4. Példák az ubiquitin-proteaszóma rendszer feladataira

dER minőségellenőrzés

A fel nem tekeredett fehérjék az endoplazmatikus retikulum (ER) lumenében ER stresszt váltanak ki, melyet a sejt azért indít, hogy uralja a helyzetet (Yoshida, 2007). Az emlős ER stresszválasz négy folyamatból tevődik össze: 1. a fehérjeszintézis megszakítása, 2. ER chaperonok expressziója, 3. felerősödő ER társult lebontás (ERAD - endoplasmic reticulum-associated degradation), 4. apoptózis (4.1. ábra).

Fekete-fehér stilizált sejtábra az ER stressz lépéseivel.

4.1. ábra Az emlős ER stresszválasz négy folyamatból tevődik össze: 1. a transzláció megszakítása, 2. ER chaperonok expressziója, 3. felerősödő ERAD, 4. apoptózis.

A négy folyamat közül lássuk most az endoplazmatikus retikulummal társult lebontás (ERAD) lépéseit (4.2. ábra).

Az ER membránt és a hibás fehérjék lebontásának lépéseit mutató színes ábra.

4.2. ábra Az ER-hez kötött lebontás (ERAD) lépései

  1. A fehérje felismerése. A hibásan hajtogatott fehérjéket, melyek citoplazmatikus, intramembrán vagy ER lumenbeli sérüléseket hordoznak citoplazmatikus és intralumináris chaperonok és a hozzájuk kapcsolt faktorok, mint a 70 kDa-os hősokk fehérje (Hsp70) család tagjai, kalnexin és kalretikulin, valamint a fehérje diszulfid izomeráz család tagjai ismerik fel.

  2. A fehérje célba juttatása. Az endoplazmatikus retikulummal társult lebontás (ERAD) szubsztrátjai a retrotranszlokációs gépezetbe kerülnek (retrotranszlokon) és/vagy E3-as ligázokhoz.

  3. A retrotranszlokáció kezdete. A szubsztrát kikerülését a citoplazmába részben a Cdc48 (cell-division cycle-48) komplexum indíthatja el. Más résztvevők, mint molekuláris chaperonok vagy a proteaszóma szintén szükségesek lehetnek ehhez a lépéshez. A retrotranszlokációhoz nélkülözhetetlen még a diszulfid hidak redukciója, illetve a szénhidrátláncok eltávolítása a fehérjéről. A Cdc48, egy AAA+ típusú ATPáz, által az ATP hidrolízisével felszabadított energia ugyancsak szükséges a retrotranszlokációhoz.

  4. Ubiquitiniláció és további retrotranszlokáció. Ahogy a fehérjék kijutnak a retrotranszlokonon keresztül az ER-ből E3-as ligázok multiubiquitinilálják őket. Ez kedvez a további transzlokációnak és citoplazmatikus ubiquitin-kötő komplexumok is segítik.

  5. Proteaszómába kerülés és lebontás. Amit egy multiubiquitinilált szubsztrát kikerül a citoplazmába, a 26S proteaszóma 19S szabályozó részecskéinek receptorai felismerik. A DUB enzimek eltávolítják a multiubiquitin láncot. A szubsztrát ezek után befűződik a 20S magrészecske katalitikus kamrájába és peptid fragmentumokra bomlik. Az ubiquitin újrafelhasználhatóvá válik egy újabb multiubiquitinilációhoz (Vembar és Brodsky, 2008).

Neurodegeneratív betegségek

A proteaszóma és az idegrendszer

A proteaszómák minden sejtben, így az idegsejtekben is megtalálhatóak. A központi idegrendszerben a többi szervektől eltérő alegység összetételű proteaszómák vannak. Eloszlásuk sem egyenletes, sejttípusonként változó. Az agykérgi piramis sejtekben illetve a gerincvelő mellsőszarvi motoneuronjaiban a proteaszómák 10-15%-a magi és 85-90%-a citoplazmatikus lokalizációjú. A többi idegsejtben a proteaszómák főleg magi elhelyezkedésűek. A különbség okát egyelőre nem ismerjük.

A neurodegeneratív betegségek

Az idegsejtek pusztulásával járó, úgynevezett neurodegeneratív betegségek oka és kórképe nagyon különböző lehet. Az egyik közös jellemzőjük: az idegsejtek citoplazmájában kisebb-nagyobb ubiquitinilált fehérje zárványok, aggregátumok jelenléte. Ezek megjelenésének oka, hogy a betegség folyamán abnormális vagy mérgező fehérjék keletkeznek, ezek aggregálódnak és így a fehérje bontó apparátus (a proteaszóma és az autolizoszómák) nem képesek lebontani őket. A sokféle neurodegeneratív betegség közül az ubiquitin-proteaszóma rendszer érintettségének bemutatására három példát választottunk ki:

  • Alzheimer-kór (AD)

  • Parkinson-kór (PD)

  • Huntington-kór (HD)

A mérgező fehérje aggregátumok képződésének mechanizmusa neurodegeneratív betegségekben

A betegséggel összefüggő fehérje (pl. szinuklein vagy huntingtin) hibás térszerkezete, hajtogatódása köztes oligomereken keresztül egyre nagyobb aggregátumok kialakulásához vezet (4.3. ábra).

