5. Az ubiquitin-proteaszóma rendszer szerepe az apoptózis szabályozásában

Az apoptózis a programozott sejthalál egy fajtája, melynek során azért pusztulnak el a sejtek, hogy megakadályozzák a túlzott sejtosztódást, vagy csökkentsék a DNS károsodás hatását. A természetes sejtpusztulás nagyon fontos szerepet játszik a normális életfolyamatokban is, mint a magzati fejlődés és a szöveti állandóság. Az apoptózis szabályozásában bekövetkező hibák sok betegség kialakulásához járulnak hozzá, mint a rák, autoimmun betegségek és neurodegeneráció. Másrészről viszont az apoptózist irányító fehérjék új gyógyszerkutatási célpontokat jelentenek és a rák kezelésének új lehetőségeihez vezethetnek.

Az ubiquitin-proteaszóma rendszer a fő lizoszómán kívüli lebontó út, mely részt vesz a sejten belüli fehérjebontásban. A 26S proteaszóma egy multienzim komplex, mely a rosszul hajtogatott illetve felesleges fehérjéket bontja le. Megfordítva, a proteaszomális lebontó útvonal gátlása a nemkívánatos fehérjék felhalmozódásához és sejthalálhoz vezet. Mivel a ráksejtek sokkal gyorsabban osztódnak, mint a normál sejtek a fehérje átírási és lebontási sebességük is gyorsabb. Számos specifikus proteaszóma szubsztrát elengedhetetlenül szükséges a sejtciklus megállításához illetve az apoptózishoz. Ezen szubsztrátok lebontásának meghiúsítása proteaszomális gátlás révén új és egyedülálló megközelítése a daganatos betegségek kezelésének. Egy peptid bórsav vegyület, a bortezomib szelektív és reverzibilis proteaszóma gátlószer (5.1. ábra). Az amerikai FDA (Food and Drug Administration) és az Európai Gyógyszerértékelő Ügynökség (EMEA - European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) is engedélyezte használatát a frissen diagnosztizált, más citosztatikumra nem reagáló csontvelőrák (mielóma muliplex) kezelésében (Velcade).

A bortezomib térkitöltő modellje.

5.1. ábra A bortezomib (Velcade) térkitöltő modellje

A következőkben röviden tekintsük át az apoptózis azon folyamatait, melyek szabályozásában az ubiquitin-proteaszóma rendszer fontos szerepet játszik.

Apoptózis

Az apoptózis evolúciósan konzervált folyamat a sejt önmegsemmisítésére, mely sokféle sejten belüli és kívüli hatással beindítható. Amint a folyamat elindul, egy konzervált kaszkád rendszer viszi tovább és erősíti a jelet fehérje-fehérje kölcsönhatások útján. Végül cisztein proteázok egy különleges csoportja, melyeket kaszpázoknak hívunk (5.2. ábra), aktiválódik és sejten belüli célfehérjék széles spektrumát hasítja, úgymint DNS javító enzimeket, lamint és Mdm2-t (a p53 stabilitásának szabályozója), és ez végül a sejt pusztulásához vezet.

A különböző csoportok kaszpázait összehasonlító színes ábra, melyen egy fehérje egy szürkésbarna sáv és rajta a domének színes csíkokként vannak feltüntetve.

5.2. ábra Apoptotikus kaszpázok az emlősökben, muslicákban és fonálférgekben. Az iniciátor kaszpázokat lila, az effektor kaszpázokat vörös szín jelöli. A kaszpáz molekulát jelző sávok és a funkcionális részek csíkjai méretarányosan vannak feltüntetve. Rövidítések: DED, death-effector domain; CARD, caspase-recruitment domain.

A CED-3 (cell-death abnormality-3) az egyetlen kaszpáz a fonálféregben (Caenorhabditis elegans), így mind az iniciátor, mind az effektor kaszpázok szerepét betölti (5.2. és 5.4. ábra). Az első, láncon belüli, aktiváló hasítás helyét az ábrán fekete nyilak jelölik (a nagy, p20, és a kis, p10, alegység között). A p20 és p10-es alegységek együtt egy kaszpáz monomert alkotnak. Az egyéb hasításokat szürke nyilak mutatják. Ez utóbbiak a kaszpáz aktivitást módosítják és a kaszpázok apoptózis gátló (inhibitor of apoptosis - IAP) fehérjék valamint más fehérjék általi szabályozását befolyásolják. Más proenzimektől eltérően egy kaszpáz N-terminális prodoménjének eltávolítása nem szükséges az aktivitásához. Az iniciátor kaszpázok prodoménjei kivétel nélkül azonos fajta kölcsönható domének, mint például a kaszpáz verbuváló domén (CARD - caspase-recruitment domain) és a sejthalál végrehajtó domén (DED - death-effector domain). Az ábrán ugyancsak meg van jelölve a katalitikus árkot alkotó négy, felszíni hurok (L1-L4). A katalitikus cisztein oldalláncot piros vonal jelzi az L2-es hurok elején (Riedl és Shi, 2004) (5.2. ábra).

Sejtek, melyeket külső vagy belső ingerek programozott öngyilkosságra serkentenek, apoptózissal pusztulnak el. A folyamatot számos összetett fehérje szabályozza, melyeket két fő útvonalon különféle hatások aktiválnak.

Sejthalál receptor útvonal (külső)

A külső útvonalat egy sejtfelszíni halál receptor indítja be (5.3. ábra). Ez a jelzés nagyon fontos szerepet tölt be a transzformált illetve vírusfertőzött sejtek immunrendszer általi leleplezésében és a saját fehérjék ellen reaktív limfociták eltávolításában. Ennek következtében a rendszer hibája sok esetben rosszindulatú daganatot vagy autoimmunbetegséget okoz.

Az apoptózis színes folyamatábrája.

5.3. ábra Kaszpáz aktiválási útvonalak az apoptózis folyamán. Az ábrán látható rövidítések: APAF1, apoptotic protease activating factor; BAD, BCL-2 antagonist of cell death; BAK, BCL-2-antagonist/killer-1; BAX, BCL-2-associated X protein; BID, BH3-interacting domain death agonist; BIK, BCL-2-interacting killer; BIM, BCL-2 interacting mediator of cell death; BMF, BCL-2 modifying factor; HRK, harakiri (más néven death protein-5); NOXA, Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 (a noxa latinul károsodást jelent); PUMA, p53 upregulated modulator of apoptosis.

A kaszpáz aktiválás a külső útvonalon sejten kívüli halál ligandumok (FasL vagy TNFα - tumour necrosis factor-α) kötődését igényli a transzmembrán halál receptorokhoz (5.3. ábra). Ha a halál receptorok kapcsolatba lépnek a nekik megfelelő ligandummal, megindul a kapcsoló fehérjék (például a FADD - Fas-associated death domain protein) verbuválása. Ezek számos kaszpáz-8 molekulát vonzanak és kötnek meg, elősegítve ezzel a kaszpáz-8 önaktiválását. Az aktív kaszpáz-8 aztán hasítja és aktiválja a kaszpáz-3-at és 7-et és a folyamat a szubsztrát fehérjék bontásához, végül sejthalálhoz vezet (Taylor és mtsai., 2008).

