7. Az autofág gének felfedezése és működése

Az autofágia fő útvonalai

A manapság legelterjedtebb definíció alapján autofágiának azt a folyamatot nevezzük, amely során a sejt saját anyagai, azaz a sejtben megtalálható fehérjék és organellumok a lizoszómába kerülnek, majd ott degradálódnak. Három fő típusát szokás elkülöníteni annak alapján, hogy a lebontandó anyagok hogyan jutnak a lizoszómába.

Az első útvonalon bizonyos fehérjék egy molekuláris transzportrendszer révén a citoszólból közvetlenül a lizoszóma membránon átjutva annak belsejébe kerülnek. A KFERQ aminosavszekvenciát hordozó, nem megfelelő térszerkezetű fehérjék szelektív felismerését a Hsc70 citoszólikus chaperone (dajkafehérje) biztosítja. Ezt követően a fehérjék a lizoszóma membránban elhelyezkedő LAMP-2A (lysosome-associated membrane protein 2A) molekulák által képzett csatornán keresztül jutnak be a lítikus organellum belsejébe, ahol a lizoszómális Hsc70 „fogadja” ezeket, majd pedig lebontódnak a savas hidrolázok közreműködésével. Ennek az útvonalnak a neve chaperone-mediálta autofágia (CMA, 7.1. ábra).

Az ábrán a lizoszóma látható. A Hsc70 fehérje piros színű. A rózsaszín LAMP-2A fehérjén keresztül jut be a lizoszómába a lebontandó fehérje. A lizoszómális hidroláz fekete körcikk.

7.1. ábra A chaperone-mediálta autofágia folyamata. A KFERQ szekvencát hordozó fehérjéket felismeri a citoszólikus Hsc70 chaperone. A lizoszóma membránban elhelyezkedő LAMP-2A molekulák által alkotott csatornán bejut a letekert fehérje az organellum belsejébe, ahol a lizoszómális Hsc70 chaperone fogadja, majd a lizoszómális hidrolázok lebontják.

A folyamat szelektivitását feltehetően egyéb, még nem teljesen ismert tényezők is befolyásolják, mivel a citoszólikus fehérjék harmada hordoz KFERQ szekvenciát. Ez az útvonal csak egyedi fehérjéket képes a lizoszómába szállítani, méghozzá meglehetősen limitált mennyiségben.

A második útvonal, a mikroautofágia során a lizoszóma membránja befelé tűrödve felveszi a citoplazma egy részét, majd a bekerült vezikula membránja a szállítmánnyal együtt a lizoszómában lebomlik (7.2. ábra).

Az ábrán a lizoszóma látható. A membránbefőződésben a felvett organellumokat ovális formák szimbolizálják. A lizoszómális hidroláz fekete körcikk.

7.2. ábra A mikroautofágia folyamata. A citoplazma részletek a membrán betűrődésével jutnak be a lizoszómába, ahol a lizoszómális hidrolázok lebontják.

A folyamat ránézésre hasonlónak tűnhet az endocitózishoz, ezért fontos kiemelni hogy a topológiája fordított, azaz ilyenkor nem a citoplazmába, hanem a külvilágnak tekinthető lizoszóma lumenébe kerül az anyag, és jelenlegi tudásunk szerint az endocitózisban szereplő fehérjék ehhez nem szükségesek (7.3. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.3. ábra A mikroautofágia morfológiája. A képen egy sötét, elektrondenz, heterogén beltartalmú autolizoszóma látszik, amelyben még felismerhető néhány lebomlófélben levő mitokondrium. Vegyük észre a rengeteg apró, világosabb vezikulát a lizoszóma belsejében, melyek a határoló membrán betűrődésével (mikroautofágia) kerülnek be a lumenbe. Juhász Gábor felvétele.

A mikroautofágia molekuláris mechanizmusa még kevéssé ismert, annyit tudunk jelenleg hogy részben átfed a legfőbb útvonaléval (lásd később). A szállított anyag mennyisége már jóval nagyobb mint a CMA-nál, ezen az úton akár teljes organellumok, például peroxiszómák is bejuthatnak lizoszómába. Élesztő sejtekben még a sejtmag egyes részei is a vakuoláris lebontásra kerülhetnek mikroautofágia révén (7.4. ábra).

