérjebontó aktív centruma

A polipeptidlánc gerince fehér hullámos vonalként van ábrázolva, ebből nyúlik ki az aktív centrum oldalláncainak (Thr1, Asp17, Lys33, Ser129, Asp166 és Ser169) pálcika modellje. Az Asp17-tel alkotott sókötés miatt a Lys33 pozitív töltésű, így elektrosztatikusan csökkenti a Thr1 hidroxil-csoportjának disszociációs állandóját (pKa). Az aktív centrumba nyúló további oldalláncok (Ser129, Asp166 és Ser169) a Thr1 térszerkezeti helyét határozzák meg. A sárga gömbbel jelölt vízmolekula pontosan úgy helyezkedik el, hogy a proteolízis idején protonokat tudjon közvetíteni a terminális amino-csoport és a Thr1 OH-csoportja között (sárga nyíl).

Az α-alegységek által működtetett kapumechanizmus

Hogyan kerülhetnek a lebontandó fehérjék a proteaszóma belsejébe? A Thermoplasma proteaszóma kristályszerkezetének megismerése feltárta egy csatorna létezését a henger közepén, a hétfogású szimmetriatengely mentén. Közvetlen bizonyítékot arra nézve, hogy ez a csatorna a tényleges bejárat a proteaszómába, az elektronmikroszkópos vizsgálatok adtak. Lefényképeztek egy továbbítás közben beszorult, arany kolloidszemcsével jelölt inzulin β-láncot. A viszonylag nagy (kb. 2 nm-es) aranyszemcse megakadályozta a molekulát, hogy a csatornán át az előkamrába csússzon. Az élesztő proteaszómában ezt a csatornát elzárják az α alegységek N-terminális oldalláncai, melyek a Thermoplasma proteaszómában rendezetlenek. Másrészről viszont az élesztő proteaszóma oldalán kis nyílások vannak az α és β gyűrűk közti határon. Elképzelhető az is, hogy ezek az oldalablakok valók a szubsztrát felvételére. Azonban nem túl valószínű, hogy ennyire konzervatív struktúrák gyökeresen eltérő utakat használjanak a transzlokációra. Az oldalablakok amúgyis meglehetősen rossz helyen lennének a szubsztrát felvételére, amikor a proteaszóma mag a szabályozó komplexummal kapcsolódik. Sokkal valószínűbb tehát, hogy az eukarióta proteaszómák is a központi csatornát használják, mely közben konformációs változásokon megy keresztül. Mivel az oldalablakok nem látszanak alkalmasnak a szubsztrát belépésére, lehetséges, hogy inkább a lebontási termékek kibocsátásában van szerepük.

Ha összevetjük a prokarióta és eukarióta 20S proteaszóma térszerkezeti ábráit (3.9. ábra, 3.12. ábra), láthatjuk, hogy míg az eukariótáknál az α-gyűrű mindig zárt, a prokariótáknál mindig nyitott. Az eukarióta proteaszóma α-alegységeinek N-terminális végei hidrogén-hidakkal kapcsolódnak a szomszédos végekhez. Ezzel egy blendeszerű zárórendszert alakítanak ki. Ez a kapu mindaddig zárva van, míg a 20S proteaszóma nem kapcsolódik egy szabályozó részecskéhez (19S vagy 11S). A prokariótáknál hiányzik ez a szabályozott kapumechanizmus. Az eukarióta kapumechnizmus vizsgálatára az α3 alegység N-terminálisáról 9 aminosavat (GSRRYDSRT) kivágtak (α3ΔN). Bár a többi alegység változatlan volt, a 20S proteaszóma α-gyűrűje nyitott maradt (3.12. ábra), mert az egymásra támaszkodó rendszer összeomlott. Az α-gyűrű alegységeinek N-terminális végeiből kialakuló zárórendszer fontosságát bizonyítja, hogy az α-alegységek N-terminális végi szekvenciái evolúciósan meglepően konzervatívak (Groll és mtsai., 2003).