A hibásan hajtogatott fehérjék sorsát mutató színes folyamatábra.

4.3. ábra A hibásan hajtogatott fehérjék sorsa és az ubiquitin-proteaszóma rendszerre gyakorolt hatásuk

A hibásan hajtogatott fehérjét az ubiquitin-proteaszóma rendszer el tudja takarítani mielőtt további rendellenes térszerkezeti változások történnének. Ha ez mégsem sikerül, az elősegíti a néhány fehérjéből összeálló köztes alakok (oligomerek) vagy esetleg a nagyobb fehérje aggregátumok kialakulását, amik már gátolják a proteaszómát és mérgezést okoznak. A fordított modellben az aggregátumok éppen a túlélést segíthetik a mérgező oligomerek elkülönítésével és az autofágia vagy esetleg a proteaszóma számára elérhetővé tételével. A proteaszómák bármilyen mechanizmus szerinti gátlása csak a mérgezés fokozódását idézi elő, mivel ilyenkor még az egyéb proteaszóma szubsztrátok is felhalmozódnak. Egy hibásan hajtogatott fehérje új kölcsönhatásokba léphet és ha nem képez összetapadt oligomereket vagy aggregátumokat, akkor funkció vesztéses (domináns negatív) vagy funkció nyeréses hatások is létrejöhetnek (Ross és Pickart, 2004).

A fehérjebontó rendszerek válsága a neurodegeneratív betegségekben

Előfordulhat, hogy egyes kulcsfontosságú idegrendszeri fehérjék térszerkezet megváltozik. A legtöbb oldható, hibás fehérje az ubiquitin-proteaszóma rendszerben (UPR) vagy a chaperon-mediált autofágiával (CMA) bomlik le az egészséges idegsejtben vagy a betegség korai fázisában (4.4. ábra).

Az ubiquitin-proteaszóma rendszer és az autofágia fokozatos válságának három fázisát mutató színes ábra.

4.4. ábra A fehérjebontó rendszerek (az ubiquitin-proteaszóma rendszer és az autofágia) fokozatos válsága a neurodegeneráció során (fent a pirossal bekarikázott autolizoszómákban elakadt a fehérje emésztés). Rövidítések: UPR, ubiquitin-proteaszóma rendszer; CMA, chaperon mediált autofágia.

Ezek a fehérjék azonban nem ideális szubsztrátjai a proteaszómáknak, ezért a citoplazmában halmozódnak fel. Néhány megváltozott térszerkezetű fehérje idővel mérgező hatást gyakorol erre a két lebontó rendszerre, ami gátolja a működésüket. Ezen túlmenően, ha a hibás fehérjék összetett struktúrákba rendeződnek (oligomerek vagy fibrillumok) akkor már nem tudnak lebomlani ezekben a rendszerekben. A bazális autofágia alacsonyan tudja tartani ezeknek a hibásan hajtogatott fehérjéknek a szintjét. Ezt követően a kisegítő fázisban a makroautofágia indukálódik, így lehetővé válik a nagyobb fehérje aggregátumok lebontása (4.4. és 4.5. ábra).

Piros ubiquitinekkel jelölt zöld fehérje aggregátumok bazális és indukált autofágia által történő lebontását mutató színes ábra.

4.5. ábra A hibás, rosszul hajtogatott idegrendszeri fehérjék lebontásának lehetőségei

A betegségtől függően a kisegítő fázis ideje változhat. A legtöbb esetben ezt a késői vagy válság fázis követi, amikor az idegsejt túlélése veszélybe kerül. Ebben a késői fázisban az UPR és CMA tovább blokkolódik, a makroautofágia aktivitása csökken, emiatt a mérgező fehérje képződmények felszaporodnak, és mindezek a sejt működésére negatív hatást gyakorolnak. A nagyméretű fehérje aggregátumok sokszor kevésbé mérgezőek, mert zárványokként elkülönülnek, és nem zavarják a sejt egyéb működéseit (4.4. ábra). Bár nem ismerjük a pontos okait a fehérjebontó rendszerek összeomlásának, a megnövekedett oxidatív stressz és az öregedés gyakran kiváltja ezt a kórképet (Klionsky, 2006; Martinez-Vicente és Cuervo, 2007).

Példák egyes neurodegeneratív betegségek patomechanizmusára

Alzheimer-kór kialakulása hibás ubiquitin miatt

Az Alzheimer-kór (AD - Alzheimer’s disease) progresszív, neurodegeneratív betegség. Az időskori elbutulás (demencia) leggyakoribb oka, ami a szellemi képességek súlyos romlásával jár együtt, olyan mértékig, ami a normális napi életvitelt, önellátást is lehetetlenné teszi. Velejárója a súlyos feledékenység, a gyakran látott, közel álló emberek nevének elfelejtése, illetve a mindennapi használati tárgyak megnevezésének képtelensége.