Az elektronmikroszkópos képek fekete-fehér. A vakuólumba a membrán befűződésével jut be a sejtmag egy darabja.

7.4. ábra A sejtmag egyes részeinek mikroautofág lebontása. Az a-c ábrákon a sejtmag (N) egyes részeit az itt sötéten jelölődő vakuólum (V) mikroautofágia révén felveszi. Forrás: Mol. Biol. Cell 2003: 14 (1), 129-141.

A legjelentősebb és legjobban ismert a harmadik útvonal, a makroautofágia (7.5. ábra).

A folyamatábra bal oldalán látható a membrán forrás, kék kör, amely beleolvad a begörbülő fagofórba. Ennek külső oldali membránja kék, a belső zöld. A citoplazma részleteket ovális formák szimbolizálják. Az autofagoszóma külső membránja kék, a belső zöld, benne a citoplazma részletek láthatóak. A késői endoszómát egy fekete kör jelöli, benne kis vezikulumokkal. Középen az amfiszóma és lizoszóma látható. Az autolizoszómában a hidroláz fekete körcikk.

7.5. ábra A makroautofágia folyamata. A citoplazma egy részletét egy növekvő kettős membrán, a fagofór veszi körül. Záródásával létrejön az autofagoszóma. A külső membránja késői endoszómával fúzionál, így kialakul az amfiszóma. Végül lizoszómával olvad össze, az így kialakuló autolizoszómában a savas hidrolázok lebontják a belső membránt a szekvesztrált anyagokkal együtt.

Ennek során egy máig sem teljesen tisztázott eredetű fagofór (más néven izoláló membrán) ciszterna jön létre a citoplazmában, amely egyre növekedve és meghajolva körbeveszi annak egy részét (7.6. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.6. ábra A fagofór morfológiája. A fagofór (más néven izoláló membrán) jellegzetes, ultravékony metszetben gyakran félhold alakú (a valóságban persze térbeli, például csésze alakú) membránciszterna. Gyakran a két membrán között jellegzetes, üres tér figyelhető meg a rutinszerűen alkalmazott mintaelőkészítés következtében. Vegyük észre, hogy közvetlenül a fagofór mellett jobbra és balra is egy-egy durva felszínű, riboszómákat hordozó endoplazmás retikulum ciszterna látható. Ez az elhelyezkedés sok sejttípusban igen gyakori. Kovács Attila felvétele.

A fagofór záródásakor jön létre a kettős membránnal határolt autofagoszóma, melynek tartalma gyakorlatilag megegyezik a környező citoplazmával, de már szeparálásra került attól (7.7. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.7. ábra Az autofagoszóma morfológiája. Az autofagoszóma (AP, autophagosoma) jellegzetes, kettős membránnal határolt vezikula. A fagofórhoz hasonlóan ezen a képen is megfigyelhető a külsö és belső membrán közötti, üresnek tűnő rés. Az autofagoszóma belsejében található, elkerített citoplazmarészlet morfológiája teljes mértékben megegyezik a környező citoplazmával, mivel lebontás ebben a sejtorganellumban még nem történik. Juhász Gábor felvétele.

A következő lépésben az autofagoszóma külső membránja késői endoszómával fúzionál, az így keletkező hibrid organellumot nevezzük amfiszómának (7.8. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.8. ábra Az amfiszóma morfológiája. Ebben a felszínén mikrovillusok tömkelegét hordozó muslica bélhámsejtben megfigyelhetünk tipikus multivezikuláris testeket (MVB, multivesicular body), amik késői endoszómának felelnek meg. A kép jobb felső sarkában látható egy potenciális amfiszóma (A), mivel belsejében MVB-re jellemző kis vezikulákat és egy autofagoszóma belső membánnal határolt beltartalmát is felfedezhetjük. Juhász Gábor felvétele.