Az élesztő vad és mutáns és az Archaeoglobus 20S proteaszóma kék térkitöltő modelljének hosszmetszete fehér metszéslappal, és színes modelljének felülnézete.

3.12. ábra Az eukarióta (élesztő) és a prokarióta (A. fulgidus) 20S proteaszómák α-gyűrűinek összehasonlítása

A szabályozó komplexum

A 19S komplexum

  • 19S cap, PA700, 20 polipeptid

  • alap + fedő (base + lid)

Mint ezt korábban láttuk, a 26S proteaszóma egy katalitikus magból, a 20S proteaszómából, és két 19S szabályozó részecskéből (RP – regulatory particle, PA700) áll. A 19S szabályozó részecske tovább osztható az alap és a fedő alkomplexumokra, melyek ATPáz aktivitást mutató (RPT - regulatory particle triple-A) és nem mutató (RPN - regulatory particle non-ATPase) alegységekből épülnek fel (3.13. ábra).

A 26S proteaszóma felépítése, az alegységek színes gömbökként ábrázolva.

3.13. ábra A 26S proteaszóma felépítése. A 19S szabályozó részecskében vannak ATPáz aktivitású (RPT - regulatory particle triple-A) és nem ATPáz (RPN - regulatory particle non-ATPase) alegységek. Az RPN10 alegység sárga színű, mert az alap és a fedő határán kapcsoló szerepet tölt be.

Az utóbbi években sokat haladt előre a 19S komplexum összetevőinek meghatározása. Jelenleg, a homológokat nem számítva, 15 különböző alegységet írtak le DNS bázissorrendjük alapján, és legalább további hármat azonosítottak SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. Hat alegység ATPáz aktivitást mutat és az AAA-ATPáz család tagja (AAA = ATPases associated with a variety of cellular activities, egy sereg sejten belüli tevékenységhez kapcsolódó ATPázok családja), melyben a proteaszóma ATPázok egy különálló ágat képeznek (RPT - regulatory particle triple-A). A 19S „sapka” ATPázok különleges ismertetőjegye, egy előre jelezhető kétszeresen feltekeredett szakasz az N-terminális közelében. Az ATPázok pontos szerepének meghatározása, amely minden valószínűség szerint a fehérje degradáció energiafüggő lépése lehet, még várat magára. Ebbe tartozhat a célfehérjék felismerése, megkötésük és legombolyításuk, továbbításuk a 20S magrészecske belső üregeibe, és/vagy a csatorna nyitása és zárása (Murata és mtsai., 2009).

A magkomplexum a szabályozó részecske megkötésével létrehozza a proteaszóma holoenzimet, és így aktiválódik a fehérjebontásra. A szabályozó részecske a magrészecske csatornájának a külső végéhez kötődik, ami arra utal, hogy a szabályozó részecske indítja meg a szubsztrát bekerülését a magba. A Thermoplasma acidophilum-ban a magba vezető csatorna csak 13 Å átmérőjű, így a továbbítódás a szubsztrát előzetes legombolyítását kívánja meg, melyet valószínűleg maga a szabályozó részecske végez. Ezek az adatok a szabad multiubiquitin láncok proteaszómához kötődésének vizsgálatával együtt az mutatják, hogy az ubiquitinilált fehérjék lebontásra való kiválasztását a szabályozó részecske végzi. Míg a szabad magrészecske képes kisebb peptidek hidrolízisére, specifikus aktivitása ezeken a szubsztrátokon kisebb, mint a holoenzimé. Ez a megfigyelés arra utal, hogy az élesztő magrészecskéjének csatornája a szabad formában zárt állapotban van. Tehát a szabályozó részecske egy másik feladata lehet a mag szubsztrát csatornájának nyitása és zárása.