Az öregedő és Alzheimer-kóros agyban a poliubiquitin gén hibás leolvasása egy „+1 frameshift” fehérje kialakulásához vezet, mely 75 aminosavat tartalmaz az ubiquitin szekvenciából hozzákötve egy 20 aminosavas értelmetlen szekvenciához (ubiquitin+1). A deubiquitiniláló enzimek nem tudják eltávolítani az értelmetlen szekvenciát a 75 aminosavas ubiquitinről, mivel az ubiquitin ehhez szükséges 76-os glicinje hiányzik (4.6. ábra).

Fekete-fehér ábra a normális és a hibás poliubiquitin transzlációjáról és további processzálásáról.

4.6. ábra Az ubiquitin+1 kialakulása és hatása Alzheimer-kórban

Az ubiquitin és ubiquitin+1 ubiquitinilálása horgony nélküli multiubiquitin láncokat eredményez, amelyek gátolják a proteaszomális fehérjebontást. A C-terminális (proximális) végükön ubiquitint tartalmazó láncokat az izopeptidáz-T deubiquitiniláló enzim gyorsan szétdarabolja. A végükön ubiquitin+1-et tartalmazó láncok azonban rossz szubsztrátjai az izopeptidáz-T-nek és csak lassan szerelődnek szét. A proximális végükön ubiquitin+1-gyel végződő multiubiquitin láncok gátolják az ubiquitin-függő fehérjebontást, ami neuropatológiás következményekhez vezet (Layfield és mtsai., 2001).

Genetikai mutációk és a Parkinson-kór patogenezise

A Parkinson-kór (PD – Parkinson’s disease) a substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerg neuronjainak fokozódó pusztulásával, a striatum (STR) dopamin szintjének csökkenésével, és mozgási nehézségekkel (lelassult mozgás (bradykinesia), merevség, és remegés) jellemezhető betegség.

A parkin fehérje az ubiquitin-proteaszóma rendszerben, mint E3 ubiquitin ligáz működik (… ábra). A parkin együttműködik az Uba1 ubiquitin aktiváló (E1) enzimmel és az UbcH7 vagy UbcH8 ubiquitin konjugáló (E2) enzimekkel a CDCrel-1, az αSp22 vagy más néven α-synuclein interacting protein (az α-szinuklein egy szokatlan 22 kDa-os O-glikozilált formája), és a szinfilin-1 célfehérjék ubiquitinilálásában (4.7. ábra).

A parkin enzim működését mutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint zöld pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

4.7. ábra A parkin E3-as enzimként működik az ubiquitin-proteaszóma rendszerben. Rövidítések: CDCrel-1, cell division control-related protein 1; Ubn, multiubiquitin lánc; Pael-R, parkin-associated endothelin-receptor-like receptor.

A parkin elsőnek azonosított szubsztrátja, a CDCrel-1 (cell division control-related protein 1), más néven septin 5 (Sept5) elsősorban az agyban kifejeződő fehérje, mely főleg a gátló neuronok preszinaptikus axon terminálisában található. A szintaxin 1A fehérje SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) doménjéhez kötődik, ezért membránokhoz, szinaptikus vezikulumokhoz kapcsolódik. Gátolja az exocitózist, mert a vezikulum célba juttatás és fúzió folyamatait szabályozza. A parkin E3 ubiquitin ligáz közvetlen szubsztrátja, a Parkinson-kór autoszomális recesszív formájának egyik kiváltó molekulája.

A szinfilin-1 parkin általi ubiquitinilációja nem glikozilált α-szinuklein jelenlétében ubiquitinilált citoplazmatikus Lewy-test-szerű aggregátumok kialakulásához vezet. Az αSp22 is felszaporodik a Parkinson-kóros betegek agyában öröklött parkin mutációk következtében. Egyelőre nem ismert, hogy a αSp22 is Lewy-testekben rakódna le.

A parkin részt vesz az endoplazmatikus retikulumhoz kötött fehérjebontásban (ERAD) és az Ubc6 és Ubc7 ER kapcsolt E2-es enzimek segítségével mérgező, hibásan hajtogatott fehérjéket bont le, mint a G-protein kapcsolt receptor a Pael-R (parkin-associated endothelin-receptor-like receptor) (4.7. ábra). A Pael-R elsősorban oligodendrocitákban fejeződik ki, de egyes elkülönült neuron alpopulációkban is. A Pael-R hibásan hajtogatott és oldhatatlan formái a dopaminerg neuronok szelektív degradációját okozhatják. A parkin a Pael-R oldhatatlan formáját ubiquitinilálja, elősegítve a degradációját, ami visszaszorítja a hajtogatatlan fehérje indukálta sejthalál kialakulását. A CHIP, a HSP70 ko-chaperonja, fokozhatja a Pael-R parkin közvetítette ubiquitinilációját. A Pael-R felhalmozódik az agyban autoszomális recesszív mutáció okozta Parkinson-kór esetén (AR-PD) és a Pael-R overexpresszió indukálta sejtpusztulás kiküszöbölhető parkinnal (Chung és mtsai., 2001).