Mitochondriális útvonal (belső)

A belső útvonal akkor aktiválódik, ha a mitochondriumokból kiszabadul a citokróm-c fehérje (5.3. ábra). Mindkét út egy végső közös szakasz felé tart, melyben egymást aktiváló kaszpáz enzimek lebontanak minden eléjük kerülő szabályozó vagy szerkezeti fehérjét. Ez aztán a sejt pusztulásához vezet.

A belső útvonalon összetett hatások, melyek sejt stresszt vagy károsodást váltanak ki, jellemzően a csak BH3 doménnel rendelkező fehérje családot aktiválják (Taylor és mtsai., 2008). A csak BH3 doménnel rendelkező fehérje család tagjai útvonal specifikus érzékelőként reagálnak a különböző hatásokra és aztán eltérő módon szabályozódnak. Aktiválódásuk egy bizonyos határ felett túlnő az anti-apoptotikus Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) család tagjainak gátló hatásán és elősegíti a Bak–Bax oligomerek összeszerelődését a mitochondriumok külső membránjában. Ezek az oligomerek teszik lehetővé a membránok közötti térből a fehérjék, mint például a citokróm-c, kijutását a citoplazmába. A kijutott citokróm-c elindítja az apoptoszómák összeszerelődését. Az apoptoszóma az apoptotikus proteáz aktiváló faktor-1 (APAF1) 7 molekuláját és ugyanannyi kaszpáz-9 homodimert tartalmaz. Ebben az aktív kaszpáz-9 elindítja a kaszpáz aktiválási kaszkádot (5.3. ábra).

Néhány esetben előfordul, hogy a külső sejthalál jelzések áthallatszanak a belső útvonalra a csak BH3 doménnel rendelkező fehérje családba tartozó BID (BH3-interacting domain death agonist) fehérje kaszpáz-8 általi hasítása miatt. A hasított BID (tBID - truncated BID) elősegíti a mitochondriális citokróm-c kijutását és az apoptoszóma összeszerelődését (5.3. ábra).

Konzervált apoptotikus útvonalak

A kaszpáz-9 az emlősökben és a Dronc a muslicában (Drosophila melanogaster) iniciátor kaszpázok, míg a kaszpáz-3 és 7 az emlősökben és a Drice a muslicában az effektor kaszpázok osztályába tartozik (Riedl és Shi, 2004). A CED-3 a fonálféregben (Caenorhabditis elegans) iniciátor és effektor kaszpázként is működik. Az apoptózis gátló (IAP - inhibitor of apoptosis) fehérjék a kaszpázok negatív szabályozásával elnyomják az apoptózis folyamatát. Emellett az IAP antagonisták, a SMAC (second mitochondria-derived activator of caspases)/DIABLO (direct IAP-binding protein with low pI) az emlősökben és az RHG fehérjék (Reaper, Hid, Grim és Sickle) a muslicában az IAP fehérjék közvetítette kaszpáz gátlást függesztik fel (5.4. ábra).

A különböző csoportokban zajló apoptózis összehasonlító színes folyamatábrája.

5.4. ábra Konzervált apoptotikus útvonalak. A kaszpázok és a kaszpáz regulátorok funkcionális homológjai a különböző csoportokban azonos színnel vannak jelölve. Rövidítések: APAF1, apoptotic-protease-activating factor-1; Cyt c, citokróm-c.

Ubiquitinilálódó célpontok az apoptózis útvonalán

Az 5.5. ábra mutatja, hogy az apoptózis mindkét útvonalán előfordulnak olyan szabályozó fehérjék, melyeket az ubiquitin-proteaszóma rendszer bont le (Lee és Peter, 2003).

Az apoptózis fekete-fehér folyamatábrája.

5.5. ábra Ubiquitinilálódó célpontok az apoptózis útvonalán

A p53 fehérje

  • rövid fél-életidejű fehérje, kis mennyiségben van jelen a sejtmagban

  • sejtet érő stressz hatására stabilizálódik

    • DNS károsodás (vegyi vagy sugár)

    • hypoxia

    • onkogén aktiválódás

  • sejtválasz

    • sejtciklus leállás

    • DNS javítás

    • differenciálódás, öregedés, apoptózis

  • emberi tumorok 50%-ban a p53 mutáns

A p53 tumor szupresszor az egyik legismertebb pro-apoptotikus fehérje, ami a transzkripció szintjén hat. A p53 elfogadottan a genom őrzője, amely a sejtosztódás megállításával vagy apoptózis beindításával megakadályozza a mutáció továbbadását és ennek következtében a rák kialakulását (karcinogenezist). Álladóan alacsony koncentrációban van a sejtben, mert folyamatosan ubiquitinilálódik és a proteaszóma lebontja. Belső stressz hatásra, mint például vegyszer vagy sugárzás okozta DNS károsodás, oxigén hiány, onkogén aktiválódás, a p53 ubiquitinilálása gátlódik, ami a felszaporodásához vezet. Ez indukálja a sejtosztódás leállítását és az apoptózist. Az emberi tumoroknak körülbelül felében a p53 gén mutációkat hordoz vagy a rendszer hibás és a p53 lebontását segíti.

A p53 egyaránt indukálja a külső és a belső apoptotikus útvonalakon ható fehérjék kifejeződését és specifikusan blokkolja sejthalál gátló gének átíródását (5.6. ábra).

A p53 fehérje aktiválódásának színes folyamatábrája, ahol a p53-at piros kör, az Mdm2-t kék kör, és az ubiquitint sárga kör jelképezi.

5.6. ábra A p53 és az apoptózis. Az ábrán látható rövidítések: Bcl-2, B-cell lymphoma 2; APAF1, Apoptotic protease-activating-factor 1; Bax, Bcl-2 associated X protein; NOXA, Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1; DR5, death receptor 5; Pidd, p53 protein induced, with death domain; Mdm2, Murine double minute 2.

Leírták már a p53 a transzkripció szabályozásától eltérő, további feladatait is. Ilyen például a sejthalál receptorok, mint a Fas/CD95 (cluster of differentiation 95) Golgi-apparátusból a sejtfelszínre történő áthelyeződésének indukálása vagy a mitochondriumokkal való közvetlen asszociáció. A p53 legfontosabb regulátora az Mdm2 (Murine double minute 2), melynek átíródása viszont maga is a p53 szabályozása alatt áll. Az Mdm2 a p53-hoz köt, ubiquitinilálja és a magból kijuttatva proteaszomális lebontásra irányítja (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Az Mdm2 fehérje

Az Mdm2 fehérje szerkezetében több jellegzetes domént is elkülöníthetünk (5.7. ábra). A p53 kötő doménjét (17–125 aminosav) átéri a SWIB domén (26–108 aminosav), mely a SWI/SNF fehérje család konzervált régiója. A savas régió egy aszparaginsavban és glutaminsavban gazdag szakasz. A RanBP2-típusú és RING-finger domének cink-ionokat fognak közre. A gankyrin a RING-finger domén mellett N-terminális irányban köt az Mdm2-höz (411–438 aminosav) (Dawson és mtsai., 2006).

Az Mdm2 fehérjét bemutató ábra, melyen a fehérje egy fekete csík és rajta a domének színes sávokként vannak feltüntetve.