A szabályozó alegység szokatlanul összetett ATPáz komplexum, nemcsak az ATPázainak sokfélesége miatt, hanem mert benne az ATPázok egy nagyobb, legalább 12 nem-ATPázt tartalmazó részecskébe ágyazódnak be. Kiderült, hogy a szabályozó részecske két további komplexumra tagolódik. Az egyik a szabályozó rész alapja (base), mely mind a hat ATPázt tartalmazza három nem-ATPáz mellett. A többi szabályozó alegység egy különálló komplexumot formál, melyet fedélnek (lid) neveznek és az alaptól kifelé helyezkedik el. Az alap-komplexum egyedül is képes aktiválni a magrészecskét peptidek és nem-ubiquitilált fehérjék lebontására, ami arra utal, hogy képes a magrészecske központi csatornájának nyitására. Az alap és a fedél domének azonban együttesen szükségesek az ubiquitin-fehérje konjugátumok degradációjához (Pickart és Cohen, 2004) (3.14. ábra).

A 26S proteaszóma felépítése, az alegységek színes gömbökként ábrázolva.

3.14. ábra Az élesztő 19S szabályozó részecskéjének alegység-összetétele. (Rpn - regulatory particle non-ATPase, Rpt - regulatory particle triple-A).

Míg a 20S proteaszóma, az enzimatikusan aktív magrészecske egy adott fajban mindig ugyanaz a komplexum, a 19S szabályozó részecskék alegység összetétele szövetenként más és más lehet. Sőt egyetlen sejten belül is lehetnek eltérő szabályozó alegység-összetételű proteaszómák. Átrendeződhet a szabályozó alegységek összetétele egy adott szövetben vagy sejtben a különböző fejlődési állapotokban is. Így tehát ugyanaz a 20S multikatalitikus proteáz mag a hozzákapcsolódó 19S szabályozó részecske alegységeinek térben és időben változó összetételétől függően más és más fehérjéket bonthat le.

19S „sapka” komplexumokat csak eukarióta sejtekben találtak, ami arra utal, hogy az ATPáz és nem-ATPáz alegységek a proteaszóma-komplexumhoz az evolúció során csak később adódtak hozzá. Sok közülük a proteaszómának az ubiquitin-rendszerhez való kapcsolásához szükséges (ubiquitin kötés vagy lehasítás), mely utóbbi az ubiquitin kapcsoló enzimkészletén keresztül specifikusságot kölcsönöz a proteaszómának. Ennek ellenére ez még nem azt jelenti, hogy a proteaszóma kizárólag az ubiquitin rendszerrel összefüggésben működne. A 19S komplexum legtöbb nem-ATPáz alegységének szerepe még mindig nem ismert. A génjeik elrontásával létrejött mutánsok nagy száma jól mutatja a proteaszóma részvételét egy sereg sejten belüli folyamatban, de kevés támpontot nyújt biokémiai szerepük feltárásához (Liu és Jacobson, 2013).

A 19S szabályozó részecske összeszerelődésének menete még nagyrészt ismeretlen, de valószínű, hogy az alap és a fedő egymástól függetlenül szerelődnek össze (Murata és mtsai., 2009). Élesztőben a Yin6 és a 90-es hősokk fehérje (heat-shock protein 90 - Hsp90) vesz részt a fedő összeállításában, mely két különböző alcsoportból alakul (3.15. ábra).

A 26S proteaszóma összeszerelődésének folyamata, az alegységek színes gömbökként ábrázolva.

3.15. ábra A 19S szabályozó részecske összeszerelődésének modellje az élesztőben

Az Rpn10-es (regulatory particle non-ATPase 10) alegység stabilizálja a kapcsolatot az alap és a fedő között. Az élesztőben az Ecm29 (extracellular matrix 29) fehérje feladata, hogy kipányvázza a 20S magrészecskét az a szabályozó részecskéhez. Emlősökben az úgynevezett modulátor komplexum segíti a szabályozó részecske hozzákapcsolódását a 20S magrészecskéhez.