Sokféle genetikai lokusz áll kapcsolatban a Parkinson-kór örökletes, családi formáinak patogenezisével.

  • PARK-1 - α-szinuklein, Ala 53 → Thr, Ala 30 → Pro, Glu 46 → Lys (domináns)

  • PARK-2 - Parkin E3 (autoszomális recesszív)

    • Szubsztrátjai:

    • CDCrel-1 (cell division control-related protein 1), septin 5 GTPáz, szinaptikus vezikula dopamin felszabadulás

    • Pael-R (parkin-associated endothelin-receptor-like receptor), G-protein kapcsolt transzmembrán receptor, hajtogatási zavar

  • PARK-5 - UCH-L1, ubiquitin C-terminális hidroláz, Ile 93 → Met (domináns)

  • PARK-7– DJ-1, redox chaperon (autoszomális recesszív)

Az α-szinuklein gén két misszenz mutációja egy ritka, domináns forma kialakulásáért felel. Parkinson-kórhoz vezethet egy domináns mutáció az ubiquitin C-terminális hidroláz L1 (UCH-L1) génjében. Ezek mellett a parkin gén mutációinak egész sora felelős az autoszomális recesszív juvenilis parkinsonizmus (AR-JP) kialakulásáért. AR-JP-hez kapcsolódó parkin mutánsok nem tudják ubiquitinilálni és lebontani a parkin célfehérjéit, ami arra utal, hogy a fiatalkori Parkinson-kórt (AR-JP) lebontatlan fehérjék felhalmozódása okozza, melyek végül megmérgezik a dopaminerg neuronokat. Érdekes módon a parkin meg is tudja védeni a neuronokat a különböző támadásoktól, ami a parkin központi szerepét mutatja a dopaminerg neuronok belső rendjének fenntartásában. Legutóbb a DJ-1 gén és a Nurr-1 (nuclear receptor and transcription factor) kódoló NR4A2 gén mutációiról derült ki, hogy összefüggésben állnak a családi Parkinson-kórral. A DJ-1 vagy PARK7 a C56 peptidázok családjába tartozik és az androgén receptor-függő transzkripció pozitív szabályozója. Redox-chaperonként is működhet, az oxidatív stressz érzékelőjeként megvédi a neuronokat az oxidatív stressztől és a sejthaláltól.

A 4.8. ábrán nyomon követhető, hogy a fenti mutációk illetve a keletkező hibás térszerkezetű, funkció vesztett fehérjék hatására hogyan pusztulnak el a neuronok.

A hibásan hajtogatott fehérjék sorsát mutató színes folyamatábra.

4.8. ábra A mutáns, hibásan hajtogatott fehérjék sejtpusztulást okoznak Parkinson-kórban

A mutáns α-szinuklein és DJ-1 hibásan tekeredik fel, ezért túlterheli az ubiquitin-proteaszóma rendszert és a lizoszomális lebontó rendszert (4.8. ábra, kék nyilak). Más mutáns fehérjék, mint a parkin és az UCH-L1, elvesztik normális funkciójukat, az E3 ligáz aktivitást. Mivel mindkét fehérje az ubiquitin-proteaszóma rendszerhez tartozik, a mutáció hatására sérül az a képességük, hogy felismerjenek és lebontsanak hibásan hajtogatott fehérjéket (4.8. ábra, piros nyilak). A DJ-1 mutációja elrontja feltételezett chaperon aktivitását, megakadályozza a hibásan hajtogatott fehérjék újra hajtogatását, és a sérült fehérjék degradációra irányítását (4.8. ábra, piros nyilak). A különböző fenti változások mind nem kívánt fehérjék felhalmozódásához vezetnek, melyek nem mindenben ismert mechanizmus szerint (4.8. ábra, szaggatott nyilak), neurodegenerációhoz vezethetnek. A hibás mitochondriumok és a dopamin metabolizmus miatt keletkező oxidatív stressz poszttranszlációs modifikációk útján ugyancsak elősegítheti a hibás fehérje hajtogatódást, különösen az α-szinuklein és a parkin esetén. Az oxidatív stressz a Parkinson-kórban származhat a DJ-1 csökkent reaktív oxigén gyökhatástalanító képességéből, míg a mitochondriális működészavar, legalábbis részben a DJ-1 és a PINK1 csökkent aktivitásából és hibás elhelyezkedéséből. A mitochondriális működészavar, oxidatív stressz és hibás fehérje kezelés ezért mind összefüggésben állnak egymással ebben a feltételezett patológiás modellben (Vila és Przedborski, 2004).

A Huntington-kór molekuláris patogenezisének modellje

A Huntington-kór (HD – Huntington’ disease) egy gyors lefolyású, neurodegeneratív betegség. Jellemző tünetei, hogy a beteg akaratlan mozgásokat, agresszivitást, ingerlékenységet, érzelmi kitöréseket, a kognitív képességek romlását és szellemi leépülést tapasztal.