5.7. ábra Az Mdm2 ubiquitin ligáz funkcionális doménjei. Rövidítések: NES, nuclear export signal; NLS, nuclear localization signal.

Az ARF fehérje

Az ARF fehérje felfedezése összekapcsolódik a p16INK4a felfedezésével, sőt innen ered. A p16INK4a egy 16 kDa tömegű humán fehérje, mely megköti és gátolja a CDK4-et (INK4 - inhibitor of CDK4). A p16 eredeti klónozása után különös jelenségre figyeltek fel: a p16 lokusz nagyon magas mutációs frekvenciát mutatott egyrészt tumorból származó immortalizált sejt vonalakban, másrészt különböző elsődleges tumorokban. Ma már világos, hogy a lokusz gyakori megváltozása a különös genetikai szerkezetéből fakad, mely egy másik, rejtett gént is kódol (5.8. ábra).

Az ARF fehérje génjének exonjait bemutató ábra, melyen a p16 fehérje exonjai fekete csíkokként és az ARF fehérje exonjai piros csíkokként vannak feltüntetve.

5.8. ábra A p16INK4 (INK4 - inhibitor of CDK4, fekete) és az p14ARF (alternative reading frame, piros) fehérjéket kódoló lokusz exonjai. A csillag a stop kodon jele.

Ez a gén az ARF (alternative reading frame), melynek transzkripciója egy külön promoterről indul egy különálló első exonnal (exon 1β), ami a p16 exon 1α-hoz képest felfelé helyezkedik el. Bár az exon 2 és 3 területén átfed a p16 és az ARF kódoló szekvenciája az exon 1β által kódolt részletnek megvan a saját transzláció indító AUG kodonja. Ezáltal egy teljesen független fehérje keletkezik egy alternatív leolvasási keret szerint, emberben 14kDa molekulatömegű, 132 aminosavból álló (p14ARF), egérben 19kDa molekulatömegű, 169 aminosavból álló (p19ARF) fehérje (Zhang és Xiong, 2001).

Mint ahogy várható, egy olyan fehérje mellé, amelynek az a feladata, hogy a „genom védelmezőjét” elpusztítsa, sokféle biztonsági mechanizmus van beépítve, hogy ne tudjon elszabadulni (5.9. ábra).

Az Mdm2 együttműködő partnereit bemutató ábra, melyen az Mdm2 fehérje lila téglalapként, az ubiquitin piros körként, az E2-es enzim barna téglalapként van feltüntetve.

5.9. ábra Az Mdm2 működését szabályozó partnermolekulák

  1. Az Mdm2 belső RING-finger-függő ubiquitin ligáz (E3) aktivitása van, így ubiquitinilálni tudja a p53-at, sőt saját magát is.

  2. A p53 foszforilációja blokkolja az Mdm2-vel való interakciót.

  3. Egy Mdm2-höz kötő fehérje, az ARF (5.8. ábra) a RING-finger doménje felett kapcsolódik hozzá és egy addig rejtett, a sejtmagvacskába irányító jelet fed fel az Mdm2 RING-finger doménjével egy vonalban (5.7. ábra). Ez elkülöníti az Mdm2-t a p53-tól, megakadályozva a p53 Mdm2 közvetített lebontását.

  4. Ehhez hasonlóan az Mdm2 gátolható egy rokon RING-finger fehérjével, az MdmX-szel történő dimerizációval (Marine és Jochemsen, 2005).

  5. Mindazonáltal, arra is van bizonyíték, hogy a SUMO-1 pozitívan szabályozza az Mdm2-t. A SUMO-1 ubiquitin-szerű fehérje ugyanahhoz a lizin oldallánchoz tud kapcsolódni az Mdm2-n, amihez az ubiquitin. Így kötődése megnöveli a p53 ubiquitinilációját, miközben lecsökkenti az Mdm2 ön-ubiquitinilálását.

Az Mdm2 a RING-finger típusú E3-as enzimek szubsztrát specificitását is jól mutatja. A p53 család egy másik tagja a p73 is kötődik az Mdm2-höz, de ez az interakció stabilizálja, és nem degradálódásra készteti. Ha kísérletileg az Mdm2 RING-finger doménjét egy eltérő RING-finger doménnel helyettesítjük, akkor ez visszaállítja a hibrid molekula ön-ubiquitinilálódását és a proteaszómába célzottságát, de nem ubiquitinilálja a p53-at és nem irányítja lebontásra (Weissman, 2001).

A p53 Mdm2 által történő szabályozásának modelljei

Mdm2-függő p53 export. Az első modell szerint az Mdm2 hozzáköt a p53-hoz a sejtmagban és kiviszi a p53-at a citoplazmába (5.10. ábra). Ez a modell arra a megfigyelésre épül, hogy az Mdm2 egy belső magi export szignál (NES) segítségével kerül ki a magból a citoplazmába. Ennek mutációja megszünteti az Mdm2 nukleáris exportját és a p53 lebontó képességét is. Megerősíti ezt a modellt, hogy az Mdm2 magi lokalizációs jelének (NLS) mutációja kizárja a magba jutásból és ugyancsak megakadályozza a p53 degradálásában. Különböző sejtvonalak LMB-vel történő kezelése megnövelte a p53 fél-életidejét és egyensúlyi mennyiségét. Az LMB kovalens kötést alakít ki a CRM1 (exportin 1) egyik konzervatív cisztein oldalláncával, ami a fehérjék magi export jelének evolúciósan konzervált receptora és ezáltal megszünteti a CRM1-NES kötődést. Az LBM kezelés meggátolta az E6-E6AP közvetítette p53 lebontást a human papillomavírus fertőzött sejtvonalakban, megmutatva, hogy a p53 kikerülése a magból szükséges bármelyik ubiquitin ligáz útján történő lebontáshoz, de a folyamat nem teljesen Mdm2-függő (Zhang és Xiong, 2001).

A p53 Mdm2 közvetített lebontási modelljeit bemutató ábra, melyen az Mdm2 fehérje fekete ellipszisként, a p53 piros ellipszisként van feltüntetve.

5.10. ábra A p53 Mdm2 közvetített lebontási modelljei normális sejtműködés esetén. SM, sejtmag; C, citoplazma.

Mdm2 független, önálló p53 export. A második modell szerint a p53 maga is tartalmaz egy működőképes magi export jelet (NES), ami lehetővé teszi számára a magból való kijutást (5.10. ábra). A magba injektálás után a fluoreszcensen jelölt p53 egy energiafüggő útvonalon perceken belül kikerült a magból, az NLS-sel jelölt humán szérum albumin azonban nem. A humán p53-ban azonosítottak egy leucin gazdag NES-t, mely a 339-352 aminosavak között húzódik. Ennek mutációja megakadályozta a p53 exportját a magból. A p53 NES szekvenciáját fuzionáltatták egy egyébként magban lokalizáló BSA fehérjéhez (p53 339–352-BSA), ami a fehérje citoplazmatikus felhalmozódását eredményezte LMB szenzitív módon. Az Mdm2 független p53 magi export modellt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy egy p53-GFP fúziós fehérje egyaránt előfordult a magban és a citoplazmában miután kifejeztették a p53 2/2-MDM2 2/2 kettősen hiányos MEF sejtekben, míg a p53 NES szignálban történt mutációk a p53-GFP kizárólag magi elhelyezkedését eredményezték. Mivel a NES szignál a p53 tetramerizációs doménjében található, feltételezték, hogy a p53 szabályozott tetramerizációja eltakarja a NES szignált és ezzel biztosítja a p53 visszatartását DNS kötő formájában a magban.