A 26S proteaszóma összeszerelése a 20S mag- és 19S szabályozó részecskékből csak a részecskék gátolt állapotában lehetséges. A β alegységek túlnyúló N-terminális propeptidei közvetlenül gátolják a fél 20S magrészecskében levő enzimatikus alegységek aktivitását. Az α alegységek túlnyúló N-terminálisainak gátló hatása akkor kerül előtérbe, mikor a magrészecske két fele egyesül és zárt kamrát hoz létre. Az inaktív magrészecske burkoltan aktív formába kerül, melyben a β alegységek már autolízissel aktiválódtak. Az utolsó lépés a holoenzim kialakítása, amellyel egyidőben a központi csatorna is megnyílik (Köhler és mtsai., 2001) (3.16. ábra).

A 26S proteaszóma összeszerelésének folyamata, az alegységek fekete-fehér gömbökként ábrázolva.

3.16. ábra A 26S proteaszóma összeszerelésének és aktiválódásának összekapcsolt folyamatai – az auto-kompartmentalizáció. Az aktivitást akadályozó túllógó alegységvégek pirossal kiemelve.

A 11S szabályozó részecske

  • 11Sα és 11Sβ, 28 kDa alegységekből áll

  • γ-interferon indukálja

  • az immunoproteaszóma szabályozó részecskéje

A 20S proteaszómának van egy másik aktivátora is, melyet 11S vagy PA28 komplexumnak neveznek. Önmagában nincs enzimaktivitása, de ha 20S proteaszómával kerül össze meggyorsítja annak peptidáz aktivitását méghozzá ATP független módon (3.17. ábra).

Két 11S szabályozó részecskével (piros) kapcsolódó 20S proteaszóma (kék) térszerkezeti modellje.

3.17. ábra Két 11S szabályozó részecskével (piros) kapcsolódó 20S proteaszóma (kék)

Érdekes, hogy nincs hatással fehérjék illetve ubiquitinilált fehérjék lebontására. Mivel a szabad peptidek rövid életidejűek, ennek következtében ritkán fordulnak elő a sejtben eleinte nem volt világos, hogy mi a 11S részecske feladata. További érdekesség, hogy a komplexum csak magasabbrendű eukariótákban található meg, ami inkább speciális szerepére utal, mintsem alapvető funkciót feltételez. A legvalószínűbbnek az tűnik, hogy a proteaszóma antigén feldolgozó feladatában vehet részt. Az egyik érv, ami ez utóbbi mellett szól, hogy a γ-interferon nevű citokin hatására erősen megnő a 11S/PA28 szintézise. Mint ezt korábban láttuk, a γ-interferon hasonlóképpen serkenti a 20S proteaszóma három alternatív β-alegységének (β1i vagy LMP2, β2i vagy LMP7 és β5i vagy MECL-1) a termelődését is. Ezek helyettesítik a közönséges β-alegységeket az úgynevezett immunoproteaszómában. Ez a proteaszóma típus darabolja fel az idegen fehérjéket az MHC I komplexumon történő bemutatásra az immunrendszer antigén prezentáló sejtjeinek felszínén. Bár a 11S/PA28 szerepe így már megalapozottnak látszik, továbbra sem ismert a mechanizmus, mellyel a 20S proteaszóma aktivitását modulálja (Pickart és Cohen, 2004).

Ma már bizonyított, hogy a proteaszómának jelentős szerepe van a sejtfelszíni MHC I fehérjéken bemutatandó immunokompetens peptidek előállításában. Nyilvánvalóan a proteaszóma evolúciója megelőzte az immunrendszer evolúcióját és így a 7 és 9 tag közötti peptidek elérhetősége alapvető hatást gyakorolt az MHC I rendszer kialakulására. Cserébe a proteaszóma is válaszolt az immunrendszer specifikus peptid igényére azzal, hogy egyes β-típusú alegységeinek olyan variánsai alakultak ki, melyek γ-interferon indukció hatására helyettesíthetik a 20S magrészecskében állandóan jelenlevő megfelelőjüket, ezzel lehetővé téve a specificitás további módosítását.