Tekintsük át, hogy ebben a betegségben milyen fehérjék hibája aggregációja okozza a proteaszóma rendszer válságát és végül az idegsejtek pusztulását. A Hsp70 és Hsp40 molekuláris chaperonok elősegítik az újonnan szintetizált huntingtin (htt) fehérjének a natív szerkezetre hajtogatódását (4.9. ábra).

A hibásan hajtogatott fehérjék sorsát mutató színes folyamatábra.

4.9. ábra A Huntington-kór molekuláris patogenezisének modellje

A vad típusú htt elsődlegesen a citoplazmában fordul elő és a klatrin-mediálta endocitózisban, a vezikuláris transzportban, a sejtvázhoz történő horgonyzásban, a neuronális transzportban vagy a posztszinaptikus jelátvitelben játszik szerepet. A htt bekerülhet a sejtmagba is és ott a transzkripciószabályozásban lehet feladata. A htt fehérje mutációja Huntington-kórban konformációs változásokat indukál és ez valószínűleg a fehérje rendellenes hajtogatódásához vezet, ami, ha nem javítják ki a chaperonok, a hibás térszerkezetű htt felhalmozódását okozza a citoplazmában. A htt-t különösen hajlamossá teszi az aggregációja az N-terminális poliglutamin szakasza. Ezzel párhuzamosan a mutáns htt proteolitikus bomlást szenvedhet, ami N-terminális fragmentumokat eredményez. Ezek a poliglutamin szekvenciájuk miatt β-rétegeket formálnak. Végül a mérgező hatást a teljes hosszúságú mutáns htt vagy a hasított N-terminális poliglutamin fragmentumok fejthetik ki. Ez utóbbiak oldható monomereket, oligomereket vagy nagy oldhatatlan aggregátumokat formálnak.

A citoplazmában a mutáns htt formák hatástalaníthatják az ubiquitin–proteaszóma rendszert (UPR), ami egyre több hibásan hajtogatott fehérje felhalmozódását eredményezi. Ezek a toxikus fehérjék a normális vezikulum transzportot és a klatrin-mediálta endocitózist is tönkretehetik. A mutáns htt jelenléte pro-apoptotikus fehérjéket is aktiválhat közvetlenül vagy közvetve mitochondriális károsodás útján, ami még nagyobb sejtes mérgezéshez és más lebontó folyamatokhoz vezet. Az önvédelmi erőfeszítései közepette, a sejt a mérgező fehérjedarabokat ubiquitinilált citoplazmatikus magkörüli aggregátumokba gyűjti. Ezen túl a mutáns htt bekerülhet a sejtmagba és ott magi inklúziókat hozhat létre, melyek a transzkripciót félbeszakíthatják és a magi UPR-t akadályozhatják (Landles és Bates, 2004).

Autofágia szabályozás

Mint a neurodegeneratív betegségek példáján is láttuk a két fő sejten belüli fehérjebontó rendszer, az ubiquitin-proteaszóma rendszer és az autofágia, egymást kiegészítő vagy akár egymást helyettesítő folyamatok. Ennek alapján szoros összeköttetésben kell lenniük, hogy a fehérjebontás zavartalanul működjön. Az egyik kapcsoló molekula a két folyamat között a p62 fehérje, más néven sequestosome-1, melyet eredetileg az atípusos protein kináz-C kölcsönható partnereként izoláltak. A p62 egy multidomén fehérje, mely részt vesz az NF-κB transzkripciós faktor aktiválásában. A p62 fehérje felismeri a mérgező szemetet a sejtben, amit aztán az autofágia eltakarít. Az autofágia hiánya a p62 felszaporodásához vezet, ami nem jó a sejteknek és stressz választ indít, ami betegséghez vezethet. A p62 részt vesz az autofágia szabályozásában, az apoptózis külső útvonalának működéséhez is köthető, sőt kulcsfaktor a tumor képződésben is. A p62 a sejthalál és túlélés fontos döntéshozatali pontjain helyezkedik el (Moscat és Diaz-Meco, 2009).

A p62 domén szerkezete

A p62 fehérjének öt funkcionális doménje van (4.10. ábra):

  • Phox és Bem1p domén (PB1),

  • ZZ-típusú cink ujj domén,

  • TRAF6-kötő domén (TB - TRAF6-binding domain),

  • LC3 kölcsönható régió (LIR - LC3-interacting region), és

  • ubiquitin-kötő domén (UBA - ubiquitin-associated domain).

A p62 szerkezeti doménjeit színes síkidomokkal bemutató ábra.

4.10. ábra A p62 fehérje szerkezeti doménjei és kölcsönható partnerei

A p62 PB1 doménje egy fehérje-fehérje interakciós modul, mely más jelátviteli molekulákban is megtalálható, mint az atípusos protein kináz-C (aPKC) és a Par-6 sejt polaritás fehérje. Az aPKC-k és a p62 a PB1 doménjeiken keresztül egymáshoz kapcsolódnak és ez a kötés az NF-κB transzkripciós faktor aktiválását eredményezi. Emellett a p62 PB1 doménje lehetővé teszi az oligomerizációját is, ami nélkülözhetetlen a sejtbeli feladatainak ellátásához (Moscat és mtsai., 2007).