A folyamat végén az autofagoszóma tartalma a lizoszómába kerül szintén vezikulafúzió révén, majd ott lebomlik (7.9. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.9. ábra Az autolizoszóma morfológiája. A képen látható sötét, elektrondenz autolizoszóma (AL) belsejében még felismerhető több, a degradációs folyamat kezdetén tartó mitokondrium, és egyéb membránnal határolt organellumok maradványai. Juhász Gábor felvétele.

Fontos kiemelni, hogy a degradáció végtermékei újrahasznosítódnak: például a keletkező aminosavakat a lizoszóma membránban található, specifikus transzporterek juttatják vissza a citoplazmába. A makroautofágia által szállított anyag mennyisége messze meghaladja az első két útvonalét, így érthető hogy a témával kapcsolatos kutatások általában ezzel foglalkoznak. Bevett gyakorlat, hogy az egyszerűség kedvéért autofágia alatt a makroautofágiát értik a szakirodalomban, így ebben a könyvben is ezt a nevezéktant alkalmazzuk.

Az autofág (Atg) gének azonosítása élesztőben

Az autofágia molekuláris mechanizmusa, az abban szereplő gének és géntermékek mibenléte egészen az 1990-es évek közepéig-végéig ismeretlen maradt. Ebből is adódott hogy eddig az időszakig szinte csak leíró jellegű kutatások folytak, azaz megfigyelték hogy milyen körülmények vagy hormonális ingerek váltanak ki autofág választ különféle élőlények sejtjeiben, de a folyamat fiziológiás vagy patológiás jelentőségét csak korlátozottan lehetett vizsgálni. Ekkorra már leírtak ugyan olyan hatóanyagokat, amelyekkel az autofág lebontást serkenteni (pl. rapamicin) vagy gátolni (pl. 3-metiladenin vagy klorokvin) lehetett, azonban ezen drogok egyéb intracelluláris folyamatokat is befolyásolnak, így szelektivitásuk kérdéses.

Az igazi áttörést, sok más kutatási területhez hasonlóan, az élesztő genetikai vizsgálatok érték el. Az autofágiát Saccharomyces cerevisiae-ben 1992-ben írták le (Takeshige és mtsai, 1992). Vakuóláris proteináz A és B vagy karboxipeptidáz Y (CPY) hiányos mutáns élesztő sejteket tanulmányoztak, melyek nem képesek a normális lebontásra. Azt tapasztalták, hogy ha a vegetatív körülmények között tartott, minden igényt kielégítően táplált mutáns sejteket nitrogénhiányos, táplálékszegény médiumba teszik át (tehát éhezésre kényszerítik), akkor a fénymikroszkóppal üresnek látszó vakuólumban (ami valójában egy óriási lizoszóma) apró szemcsék jelennek meg (7.10. ábra).

A fénymikroszkópos képek fekete-fehérek. A fehér nyíl az üres vakuólumra mutat. A fehér nyílhegy az autofág testekre mutat a vakuólum belsejében.

7.10. ábra Élesztősejtek DIC optikával készült fénymikroszkópos képe. A (b) panelen látható, vakuoláris proteázokat gátló PMSF jelenlétében éheztetett élesztő sejt vakuólumában rengeteg apró rögöcske, autofág test figyelhető meg. Az (a) panel autofág gén mutáns élesztő sejtjeiben autofagoszómák, így autofág testek sem jönnek létre éhezés hatására. Forrás: Mol. Biol. Cell 2005: 16 (5), 2544-2553

Elektromikroszkóppal vizsgálva ezeket a sejteket kiderült, hogy a vakuólum belsejében lévő szemcsék citoplazma részeket tartalmazó szimpla membránnal határolt vezikulák, melyeket autofág testeknek nevezték el (7.11. ábra).