Ubiquitiniláció-függő p53 export. A harmadik modell szerint az Mdm2 ubiquitinilálja a p53-at a sejtmagban és a p53 multiubiquin lánca segíti a magi exportot és az ezt követő citoplazmatikus degradációt (5.10. ábra). Ez a modell olyan megfigyelések alapján készült, melyek szerint az Mdm2 és a p53-GFP fúziós fehérje együttes kifejeztetése a fúziós fehérje citoplazmatikus felhalmozódásával, sőt magi kizáródásával járt. A p53-GFP Mdm2 okozta kizáródása a magból megszűnt az Mdm2 RING-finger doménjének mutációjával, ami inaktiválta az ubiquitin ligáz aktivitását vagy az E1 ubiquitin aktiváló enzim mutációjának hatására. A modellt igazolja, hogy a magi export blokkolása LMB kezeléssel az ubiquitinilált p53 felhalmozódását eredményezte a magi frakcióban. Ezenkívül a p53 C-terminálisán levő NES-ben okozott mutációk meggátolták a p53 magi exportját, de az ubiquitinilációt nem. Mindez azt mutatja, hogy a p53 ubiquitinilációja a magban zajlik még a citoplazmába való export előtt (Zhang és Xiong, 2001).

Az ARF p53 stabilizálásában betöltött szerepének három modellje. Függetlenül attól, hogy a magi p53 az Mdm2 segítségével, vagy magától, esetleg az Mdm2 közvetítette ubiquitiniláció útján kerül ki a sejtmagból a citoplazmába, a p53 magi exportjának blokkolása vagy az Mdm2-p53 komplexum szétszedése a p53 stabilizációját okozza. Az ARF fehérje gátolja a p53 Mdm2 közvetítette degradációját, legalábbis részben, a p53 és Mdm2 magi exportjának megakadályozásával. Jelenleg három modell próbálja a p53 Mdm2 közvetítette magi export ARF általi gátlásának molekuláris mechanizmusát megmagyarázni:

  1. az Mdm2 elkülönítése a sejtmagvacskába;

  2. ARF-Mdm2-p53 hármas komplexum kialakítása a nukleoplazmában;

  3. az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitásának gátlása a sejtmagban.

Mindegyik modellnek van kísérletes alapja, de egyik sem tudja megnyugtatóan integrálni az összes megfigyelést. A modelleket az 5.11. ábrán vetjük össze.

Az ARF közvetített Mdm2 gátlás és p53 aktiváció modelljeit bemutató ábra, melyen az Mdm2 fehérje és az ARF fekete ellipszisekként, a p53 zöld ellipszisként van feltüntetve.

5.11. ábra Az ARF közvetített Mdm2 gátlás és p53 aktiváció három modellje onkogén hatás esetén. SM, sejtmag; C, citoplazma; sm, sejtmagvacska.

Az Mdm2 elkülönítése a sejtmagvacskába. Az első modell szerint az ARF az Mdm2-t a nukleoplazmából a magvacskába viszi, felszabadítva a p53-at az Mdm2 gátlása alól és ezzel lehetővé téve felszaporodását a sejtmagban (5.11. ábra). Ez a modell két megfigyelésen alapszik: az Mdm2 fehérje molekulák egy része, nem az összes, a nukleóluszokban található Mdm2-t és egér ARF-et kifejező plazmidokkal transzfektált HeLa sejtekben, egér ARF-et kódoló plazmiddal mikroinjektált egér embrionális fibroblaszt (MEF) sejtekben, és öregedő MEF sejtekben, melyekben mind az Mdm2, mind az ARF szint megemelkedik. A másik adatsor szerint az egér ARF mutáns (ARF D26-37) nem tud a magvacskába kerülni, ugyan megtartja az Mdm2 kötő aktivitását, mégsem tudja az Mdm2-t a magvacskába vinni, így a p53 stabilizáló képessége is csökken.

ARF-Mdm2-p53 hármas komplexum. A második modell az mutatja, hogy az ARF áthelyeződik az Mdm2 hatására a sejtmagvacskából a nukleoplazmába, és itt egy háromtagú komplexumot alakít ki az Mdm2-vel és a p53-mal, ezzel megakadályozva mind az Mdm2, mind a p53 magi exportját (5.11. ábra). Ha csak az ARF és a p53 fejeződik ki együtt, az Mdm2 hiányában sem az ARF sejtmagvacskába kerülése, sem a p53 eloszlása a nukleoplazma területén nem változik, egybevágóan azzal a megfigyeléssel, hogy az ARF az Mdm2 gátlásával lép kölcsönhatásba a p53-mal. Az Mdm2 kifejeztetése HeLa sejtekben, melyek nagy mennyiségben termelték az ARF-et a p53 működésének szünetelése miatt, az ARF átrendeződését eredményezte az egész nukleoplazmában. Ha mindhárom fehérjét egyszerre kifejeztették, az ARF, az Mdm2, és a p53 különálló magi testekbe került a nukleoplazmában. Az ARF exon 1β által kódolt Mdm2 kötő domén kivágódása vagy a magba vagy sejtmagvacskába irányító jelek mutációja a humán ARF exon 2 régiójában megszüntetik az ARF azon képességét, hogy magi testeket formáljon és csökkentik a p53 stabilizáló aktivitását. Ezek a tények összekapcsolják a hármas komplexum illetve magi testek formálását és az ARF közvetített p53 stabilizációt. Az E2F1, az ARF gén aktivátorának expressziója normális vagy Mdm2 gén amplifikált sejtekben az ARF felhalmozódását okozta a nukleoplazmában. A Saos-2 sejtekben azonban, melyek p53 hiányosak és rendkívül alacsony az Mdm2 szintjük, kizárólag a sejtmagvacskában lokalizált az ARF. Mindez élettani bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az Mdm2 képes megváltoztatni az ARF lokalizációját és képes magi testek kialakulását kiváltani ARF és p53 jelenlétében.

A p53 sejtmagi ubiquitinilálásának gátlása. A harmadik modell szerint az Mdm2 a p53-at a sejtmagban ubiquitinilálja és ez a jel elősegíti, sőt szükséges a p53 magi exportjához és az ezt követő citoplazmatikus lebontáshoz. Mivel az ARF-fel való kapcsolódás gátolja az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitását, az ARF megakadályozhatja a p53 magból történő kijutását a p53 Mdm2 közvetítette magi ubiquitinilálásának gátlásával (5.11. ábra). Ez a modell azokra a kísérletekre épül, melyek az Mdm2 és a p53-GFP együttes kifejeződését mutatják, nem pedig egyedül a p53-GFP-jét, és ez a p53-GFP citoplazmatikus felhalmozódását eredményezi vagy egyes sejtekben a magból való kizárását. Ezt a megfigyelést az Mdm2 közvetített p53 magi export bizonyítékának tekintették. A p53-GFP áthelyeződését megszüntette az Mdm2 RING-finger doménjének egy mutációja (HDM2 C464A), mely inaktiválta az ubiquitin ligáz aktivitását, illetve az ubiquitin aktiváló enzim (E1) egy hőmérséklet-szenzitív mutációja. Összhangban ezzel a modellel, a magi export gátlása LMB kezeléssel jelentős mennyiségű ubiquitinilált p53 felhalmozódásához vezetett a magfrakcióban a citoplazma frakcióhoz viszonyítva, ami arra utal, hogy az ubiquitiniláció a magban, a citoplazmába átkerülés előtt történhet (Zhang és Xiong, 2001).