A p62 kis foltokban vagy nagyobb aggregátumokban található a citoplazmában, ezek a PB1 doménjükön keresztül összetapadt p62 oligomerekből és p62-aPKC komplexumokból, valamint multiubiquitinilált fehérjékből állhatnak. A citoplazmatikus foltok jelszerveződési pontok, ahol a p62 a TB doménjén keresztül kölcsönhatásba lép a TRAF6-tal és az UBA doménjével kaszpáz-8-cal (Jin és mtsai., 2009). A TRAF6 (tumour-necrosis factor (TNF)-receptor associated factor 6) egy 63-as lizin (K63) E3 ubiquitin ligáz. A p62 kapcsolódása a TRAF6-tal elősegíti az oligomerizációját, majd az aktiválódását, ami a TRAF6 K63 típusú multiubiquitinilálódásához és végül az NF-κB aktiválásához vezet.

Az autofágia és a p62 közötti kapcsolatot alátámasztja az a tény, hogy a p62 a LIR (LC3-interacting region) doménjén keresztül az Atg8/LC3 autofágia szabályozó molekulához köt valamint az a megfigyelés, hogy a p62 felszaporodik autofágia hiányos egerekben (Komatsu és mtsai., 2007). A p62 PB1 partnerével, az NBR1-gyel (neighbor of BRCA1 gene 1) együtt szabályozza a multiubiquitinilált, hibásan hajtogatott és aggregálódott fehérjék és működésképtelen sejtorganellumok csomagolását és célba juttatásukat az autofág struktúrákba emlős sejtekben és muslicában (Kirkin és mtsai., 2009; Nezis és mtsai., 2008).

A hibásan hajtogatott fehérjék lebontásának modellje

Az ubiquitin független fehérje lebontás a 20S proteaszómákban vagy a chaperon-mediált autofágia (CMA) útján zajlik (4.11. ábra). Az ubiquitin-függő protein degradáció az ubiquitin-proteaszóma rendszeren (UPR) keresztül vagy autofágiával történhet. Az UPR-be irányított ubiquitinilált fehérjéket közvetlenül a 26S proteaszóma 19S szabályozó részecskéje ismeri fel vagy az UbL–UBA család fehérjéi, mint például a Rad23 vagy az ubiquilin 1, viszik a proteaszómához őket (4.11. ábra).

A hibásan hajtogatott fehérjék sorsát mutató színes folyamatábra.

4.11. ábra A hibásan hajtogatott fehérjék lebontásának modellje

Emellett átmenetileg p62 testekben gyűlhetnek össze a hibásan hajtogatott fehérjék, ami az autofág lebontásukkal végződik. Az ubiquitin-kötő autofágia receptor fehérjék, a p62 és a NBR1 szükségesek mind az autofág struktúrák kialakulásához (az LC3/GABARAP család fehérjéivel közvetlenül kapcsolódnak az autofagoszómák formálásakor), mind a lebomlásukhoz. A BAG1 és BAG3 ko-chaperonok egymáshoz viszonyított arányától függ, hogy a hibásan hajtogatott fehérjék autofágiával bomlanak-e le. Magas BAG3 : BAG1 arány az autofágiát stimulálja és p62 testek kialakulását indukálja. A proteaszóma károsodása aggreszómák kialakulásához vezet. Az aggreszómák kialakulásához a fehérje aggregátumok mikrotubulusokon történő szállítására van szükség, melyet a HDAC6 ubiquitin-kötő tubulin deacetiláz közvetít. A p97/VCP, egy chaperon és AAA+ ATPáz tulajdonságú fehérje kapcsolatba lép a HDAC6-tal és a szabályozó szerepet játszik a folyamatban (Lamark és Johansen, 2010).

Ubiquitinilált fehérjék útja az autofagoszómákba

Lássuk most pontosan hogyan is kerülhetnek az ubiquitinilált fehérjék az autofagoszómákba. A p62 mellett az NBR1 (neighbor of BRCA1 gene 1) fehérjét is azonosították, mint az Atg8 fehérje családdal kölcsönható, LC3- és ubiquitin-kötő fehérjét (4.12. ábra).

A p62 és az NBR1 szerkezeti doménjeit színes síkidomokkal bemutató összehasonlító ábra.

4.12. ábra A p62 és az NBR1 fehérjék domén szerkezetének vázlatos összehasonlítása. Az ábrán látható rövidítések: PB1: Phox és Bem1p domén; ZZ: cink ujj domén; TB: TRAF6-kötő domén; CC: coiled-coil domén; LIR: LC3-interaktív régió; UBA: ubiquitin-kötő domén.

Az NBR1 a LIR régiójának köszönhetően autofág úton bomlik le, de ehhez nem feltétlenül szükséges a p62 (4.13. ábra). A p62-höz hasonlóan az NBR1 is felhalmozódik és aggregálódik, ha az autofágia gátolt és a patologikus zárványok részét képezi (Ding, 2010).