Az ATP sokrétű szerepe a proteaszóma fehérjebontásában

A szabályozó részecske alap részében elhelyezkedő hat ATPáz alegység alapján feltételezhető, hogy a proteaszóma működése ATP igényes. Valóban a proteaszóma összeszerelődésétől a szubsztrát hidrolízisig több lépéshez is kell ATP. Ezek a következők:

  • a szabályozó részecske 20S magrészecskéhez kapcsolása

  • a szubsztrát megkötése

  • a 20S magrészecske kapu kinyitása

  • a szubsztrát kitekerése

  • a transzlokáció elősegítése

Annak eldöntésére, hogy ezek közül melyik lépéshez kell energia és melyekhez elég csak a nukleotid kötés egy egyszerűsített kísérleti rendszert állítottak fel. Az eukarióta 20S proteaszómát a Methanococcus jannaschii-ból származó PAN (proteasome-activating nucleotidase) komplexummal hozták össze, mely a 19S szabályozó részecske ősbakteriális homológja. Alegységeinek aminosav sorrendje 46%-ban hasonló a 19S ATPázaihoz. A PAN kötődése a 20S proteaszómához már lehetővé tette annak fehérjebontó működését, de nem igényelte a szubsztráton a multiubiquitinlánc jelenlétét. A csak nukleotid kötést igénylő lépések megtalálásához ATPγS-t, egy ATP analógot használtak. Térszerkezetében megegyezik az ATP-vel, de az ATPázok nem tudják hidrolizálni, azaz az energiát igénylő lépések nem mennek végbe, ha ATP helyett ez van jelen (3.18. ábra).

Az ATP és módosulata, a ATPγS szerkezeti képlete, a kénatom sárgával jelölve.

3.18. ábra Az ATPγS hasznos eszköz az ATP igényes reakciólépések leleplezésére

A kísérlet során megállapították, hogy az ATP kötődése a PAN-hoz elősegíti a 20S proteaszómához kapcsolódását és a 20S magrészecske kapu kinyitását (3.19. ábra). A szubsztrátot megköti a PAN ATP-t kötő formája, ez az ATP hidrolízisét stimulálja. A szubsztrát kihajtogatása az egyedüli lépés, ami valóban az ATP hidrolízisát igényli. A PAN ATP-t kötő formája elősegíti a kihajtogatott fehérje továbbjutását. A 20S proteaszóma felépítése és az aktív centrumok nukleofil támadása a szubsztráton valószínűleg lelassítja a kijutást, így a betöltés sebességének szabályozása eredményezi a rövid peptidekre történő lebontást (Smith és mtsai., 2005) (3.19. ábra).

A 20S proteaszóma hosszmetszetének és a hozzákapcsolódó PAN komplexumnak az ábráján láthatók a szubsztrát (zöld) bontás egyes lépései.

3.19. ábra Az ATP-függő lépések a fehérje degradáció során. A 20S proteaszóma hosszmetszetének és a hozzákapcsolódó PAN komplexumnak az ábráján láthatók a szubsztrát bontás egyes lépései. Az α alegységek kapuzáró, túlnyúló N-terminálisai pirossal jelöltek.

Összefoglalva, az ATP kötődése önmagában képes aktiválni a proteaszóma működésének különböző kulcslépéseit, beleértve a komplexum kialakítást, a szubsztrát kötést, a kapunyitást és a kihajtogatott szubsztrát transzlokációját a 20S proteaszóma belsejébe. Az ATP tényleges hidrolízise csak a szubsztrát kihajtogatásához szükséges (Zhang és mtsai., 2009).

Megtalálták a 19S alegységek szerepét is a folyamatban, így a 26S proteaszóma szubsztrát proteolízisének lépései a következők (3.20. ábra):

A 26S proteaszóma színes modelljei a szubsztrát bontás egyes lépéseivel.

3.20. ábra A 26S proteaszóma szubsztrát bontásának lépései

  1. A szabályozó részecske alapjában lévő Rpt5 (és valószínűleg más) ATPáz alegység felismeri a szubsztráthoz kapcsolt multiubiquitin láncot.