A négy elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.11. ábra Éheztetett élesztősejtek elektronmikroszkópos képe. A felső sorban látható, éheztett pep4 (vakuoláris hidroláz) mutáns élesztő sejtekben a nagyméretű vakuólum belsejében membránnal határolt citoplazma részletek, autofág testek találhatóak. Ha az Atg1 gén is hiányzik, akkor az autofagoszómák és autofág testek képződése gátolt, üresnek látszik a vakuólum az alsó sorban található képeken. Forrás: Mol. Biol. Cell 2008: 19(2), 668-681

Ezek a citoplazmában keletkeznek mint kettős membránnal burkolt autofagoszómák, majd a külső membránjuk a vakuólum membránnal fúzionál, és a belső membránnal határolt apró, fél-egy mikrométer átmérőjű vezikulák a náluk egy nagyságrenddel nagyobb vakuólum belsejébe jutva megfelelő, differenciális interferencia kontraszt (DIC) képalkotásra képes fénymikroszkópban láthatók. Ennek persze feltétele hogy az autofág testek ne bomoljanak le szinte azonnal, amit megfelelő vakuoláris proteáz gátlószer kezeléssel (ilyen például a proteináz B-t gátló PMSF, fenil-metil-szulfonil fluorid) vagy a fent említett lebontó enzimek mutánsait vizsgálva lehet elérni. Megjegyzendő hogy ilyen autofág testek az állati sejtekben is keletkeznek, azonban mivel az élesztő és növényi sejtekre jellemző egy nagy vakuólum helyett rengeteg kisebb méretű lizoszómát hordoznak, így azokat gyakorlatilag csak elektronmikroszkóppal lehet kimutatni (7.12. ábra).

Az elektronmikroszkópos kép fekete-fehér.

7.12. ábra Autofág test morfológiája állati sejtekben. A képen látható sötét autolizoszóma bal oldali részében kitűnően felismerhető egy autofág test (AB, autophagic body). A közvetlenül a kémiai rögzítést megelőzően megtörtént autofagoszóma-lizoszóma fúzió során az autofagoszóma belső membránnal körbevett beltartalma még degradáció jeleit nem mutatja, morfológiája hasonló a környező citoplazmáéhoz. Juhász Gábor felvétele.

Ekkor vált lehetővé, hogy mutagenezis révén autofágiához szükséges géneket izoláljanak. Az autofágiát élesztőben leíró Yoshinori Ohsumi japán kutatócsoportja 1993-ban publikálták az első nagyléptékű genetikai szűrés (screen) eredményeit (Tsukada és Ohsumi, 1993). Proteináz A deficiens (pep4) genetikai háttérben olyan törzseket kerestek amelyek éheztetés hatására nem halmoztak fel autofág testeket. Ezzel a módszerrel azonban csak egy mutánst (APG1) sikerült találni. Ennek vizsgálata során kiderült, hogy ebben a mutánsban nitrogén-éheztetés körülményei között nem fokozódott az endogén fehérjelebontás, és túlélőképessége a vad típusúénál lényegesen rosszabb volt: néhány napi éhezés hatására a vad típusú sejtekkel ellentétben az APG1 mutáns sejtek többsége elpusztult. Ezt az életképesség csökkentést felhasználva egy újabb kísérlet során 100 000 kémiai mutagenezissel létrehozott törzsből izoláltak 75 APG mutánst. Ezekről kiderítették, hogy 15 komplementációs csoporthoz tartoznak, azaz 15 gént reprezentálnak. A 15 mutáns törzs (APG1-15) mindegyike a következő közös fenotipikus tulajdonságokat mutatta.

  1. Nitrogén, szén és aminosav éheztetés körülményei között nem halmozott fel autofág testeket, és életképességét viszonylag gyorsan elvesztette.

  2. Nem történt meg benne az endogén proteolízis éheztetés általi erőteljes fokozódása.

  3. Egyik homozigóta APG mutáns sem volt képes normális spóraképzésre.

Egy másik, német kutatócsoport által alkalmazott szelekciós rendszerben első markerként egy, a vad típusú élesztősejtekben éheztetés körülményei között lebomló citoszolikus enzimnek (zsírsav szintetáznak) a vakuólában való felhalmozódását detektálták immunológiai módszerrel. Azokat a törzseket amelyekben az autofágiát stimuláló (éhezési) körülmények közt nem tapasztaltak nagy mértékű zsírsav szintetáz szintcsökkenést, tehát feltehetően hiányzott az autofág lebontó aktivitás, PMSF gátlás mellett megvizsgálták arra nézve, hogy képesek-e autofág testeket felhalmozni. Ezen módszerek felhasználásával izolálták az AUT1-9 mutánsokat (Thumm és mtsai, 1994).