Az LC3-at jelző zöld ellipszisekkel dekorált sötétebb zöld fagofór és egy sárga fehérje aggregátum kapcsolódása a piros multi-ubiquitinlánchoz kötő lila p62 és rózsaszín NBR1-en keresztül.

4.13. ábra A p62 és a NBR1 autofágia receptorok, melyek kapcsolatba lépnek egyrészt az UBA doménjükkel az ubiquitin-pozitív fehérje aggregátumokkal, másrészt a LIR régiójuk segítségével a formálódó autofagoszómák membránján az LC3-mal és az ubiquitinilált célfehérjéket az autofagoszómákba irányítják, így elindítják autofág lebontását.

A fehérje aggregátumok ubiquitinilálásának jele kiváltja az NBR1 vagy p62 adapter fehérjék kötődését, melyek az LC3-hoz (light chain 3; az Atg8 (autophagy protein 8) emlős homológja) is hozzákötnek. Ez utóbbi a formálódó autofagoszóma kettős membránjában lévő lipidekhez kapcsolódik (4.14. ábra).

Nagy szürke ellipszisekkel jelölt autofagoszóma és autolizoszóma, kis zöld ellipszis LC3-mal és kis lila körcikk hidrolázokkal.

4.14. ábra Ubiquitinilált fehérjék útja az autolizoszómákba. Rövidítések: LC3, light chain 3, az Atg8 emlős homológja; PE, foszfatidil-etanolamin; HDAC6, hiszton deacetiláz 6.

Mindez lehetővé teszi, hogy az aggregátum bekerüljön a képződő autofagoszómába, ami aztán lizoszómával olvad össze, hogy a belső membrán határolta vezikulum a benne levő tartalommal hidrolitikus enzimek által lebontásra kerüljön (Tyedmers és mtsai., 2010).

Az Nrf2 aktivitásának szabályozása az autofágia receptor p62 által

Normális körülmények között a bazális autofágia folyamatosan eltakarítja a citoplazmából a p62-t és a hozzákötődő szállítmányt, a mérgező aggregálódó fehérjéket. Az Nrf2 (nuclear factor (erythroid derived 2)-like 2) fehérje, egy stressz válasz transzkripciós faktor, a Cul3–Rbx1 ubiquitin ligáz komplexum és a Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1) adapter segítségével ubiquitinilálódik és a proteaszóma által bomlik le (4.15. ábra).

A Nrf2 lebontását mutató színes folyamatábra, ahol az egyes fehérjéket színes síkidomok jelölik.

4.15. ábra Az Nrf2 (nuclear factor-like 2) transzkripciós faktor lebontása normális körülmények között

Autofágia hiányában, a p62 fehérje és a hozzákapcsolódó aggregátumok felhalmozódnak a citoplazmában (4.16. ábra). A felesleges p62 a Keap1-hez kötődik, megszakítva az Nrf2 ubiquitinilációját és ebből következően a lebontását. Ez a citoplazmatikus Nrf2 szint emelkedését okozza, lehetővé téve, hogy az Nrf2 belépjen a sejtmagba, ott a Maf transzkripciós faktorral heterodimerizáljon és aktiválják a génátírást az antioxidáns válaszelemet (ARE - antioxidant response element) tartalmazó promóterekről. A megnőtt Nrf2 aktivitás a fő okozója a májbetegségeknek, melyeket hiányos autofágia mellett figyeltek meg (Rusten és Stenmark, 2010).

Az Nrf2 fehérje aktivitásának szabályozását mutató színes folyamatábra, ahol az egyes fehérjéket színes síkidomok jelölik.

4.16. ábra Az Nrf2 fehérje aktivitásának szabályozása p62 által

Nézzük meg most az Nrf2 transzkripciós faktort aktiváló rendszert egy kicsit más oldalról megvilágítva. Hiányos autofágia következtében a p62 szelektív turnovere korlátozott, ami súlyos májkárosodást okoz, melyet p62 pozitív zárványok képződése és a méregtelenítő enzimek aktiválódása kísér. Ez a fenotípus nagyon hasonlít a humán májbetegségek, mint az alkoholos májbetegség (alkoholos szteatohepatózis, alcoholic hepatitis) és a hepatocelluláris karcinóma, patológiájára. A betegségek molekuláris mechanizmusai és a patofiziológiás folyamatai ennek ellenére még nem ismertek. Az Nrf2 transzkripciós faktort, melynek a célgénjei antioxidáns fehérjéket és méregtelenítő enzimeket kódolnak, a p62 szabályozza. A p62 a Keap1 (az Nrf2-t felismerő ubiquitin ligáz egyik alegysége) Nrf2 kötőhelyéhez kapcsolódik. Így tehát, a p62 túltermelése vagy az autofágia defektusa miatt felszaporodó p62 molekulák versenyre kelnek az Nrf2-vel a Keap1-hez való kapcsolódásért (4.17. ábra).

Az Nrf2 fehérje aktivitásának szabályozását mutató színes folyamatábra, ahol az egyes fehérjéket színes síkidomok jelölik.