A p53 a gyógyításban

Az a megfigyelés, hogy a p53 a legtöbb rákbetegségben hibás, nem működik, igen alkalmas célponttá teszi új gyógymódok kidolgozásához. Mivel a p53 indukálhatja a tumorsejtek pusztulását, a legintenzívebben kutatott lehetőség, hogy olyan kis molekulát találjanak, mely egyes rák fajtákban újra aktiválja a p53-at. Olyan rákok esetén, ahol megmarad a vad típusú p53, de olyan változtatások történtek, melyek megakadályozzák a p53 aktiválódását, jó pár az Mdm2-t célba vevő vegyületet leírtak. Ezek közé tartozik a Nutlin-3, amelyik blokkolja a p53 és az Mdm2 kapcsolódását, és a HLI98 amelyik közvetlenül blokkolja az Mdm2 ubiquitin ligáz aktivitását. Ezek a vegyületek természetesen a normális és a tumor sejtekben egyaránt aktiválják a p53-at, de az a megfigyelés, hogy a rákos sejtek sokkal érzékenyebbek az apoptózis stimulálására, mint az egészséges sejtek, megcsillantja a reményt, hogy ezek a vegyületek elég szelektíven pusztítják a sejteket ahhoz, hogy használható rákellenes szerek váljanak belőlük.

Azok a rákbetegségek, melyekben mutáns a p53, más megközelítést igényelnek. Már leírtak olyan vegyületeket, melyek segítenek egyes ilyen mutáns fehérjéknek annyira újrahajtogatódni, hogy legalább a normális funkcióik egy részét visszanyerjék. A legtöbb esetben csak a tumorsejtek fejezik ki a mutáns fehérjét, így valószínű, hogy a gyógyszermolekulák erősen szelektívek lesznek, és alacsony toxicitást fejtenek ki a normális szövetekre. Erre az esetre egy másik érdekes megközelítés, hogy azt próbálják szelektíven kihasználni , hogy tumorsejtekben nincs p53 és olyan vegyületeket találni, melyek p53 hiányában pusztítják el a sejtet (úgynevezett szintetikus letalitás). Bár a p53 aktiválása is jó ötlet, egyre nagyobb az érdeklődés a p53 gátlása iránt. A nyilvánvaló célja ennek a megközelítésnek, hogy megvédjék a normális sejteket a kemoterápia mellékhatásaitól. Általánosabban az inhibitorok a p53 más káros hatásait is kiküszöbölik.

A p53 útvonalon további gyógyszercélzási hely is adódik, a legalkalmasabb a p53 fő ubiquitin ligáza, az Mdm2 (5.12. ábra).

A proteaszóma gátlás a p53-ra gyakorolt hatását bemutató színes folyamatábra, melyen a p53-at kék körök, az ubiquitint világosbarna pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

5.12. ábra A p53 aktiválása a proteaszóma gátlásával a rákgyógyításban

Az Mdm2 kifejeződését a p53 maga serkenti, ezzel egy negatív visszacsatolású szabályozó kört alakít ki. Ebből logikusan következik, hogy az Mdm2-p53 kölcsönhatás illetve a p53 ubiquitinilációjának gátlása a p53 tumor elnyomó aktivitásának erősödéséhez vezet. Az Mdm2 gátlása nemcsak a hibátlan, vad típusú p53-at hordozó tumorok esetén lehet kedvező hatású, hanem az Mdm2 más rákellenes fehérjéket bontó szerepét is megakadályozza. Ehhez hasonlóan alkalmazhatunk proteaszóma gátlószereket az olyan ráktípusok ellen is, melyek túl sok Mdm2-t fejeznek ki és ezáltal inaktiválják a p53-at (Adams, 2004).

Most még nehéz lenne megmondani a pontos okát annak, hogy egyes sejtek miért érzékenyek a proteaszóma gátlásra és mások miért nem. Egy lehetséges magyarázat szerint sok tumor gyors osztódási üteme függővé teszi ezeket a sejteket a proteaszómától, mely eltávolítja a megnövekedett számú sérült vagy rosszul hajtogatott fehérjét. Egy másik, még elegánsabb, mechanizmus az lehet, hogy a proteaszóma aktivitásának gátlása megfordíthatja vagy áthidalhatja a mutáns sejtciklus vagy apoptotikus ellenőrző pontokat, melyek a rákos fenotípus kialakulásában vagy fenntartásában szerepet játszanak. Ezért van tehát szükség a komplex ubiquitinilációs rendszer minél jobb megismerésére, mert új rákgyógyítási eljárásokhoz vezethet, melyek felcsillantják a reményt jobb és tökéletesebb gyógyítási eredmények elérésére a rosszindulatú és más daganatos betegségek kezelésére.

Az IAP fehérjecsalád

Minthogy a kaszpázok által közvetített fehérjebontás irreverzibilis, pontosan szabályozni kell mennyiségüket és aktivitásukat. Az első ellenőrzőpont a kaszpáz útvonalon a proenzim aktiválás, a második ezzel egyenrangúan fontos, a kész, aktív kaszpáz közvetlen gátlása. Emlősökben és rovarokban ezeket a szabályozó folyamatokat az IAP (inhibitor of apoptosis protein) fehérjecsalád irányítja, mely a kaszpázok okozta veszély ellen az utolsó védelmi vonal. Az apoptózis gátló fehérjék, mint azt nevük is mutatja, védelmet nyújtanak a sejteknek az önpusztítás ellen (5.13. ábra).

A különböző csoportok IAP fehérjéit összehasonlító színes ábra, melyen egy-egy fehérje egy szürkésbarna sáv és rajta a domének színes csíkokként vannak feltüntetve.

5.13. ábra Az IAP fehérjecsalád tagjai különböző fajokban. Rövidítések: OpIAP, Orgyia pseudotsugata nuclear polyhedrosis virus IAP; BIR - baculovirus IAP repeat; DIAP, Drosophila melanogaster IAP; BIRC, BIR-domain-containing protein; XIAP, X-chromosome -linked IAP; cIAP, cellular IAP; MLIAP, melanoma IAP; BRUCE, BIR-repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme

Az IAP fehérjéket eredetileg bakulovírusban azonosították, ugyanis képesek a fertőzött gazdasejt védekező apoptózisát elnyomni és ezzel a vírusnak több időt biztosítanak a replikációra. A bakulovírus IAP homológjait azóta megtalálták eukarióta szervezetekben is, pl. hasadó élesztőben (Schizosaccharomyces pombe) sütő élesztőben (Saccharomyces cerevisiae), ecetmuslicában (Drosophila melanogaster), emlősökben, egérben és emberben, valamint utóbb már növényekben is. Az IAP család tagjai pro-apoptotikus fehérjék inaktiválásával és lebontásával gátolják az apoptózist. Az apoptózis szabályozó molekulák egyetlen olyan ismert csoportját alkotják, melynek van E3 ligáz aktivitása is. Tagsági követelmények ennél a családnál: egy vagy több jellegzetes bakulovirális ismétlődő motívum (BIR - baculovirus IAP repeat) megléte és az apoptózis leállításának képessége.