Az élesztőben folyó vizsgálatok harmadik vonulata egy szokatlan és teljesen új folyamat felfedezéséhez vezetett. Daniel J. Klionsky amerikai munkacsoportjának vizsgálatai kiderítették, hogy egy rezidens vakuóláris enzim, az aminopeptidáz I (API), amely a szintézisének befejezésekor a citoszólba jut, egy új és sajátos úton kerül a végleges műlködési helyét jelentő vakuólumba (Harding és mtsai, 1995). Ez lényegesen különbözik a hagyományos úgynevezett ALP (alkaline phosphatase) útvonaltól (7.13. ábra).

A folyamatábrán balról jobbra látható a sárga színű durva felszínű endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék, Golgi vezikulum és a vakuólum.

7.13. ábra Az ALP (alkaline phosphatase) útvonal. A durva felszínű endoplazmatikus retikulumból (RER) a Golgi-készüléken és Golgi vezikulum úton kerül az enzim a vakuólumba. Kárpáti Manuéla ábrája.

Ennek során az ALP enzim a klasszikus RER – Golgi - Golgi-vezikula utat járja be, végül fúzió révén a vakuólumba kerül. Egy másik jól jellemzett transzport rendszer az RER - Golgi- Golgi-vezikula – endoszóma - vakuólum utat használja. Ezt egy tipikus képviselőjéről (carboxypetidase Y) CPY útvonalnak hívják (7.14. ábra).

A folyamatábrán balról jobbra látható a sárga színű durva felszínű endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék, Golgi vezikulum, endoszóma és a vakuólum. Az enzimet piros pötty jelöli.

7.14. ábra A CPY (carboxypetidase Y) útvonal. A durva endoplazmatikus retikulumból (RER) a Golgi-készüléken keresztül létrejövő vezikulum szállítja az enzimeket, amely előbb endoszómával, majd ezt követően a vakuólummal fúzionál. Kárpáti Manuéla ábrája.

Az API-t szállító mechanizmus újdonságát az adta, hogy ez az enzim kikerüli a fenti útvonalakat és a citoplazmából közvetlenül a vakuólumba kerül. Éppen amiatt ezt a vadonatúj mechanizmust Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) útvonalnak nevezték el. Miután genetikai screen-ekben CVT mutánsokat izoláltak, váratlan módon kiderült, hogy a Cvt út genetikailag, mechanizmusát és elektronmikroszkópos megjelenését tekintve is hasonlóságokat mutat az autofágiával (7.15. ábra).

Az enzimet piros pötty jelöli, amelyet egy zöld kettős membrán vesz körbe. A Cvt vezikulum összeolvad a sárga vakuólummal.

7.15. ábra A Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) útvonal. Az enzim a citoplazmából egyenesen a vakuólumba kerül egy kettős membrán borítású Cvt vezikulumban. Kárpáti Manuéla ábrája.

Például a Cvt mechanizmus elektronmikroszkópban vizsgálva is hasonlít az autofágiához. Mindkettő esetében kettős membrán által végrehajtott szekvesztráció révén, a citoplazma egy része (autofágia) vagy a vakuólumba szállítandó enzimek (Cvt út) elhatárolódnak a citoplazma többi részétől. Az így létrejött Cvt vezikula kisebb méretű (átmérője kb. 150 nm), és ami különösen érdekes, szelekív módon csak a szállítandó enzimeket valamint a csomagolásukhoz szükséges fehérjéket veszi fel. Az autofagoszóma nagyobb méretű, élesztőben átmérője kb. 300-900 nm. Benne a feltételezések szerint többé-kevésbé válogatás nélkül szekvesztrált citoplazma részletek vannak. A Cvt vezikula vagy az autofagoszóma külső membránja azután a vakuólum membránjával való fúzió révén juttatja a belső membránnal eleinte még továbbra is beburkolt tartalmát, a Cvt vagy autofág testet a vakuólum belsejébe. Érdekes módon normális tápanyagellátottság esetén a bioszintetikus Cvt útvonal aktív, míg éhezés hatására az élesztősejtek képesek átkapcsolni az autofág útvonalra (7.16. ábra).