4.17. ábra Az Nrf2-Keap1 útvonal vázlatos ábrája. A klasszikus, oxidatív stressz által szabályozott útvonal az ábra baloldalán van feltüntetve. A p62 részvételével történő szabályozás a jobb oldalon látható. Az Nrf2 csukló és retesz mechanizmusa in vivo is működik.

Ez az Nrf2 stabilizálódását és az Nrf2 célgénjei transzkripciójának aktiválódását eredményezi. Mindez arra utal, hogy a p62 felhalmozódásával összefüggő patológiai folyamat az Nrf2 hiperaktivitását okozza és felvázolja a szelektív autofágia nem várt szerepét a védekező enzimek génjeinek transzkripció szabályozásában (Komatsu és mtsai., 2010).

Ellenőrző kérdések

  1. Mik az endoplazmatikus retikulummal társult lebontás (ERAD) lépései?

  2. Milyen mutációk és hogyan okozzák a Parkinson-kór kialakulását?

  3. Hogyan vesz részt a parkin E3 enzim az ER-hoz kapcsolt fehérje degradációban?

  4. Milyen szerkezeti doménjei és kölcsönható partnerei vannak a p62 fehérjének?

  5. Hogyan szabályozza az ubiquitin-proteaszóma rendszer az Nrf2-Keap1 útvonalat?

Irodalom

Chung, K. K., Dawson, V. L. és Dawson, T. M. (2001) The role of the ubiquitin-proteasomal pathway in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders. Trends Neurosci24, S7-14.

Ding, W. X. (2010) Role of autophagy in liver physiology and pathophysiology. World J Biol Chem1, 3-12.

Jin, Z., Li, Y., Pitti, R., Lawrence, D., Pham, V. C., Lill, J. R. és Ashkenazi, A. (2009) Cullin3-based polyubiquitination and p62-dependent aggregation of caspase-8 mediate extrinsic apoptosis signaling. Cell 137, 721-35.

Kirkin, V., Lamark, T., Sou, Y. S., Bjorkoy, G., Nunn, J. L., Bruun, J. A., Shvets, E., McEwan, D. G., Clausen, T. H., Wild, P. és mtsai. (2009) A role for NBR1 in autophagosomal degradation of ubiquitinated substrates. Mol Cell 33, 505-16.

Klionsky, D. J. (2006) Neurodegeneration: good riddance to bad rubbish. Nature 441, 819-20.

Komatsu, M., Kurokawa, H., Waguri, S., Taguchi, K., Kobayashi, A., Ichimura, Y., Sou, Y. S., Ueno, I., Sakamoto, A., Tong, K. I. és mtsai. (2010) The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1. Nat Cell Biol 12, 213-23.

Komatsu, M., Waguri, S., Koike, M., Sou, Y. S., Ueno, T., Hara, T., Mizushima, N., Iwata, J., Ezaki, J., Murata, S. és mtsai. (2007) Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient mice. Cell 131, 1149-63.

Lamark, T. és Johansen, T. (2010) Autophagy: links with the proteasome. Curr Opin Cell Biol22, 192-8.

Landles, C. és Bates, G. P. (2004) Huntingtin and the molecular pathogenesis of Huntington's disease. Fourth in molecular medicine review series. EMBO Rep5, 958-63.

Layfield, R., Alban, A., Mayer, R. J. és Lowe, J. (2001) The ubiquitin protein catabolic disorders. Neuropathol Appl Neurobiol27, 171-9.

Martinez-Vicente, M. és Cuervo, A. M. (2007) Autophagy and neurodegeneration: when the cleaning crew goes on strike. Lancet Neurology 6, 352-361.

Moscat, J. és Diaz-Meco, M. T. (2009) p62 at the crossroads of autophagy, apoptosis, and cancer. Cell 137, 1001-4.

Moscat, J., Diaz-Meco, M. T. és Wooten, M. W. (2007) Signal integration and diversification through the p62 scaffold protein. Trends Biochem Sci32, 95-100.

Nezis, I. P., Simonsen, A., Sagona, A. P., Finley, K., Gaumer, S., Contamine, D., Rusten, T. E., Stenmark, H. és Brech, A. (2008) Ref(2)P, the Drosophila melanogaster homologue of mammalian p62, is required for the formation of protein aggregates in adult brain. J Cell Biol 180, 1065-71.

Ross, C. A. és Pickart, C. M. (2004) The ubiquitin-proteasome pathway in Parkinson's disease and other neurodegenerative diseases. Trends In Cell Biology14, 703-711.

Rusten, T. E. és Stenmark, H. (2010) p62, an autophagy hero or culprit? Nat Cell Biol12, 207-9.

Tyedmers, J., Mogk, A. és Bukau, B. (2010) Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat Rev Mol Cell Biol11, 777-88.

Vembar, S. S. és Brodsky, J. L. (2008) One step at a time: endoplasmic reticulum-associated degradation. Nat Rev Mol Cell Biol9, 944-57.

Vila, M. és Przedborski, S. (2004) Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease. Nat Med10 Suppl, S58-62.

Yoshida, H. (2007) ER stress and diseases. FEBS J 274, 630-58.