A Bcl-2 család fehérjéivel ellentétben, melyek csak a mitochondriális apoptózist gátolják, az IAP-k a külső és belső útvonalat is képesek blokkolni (5.3. ábra). A BIR motívumra azért van szükség, mert ezáltal képesek olyan molekulákhoz kötődni (pl. Smac/DIABLO fehérjecsalád), melyek működésüket szabályozzák, illetve így tudnak kaszpázokhoz kapcsolódni és reverzibilisen gátolni őket. Mindezek mellett sok IAP molekulának van egy karboxiterminális motívuma, a RING-finger domén, ami ubiquitin ligázként (E3) működik vagy egy ubiquitin konjugáló (UBC) motívum, mely az ubiquitin átadásában vesz részt (5.13. ábra). A BIR közvetített szabályozás és inaktiválás és a RING közvetített fehérjebontás kombinációja központi szereppel bír az IAP család pro- és anti-apoptotikus döntéshozatalában (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Az IAP-k C-terminális részlete funkcionálisan kapcsolódik az ubiquitin-proteaszóma rendszer közvetítette fehérjebontáshoz, mert itt egy RING-finger domént tartalmaznak. Apoptotikus stimulus hatására egyes IAP-k auto-ubiquitinilálódnak a RING-finger doménjük segítségével és a proteaszóma lebontja őket. Az XIAP az aktivált kaszpáz-3 ubiquitin ligázaként működhet, ubiquitinilálhatja és elősegítheti a proteaszomális lebontását. Ha szabályozó molekulák kapcsolódnak az IAP-k N-terminális végéhez, megakadályozzák a kaszpázokhoz történő kötődést és elősegítik az auto-ubiquitinilálásukat és lebomlásukat.

Egy egyszerű modellen nézzük meg most, hogy hogyan lép kölcsönhatásba az emlős XIAP (X-chromosome-linked IAP) az aktivált kaszpáz-3-mal és kaszpáz-9-cel. Az IAP fehérjék antagonista molekulái, melyek egy IAP kötőhelyet (IBM - IAP-binding motif) tartalmaznak, gátolják a kaszpázok és az IAP közötti kapcsolatot, azzal, hogy az IAP BIR doménjén levő résbe kötődnek (5.14. ábra).

A XIAP kölcsönható partnereit bemutató színes ábra, melyen a doméneket, az enzimeket és a szubsztrátokat színes téglalapok ábrázolják.

5.14. ábra A XIAP (X-chromosome-linked IAP) apoptózis gátló fehérje kaszpáz és antagonista kötése. A csillag az aktivált kaszpáz-3-at és kaszpáz-9-et jelzi. Rövidítések: IBM, IAP-binding motif; BIR, baculoviral IAP repeat.

Az IAP antagonisták közvetlenül is versengenek: a kaszpáz-9 IBM részéhez történő kapcsolódással megakadályozzák, hogy az IAP gátolja a kaszpáz-9-et. Egy közelmúltban történt megfigyelés szerint a BIR2 domén árkába kapcsolódó IAP antagonisták közvetlenül is versenghetnek az aktivált kaszpáz-3 és -7 kötéséért (Vaux és Silke, 2005).

Az IAP fehérjék sokrétű szerepe

Emlősökben az X kromoszómához kötött apoptózis gátló fehérje (XIAP), a cIAP1, és a cIAP2 közvetlenül tudnak kötődni az aktív kaszpázokhoz és gátolják aktivitásukat (5.15. ábra). Ezen túl kölcsönhatásba léphetnek a prokaszpáz-9-cel és megakadályozhatják apoptotikus jelek hatására történő aktiválódását (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Az XIAP és cIAP1 kaszpáz gátlását bemutató színes folyamatábra, melyen az enzimeket és a szubsztrátokat színes körök és téglalapok ábrázolják.

5.15. ábra Az IAP fehérjék képesek gátolni akár az iniciátor, akár az effektor kaszpázok aktiválódását vagy aktivitását és ezzel a sejt túlélését segítik elő. (IAP, inhibitor of apoptosis protein; cIAP, cellular IAP; XIAP, X-chromosome -linked IAP)

A XIAP és cIAP2 RING-finger fehérjékről kimutatták, hogy elősegítik az aktiválódott effektor kaszpázok ubiquitinilálását (5.16. ábra). A XIAP E3 aktivitása a kaszpáz-3-at és 7-et degradációra irányítja, ezzel is erősítve az apoptózis gátló hatását. A XIAP ubiquitin ligáz aktivitásához hasonlóan a BIR ismétlődő szekvenciát hordozó ubiquitin konjugáló enzim (BRUCE - BIR-repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) is képes ubiquitin láncot juttatni a kaszpázokra (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Az XIAP és cIAP1 kaszpáz ubiquitinilációját bemutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint narancssárga pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes körök és téglalapok ábrázolják.

5.16. ábra Ha az IAP fehérjék az ubiquitin ligáz (RING-finger) vagy ubiquitin konjugáló (E2) enzim aktivitásuk révén ubiquitinilálják a kaszpázokat, azokat a proteaszóma lebontja, és a sejt túlél. (IAP, inhibitor of apoptosis protein; cIAP, cellular IAP; XIAP, X-chromosome -linked IAP)

A fenti folyamatok gerinctelenekben is hasonlóan játszódnak le. Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) IAP fehérjéje, a DIAP1 hozzá tud kötni a még nem aktivált DRONC-hoz illetve megköti és gátolja a DARK által már aktivált DRONC-ot (5.17. ábra).

A DIAP kölcsönható partnereit bemutató színes ábra, melyen az ubiquitint szürke pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

5.17. ábra A DIAP gátló hatásai az apoptózis folyamtára és az antagonisták Drosophilában. A csillag a kaszpáz aktivált formáját jelöli.

Az ecetmuslica IAP antagonistái (HID, Grim, Reaper és Jafrac2) különböző mértékben képesek az IAP fehérjék és a kaszpázok közti kapcsolódást megakadályozni. A Grim és a Reaper a DIAP1 mindkét bacolovírus IAP ismétlődő doménjéhez (BIR1 és BIR2) kötve a DRONC/DCP1/DRICE és a DIAP1 közti interakciót gátolja. A HID és a Jafrac2 a DIAP1 BIR2 doménjéhez kötve akadályozza a DIAP1-et a DRONC megkötésében és inaktiválásában. A DIAP1 RING-finger doménjéhez nagyon sokféle E2-es enzim hozzá tud kapcsolódni (Vaux és Silke, 2005).

Emlős T sejtekben apoptotikus stimulus hatására a XIAP és cIAP1 ubiquitin ligázok (E3) önmagukat ubiquitinilálják, majd a proteaszóma lebontja őket (5.18. ábra). Az IAP-k degradációja szükséges a T sejtek pusztulásához (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Az XIAP és cIAP1 autoubiquitinilációját bemutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint narancssárga pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes körök ábrázolják.