  2. Az alap egy vagy több ATPáz alegysége „fogást keres” a szubsztrát fehérjén. Erre alkalmas lehet egy lazábban feltekert régió (piros), mely a szubsztrát továbbításának kiindulópontjául szolgálhat. A szubsztrát továbbítását az alapon lévő lyukon keresztül ATP hidrolízise hajtja és a szubsztrát letekeredésével, denaturálásával jár.

  3. A szubsztrát átjut a 20S magrészecske tengelyében levő nyíláson, melynek nyitását az Rpt2, az alap ATPáz alegysége szabályozza.

  4. A katalitikus alegységek hidrolizálják a szubsztrátot, rövid peptidek keletkeznek.

  5. A peptidek a tengelynyíláson át elhagyják a katalitikus kamrát. Az áteresztőképesség maximalizálására a pórust egy másik oldali szabályozó egység nyithatja.

  6. Az Rpn11, a fedő nem ATPáz alegysége hidrolizálja a multiubiquitin láncot horgonyzó izopeptid kötést, a szabaddá váló láncot nem proteaszomális DUB enzimek bontják ubiquitin alegységekre (Pickart és Cohen, 2004).

Ellenőrző kérdések

  1. Rajzoljon le egy 26S proteaszómát és jelölje meg a részeit!

  2. Mi az auto-kompartmentalizáció?

  3. Hogyan szerelődik össze egy 26S proteaszóma?

  4. Milyen szabályozó részecskék kapcsolódhatnak egy 20S magrészecskéhez?

  5. Milyen enzimaktivitásai vannak a proteaszómának, mint multikatalitikus proteáznak?

  6. Milyen funkciói vannak a szabályozó részecske alegységeinek?

  7. Mi az ATP szerepe a proteaszomális fehérjebontásban?

  8. Milyen lépései vannak a proteaszomális fehérjebontásnak?

Irodalom

Baumeister, W., Walz, J., Zuhl, F. és Seemuller, E. (1998) The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell92, 367-80.

Burger, A. M. és Seth, A. K. (2004) The ubiquitin-mediated protein degradation pathway in cancer: therapeutic implications. Eur. J. Cancer 40, 2217-2229.

Cheng, Y. (2009) Toward an atomic model of the 26S proteasome. Curr Opin Struct Biol19, 203-8.

Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G. és Huber, R. (2003) Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol327, 75-83.

Groll, M. és Clausen, T. (2003) Molecular shredders: how proteasomes fulfill their role. Curr. Opin. Struct. Biol.13, 665-673.

Groll, M. és Huber, R. (2004) Inhibitors of the eukaryotic 20S proteasome core particle: a structural approach. Biochim Biophys Acta1695, 33-44.

Jung, T., Catalgol, B. és Grune, T. (2009) The proteasomal system. Molecular Aspects of Medicine30, 191-296.

Köhler, A., Bajorek, M., Groll, M., Moroder, L., Rubin, D. M., Huber, R., Glickman, M. H. és Finley, D. (2001) The substrate translocation channel of the proteasome. Biochimie83, 325-32.

Liu, C. W. és Jacobson, A. D. (2013) Functions of the 19S complex in proteasomal degradation. Trends Biochem Sci38, 103-10.

Murata, S., Yashiroda, H. és Tanaka, K. (2009) Molecular mechanisms of proteasome assembly. Nat Rev Mol Cell Biol10, 104-15.

Pickart, C. M. és Cohen, R. E. (2004) Proteasomes and their kin: Proteases in the machine age. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.5, 177-187.

Smith, D. M., Kafri, G., Cheng, Y., Ng, D., Walz, T. és Goldberg, A. L. (2005) ATP binding to PAN or the 26S ATPases causes association with the 20S proteasome, gate opening, and translocation of unfolded proteins. Mol Cell20, 687-98.

Zhang, F., Wu, Z., Zhang, P., Tian, G., Finley, D. és Shi, Y. (2009) Mechanism of substrate unfolding and translocation by the regulatory particle of the proteasome from Methanocaldococcus jannaschii. Mol Cell 34, 485-96.