5.18. ábra Apoptotikus stimulus hatására a XIAP és cIAP1 ubiquitin ligázok (E3) vagy a BRUCE (E2) önmagukat ubiquitinilálják, majd a proteaszóma lebontja őket, így a kaszpázokat nem gátolják, a sejthalál bekövetkezik (IAP, inhibitor of apoptosis protein; cIAP, cellular IAP; XIAP, X-chromosome -linked IAP)

Az emlős T sejtekhez hasonlóan, Drosophilában a Reaper és a HID (és valószínűleg a Grim is) képesek a DIAP1 degradációjának elősegítésére UBCD1-függő módon (5.19. ábra).

A DIAP kölcsönható partnereit bemutató színes ábra, melyen az ubiquitint szürke pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

5.19. ábra A DIAP kölcsönható partnerei Drosophilában

A Morgue, egy ubiquitin konjugáló enzim változat (UEV - ubiquitin E2 variant), szintén kölcsönhatásba lép a DIAP1-gyel, bár egyelőre a kapcsolódás funkciója nem ismert. Más esetben a HID, Grim vagy Reaper szintén ubiquitinilálódhatnak a DIAP1 által és proteaszomális lebontásra kerülhetnek. Az aktuális körülmények alapján dől el, hogy a két ellentétes hatású ubiquitiniláló folyamat közül melyik fog végbemenni (Vaux és Silke, 2005).

A Bcl-2 fehérjecsalád

A Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) családnak apoptózis elősegítő, pro-apoptotikus és gátló, anti-apoptotikus tagjai is vannak és a mitochondriumok épségének ellenőrzésén keresztül elsődleges a szerepük a programozott sejthalál szabályozásában (5.20. ábra).

A különböző Bcl fehérjéket összehasonlító színes ábra, melyen egy fehérje egy színes sáv és rajta a domének szürkésbarna csíkokként vannak feltüntetve.

5.20. ábra A Bcl-2 család fehérjéi. Az ábrán látható rövidítések: Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bid, BH3-interacting domain death agonist; Bad, Bcl-2 antagonist of cell death; Bim, Bcl-2 interacting mediator of cell death; TM, transzmembrán domén; Bax, Bcl-2-associated X protein; Bak, Bcl-2-antagonist/killer-1; Bcl-XL, B-cell lymphoma-extra large.

Itt a tagok a Bcl-2 homológia (BH) domén szekvencia és szerkezeti hasonlósága alapján kerültek a családba. A C-terminális transzmembrán régió horgonyozza ezeket a fehérjéket a mitochondriumok külső membránjába vagy az endoplazmatikus retikulumba. A pro-apoptotikus fehérjék a membránban pórusokká állnak össze, a kialakuló lyukakon keresztül citokróm-c és Ca2+ szabadul fel. Ezzel ellentétben az anti-apoptotikus tagok a membránban összekapcsolódnak a pro-apoptotikus fehérjékkel és így megvédik a mitochondriumok integritását az előbbi károsodások meggátlásával. A pro-apoptotikus családtagok (mint a Bid vagy a Bax) proteaszomális lebontása megmentheti a sejtet az öngyilkosságtól (Fennell és mtsai., 2008; Jesenberger és Jentsch, 2002; Youle és Strasser, 2008).

Az ubiquitin-proteaszóma rendszer részvétele a jelátviteli folyamatokban

Az NF-κB jelátviteli útvonal szabályozása

  • Transzkripciós faktor (dimer)

    • NF-κB1 (p50) vagy NF-κB2 (p52), és c-Rel, RelA (p65), RelB

  • I-κB - az NF-κB inhibitora

    • elfedi a magi lokalizációs jelet

    • ha foszforilálódik, ubiquitinilálódik - lebomlik

  • Ub-proteaszóma rendszer részvétele

    • NF-κB processzálás (p100 – p50, p105 – p52)

    • IKK - I-κB kináz aktiválás

    • I-κB lebontás

Az NF-κB (nuclear factor κ enhancer binding protein) klasszikus formája egy p50 és p65 egységekből álló heterodimer (5.21. ábra).

Az NF-κB jelátviteli útvonalat bemutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint narancssárga pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

5.21. ábra Az NF-κB aktivitás szabályozása

A p50 prekurzor alakját, a p105 fehérjét az ubiquitin-proteaszóma rendszer alakítja az érett formába. A p50 a p65-tel együtt dimerként van jelen a citoplazmában és összekapcsolódik az NF-κB inhibitorával, az IκBα-val. Az NF-κB-hez kötve, az IκBα elfedi annak magi lokalizációs jelét és ezzel megakadályozza a bejutását a sejtmagba. A sejtet érő különféle jelek hatására, az IκBα gyorsan foszforilálódik az IκB kináz (IKK) komplexum által. Az IKK maga is nem proteolitikus multiubiquitiniláció hatására aktiválódik. Az aktiváláshoz Lys63-on át felépülő multiubiquitin láncokra van szükség. Ezt egy RING-finger fehérje, a TRAF6 (tumour-necrosis factor (TNF)-receptor associated factor 6) és egy vele együttműködő ubiquitin konjugáló enzimkomplexum, a heterodimer Ubc13/Uev1 (más néven TRIKA-1 - TRAF6-regulated IKK activator 1) szintetizálja. Ennek a szokatlan modifikációnak a célpontja maga a TRAF6. Az aktivált IKK általi foszforiláció után az IκBα foszforilált részei adják az RSIκB/β-TrCP ubiquitin ligáz számára felismerhető helyeket és az IκBα gyorsan ubiquitinilálódik majd a proteaszóma lebontja. Az IκBα degradációját követően az NF-κB bejut a magba, ahol az immunitással, gyulladással és más folyamatokkal kapcsolatos gének széles spektrumának átírását irányítja (Jesenberger és Jentsch, 2002).

Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a rák kialakulásában a NF-κB rendszer fontos szerepet játszik. Ha felszabadul specifikus inhibitora, az IκB gátlása alól, bekerül a sejtmagba, a DNS-hez köt és a növekedéssel, differenciálódással kapcsolatos valamint apoptózist gátló gének (Bcl-2, IAP) átírását szabályozza (5.22. ábra).

A proteaszóma gátlás az NF-κB-re gyakorolt hatását bemutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint világosbarna pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes ellipszisek ábrázolják.

5.22. ábra Rákterápia proteaszóma gátlással az NF-κB útvonalon

Mindezeken túl elősegíti az onkogenezist és egyes rosszindulatú daganatsejtekben folyamatosan aktív. A folyamatos aktiválódás megtörténik kemoterápiás gyógyszerek, sugárzás, citokinek vagy oxidánsok hatására is. Ezzel összhangban, az NF-κB gátlása a kritikus szabályozási pont indukálható kemorezisztencia esetén és úgy tűnik, megnöveli a malignus sejtek érzékenységét a kemoterápiás szerek illetve a besugárzás iránt. Az NF-κB inaktiválása az IκB foszforilációjának gátlása útján nem tudja teljesen megakadályoznia a sejtosztódást, ami azt mutatja, hogy a proteaszóma inhibitorok nem csak az NF-κB blokkolásán keresztül hatnak, hanem más jelátviteli útvonalakat is célba vesznek. Mindezek mellett, a proteaszóma gátlás megakadályozza az ubiquitinilált IκB lebontását is (Adams, 2004).

A stresszre, mint a neoplasia vagy a kemoterápia, adott válasz során az IκB inhibitor foszforilálódik és lebomlik a proteaszóma által. Ezt követően az NF-κB bejut a magba és különféle túlélést elősegítő útvonalakat hoz működésbe. A proteaszóma gátlás megakadályozza az NF-κB aktiválódását és megnöveli a sejt érzékenységét a kemoterápia citotoxikus hatásaira (5.22 ábra).

Az NF-κB útvonal hibás szabályozása összekapcsolódik egyes rosszindulatú daganatokkal, ide tartozik az akut limfoblasztikus leukémia és a mielóma multiplex. Az NF-κB jelátviteli út állandó aktiválása a drogrezisztencia egyik formája, amit sok szolid tumor és hematológiai daganat használ. Például az NF-κB aktiválódásának gátlása az N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal proteaszóma inhibitorral jelentősen megnöveli az érzékenységet a különböző sejthalál indukáló ligandumok iránt (DILs - death-inducing ligands, például a TNF-α vagy a doxorubicin) érzékeny vagy DIL rezisztens limfoid sejtvonalakban.

A Wnt–β-catenin–TCF/LEF jelátviteli útvonal

  • a Wnt egy szekretált jelátvivő molekula

  • a Frizzled receptor-család megköti

  • ennek hatására a Dishevelled aktiválódik

  • inaktiválja a glikogén szintáz kinázt (GSK-3β, zw3), az APC-axin-GSK-3β komplexum tagját

  • a stabil β-catenin (Arm) belép a magba és leszorítja a groucho-t a TCF-ről

  • beindul a génaktiválódás, génátírás

  • a Wnt jelátviteli útvonalnak alapvető szerepe van a fejlődés és a differenciálódás szabályozásában

  • a rendszer hibája illetve egyes célgének kifejeződés tumorképződéshez vezethet

A Wnt jel hiányában a β catenin szint a citoplazmában és a sejtmagban alacsony lesz, mert a CK1 (casein kinase 1) és a GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) szerin/treonin kinázok folyamatosan foszforilálják. A hiperfoszforilált β catenint a βTRCP (β transducin-repeat-containing protein) megköti és ubiquitinilálja majd a proteaszóma lebontja (5.23. ábra, bal oldal). A β catenin lebontásra előkészítő komplexum a következő fehérjékből áll: CK1 és GSK3β, valamint az AXIN1 (axis inhibition protein 1) és az APC (adenomatous polyposis coli) horgonyfehérjék. A magban a TCF (T-cell factor) molekulákat ko-represszorok, mint a GRG/TLE (Groucho/transducin-like enhancer) kötik meg és ezzel megakadályozzák a Wnt célgének átíródását. A represszor komplexum további tagjai a CTbP (C-terminal binding protein) és a HDAC (histone deacetylase) fehérjék. A magban a β catenin TCF-hez kötődését az ICAT (cell autonomous inhibitor of β catenin and TCF) fehérje akadályozza meg. A sejtfelszíni Frizzled receptor komplexum, mely a Frizzled és az LRP5 (LDL receptor-related protein 5) vagy LRP6 fehérjékből épül fel, aktívan gátlódhat a receptor-kötött oldható inhibitorok által, mint amilyen a DKK1 (Dickkopf homologue 1) (Staal és mtsai., 2008).

A Wnt jelátviteli útvonal inaktív és aktív formáját bemutató színes folyamatábra, melyen az ubiquitint szürke pöttyök, az enzimeket és a szubsztrátokat színes síkidomok ábrázolják.

5.23. ábra A Wnt jelátviteli útvonal inaktív (bal oldal) és Wnt kötött, aktív (jobb oldal) formája (DVL, mammalian homologue of Drosophila Dishevelled; PP2A, protein phosphatase 2A).

Ha a lipiddel módosított Wnt fehérje a receptor komplexumhoz köt bekapcsol a jelátviteli útvonal (5.23. ábra, jobb oldal). A CK1 és GSK3β kinázok foszforilálják a receptor LRP fehérjéjét és az AXIN1 a plazma membránhoz verbuválódik. A β catenin l lebontásra előkészítő komplexum kinázai inaktiválódnak és a β catenin tovább kerül a sejtmagba, hogy a TCF-fel aktív transzkripciós faktor komplexumot hozzon létre. Ez aztán célgének egész sorának átíródásához vezet. A magban a β catenin a TCF és LEF faktorokhoz kapcsolódik és kofaktorokat vonz oda, mint a LGS (legless, más néven bCL9) és a Pygopus (PYGO), CBP/p300, brahma és MED12, hogy elindítsa a génátírást (5.23. ábra).

Ellenőrző kérdések

  1. Írjon példákat sokszorosan foszforilált, majd multiubiquitilált fehérjékre!

  2. Milyen molekulák és milyen módon szabályozzák az Mdm2-t?

  3. Hogyan bomlik le és hogyan stabilizálódik a p53?

  4. Mik az apoptózis gátló fehérjecsalád (IAP) jellemzői?

  5. Milyen mód(ok)on képesek az apoptózis gátló fehérjecsalád (IAP) tagjai az apoptózis megakadályozására?

  6. Milyen mód(ok)on vesz részt a proteaszóma az NF-κB jelátviteli útvonal szabályozásában?

  7. Mi a sorsa/funkciója a β cateninnek a Wnt szignál hiányában illetve jelenlétében?

Irodalom

Adams, J. (2004) The proteasome: A suitable antineoplastic target. Nat. Rev. Cancer4, 349-360.

Dawson, S., Higashitsuji, H., Wilkinson, A. J., Fujita, J. és Mayer, R. J. (2006) Gankyrin: a new oncoprotein and regulator of pRb and p53. Trends Cell Biol 16, 229-33.

Fennell, D. A., Chacko, A. és Mutti, L. (2008) BCL-2 family regulation by the 20S proteasome inhibitor bortezomib. Oncogene 27, 1189-97.

Jesenberger, V. és Jentsch, S. (2002) Deadly encounter: Ubiquitin meets apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.3, 112-121.

Lee, J. C. és Peter, M. E. (2003) Regulation of apoptosis by ubiquitination. Immunol. Rev.193, 39-47.

Marine, J. C. és Jochemsen, A. G. (2005) Mdmx as an essential regulator of p53 activity. Biochem Biophys Res Commun331, 750-60.

Riedl, S. J. és Shi, Y. G. (2004) Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.5, 897-907.

Staal, F. J., Luis, T. C. és Tiemessen, M. M. (2008) WNT signalling in the immune system: WNT is spreading its wings. Nat Rev Immunol 8, 581-93.

Taylor, R. C., Cullen, S. P. és Martin, S. J. (2008) Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol9, 231-41.

Vaux, D. L. és Silke, J. (2005) IAPs, RINGs, and ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.6, 287-297.

Weissman, A. M. (2001) Themes and variations on ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2, 169-178.

Youle, R. J. és Strasser, A. (2008) The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 47-59.

Zhang, Y. és Xiong, Y. (2001) Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF. Cell Growth Differ12, 175-86.