A fekete-fehér folyamatábra bal oldalán API enzim és oligomerje látható. Kettős membrán veszi körbe és Cvt vezikulum (fent) vagy autofagoszóma (lent) útján jut a vakuólumba.

7.16. ábra A Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) és autofág útvonalak. Az API (aminopeptidáz 1) enzim jól táplált élesztősejtekben a citoplazmából egy kettős membrán borítású Cvt vezikulum közvetítésével kerül a vakuólumba. Éhezés esetén viszont a Cvt útvonal gátlódik, helyette autofág úton jut a vakuólumba ez a hidroláz. Forrás: Mol. Biol. Cell 2000: 11 (3), 969-982.

Fontos, hogy a Cvt úton szállított enzimek ilyenkor autofágia révén jutnak el a vakuólumba, azaz egy Cvt-specifikus mutáció okozta API transzport hiba „megmenekíthető” éheztetéssel. Megjegyzendő, hogy a Cvt-hez hasonló útvonalat még semmilyen egyéb élesztőfajban vagy magasabb rendű sejtben nem találtak.

Az élesztő autofág mutánsainak felfedezése kétfelé is utat nyitott. Az egyik úton felderíthető az autofágia molekuláris mechanizmusa és szabályozása élesztőben és magasabb rendűekben. A másik úton reverz genetikai módszerekre alapozva meg lehetett célozni az autofágia más modellszervezetekben, köztük állatokban és tenyésztett egér vagy emberi sejteken történő vizsgálatát.

A gyorsabb előrehaladás az autofágia molekuláris hátterének megértésében természetesen az élesztő sejteken valósult meg. Az APG, AUT és CVT mutánsok száma tovább bővült, valamint egyéb mutagenezis screenekből (mint pl. az igen sokféle vezikulatranszport útvonalben szereplő vakuoláris protein sorting, VPS mutánsok) is számos autofágiához szükséges gént izoláltak. Kiderült, hogy a különféle élesztő screenekben azonosított APG/AUT/CVT stb. mutánsok részben allélikusak egymással, tehát ugyanazt a gént érintik. A párhuzamos elnevezések egyre nehézkesebbé tették a folyamatok áttekintését. A helyzet az új évezred elejére megérett a tisztázásra, aminek az eredményeképpen az élesztőben azonosított autofág gének új nevezéktanát vezették be (Klionsky és mtsai, 2003). Az új név az “autophagy-related” kifejezésből az ATG génekre, illetve az Atg fehérjékre vonatkozik élesztőben, de gyakran magasabb rendűekben is hasonló elnevezéssel találkozunk.

Az Atg fehérjék működése

Az eddigi kutatási eredmények alapján elmondható, hogy az Atg fehérjéket funkciójuk szerint több evolúciósan konzervált csoportba oszthatjuk (Mizushima és mtsai, 2011). Ezek többsége legalábbis átmenetileg megtalálható a leendő és képződő fagofór területén, melyet PAS-nak neveznek (pre-autophagosomal structure vagy phagophore assembly site). Mivel szerepük hasonló a különféle élőlényekben, így csak az élesztő komplexeket ismertetjük részletesebben, és utalunk az emlős homológok elnevezésére ahol azok eltérnek az élesztő nómenklatúrától. Egy fontos különbség például az, hogy a magasabb rendűek sejtjeiben egyszerre több fagofór is ki tud alakulni, viszont élesztőben csak egy, a vakuólum közelében elhelyezkedő PAS mutatható ki. Az Atg fehérjék működését az autofágia során a gerinctelenekről szóló fejezet 18. ábrája illusztrálja.

Az autofág indukció során először az Atg1 kináz komplex aktiválódik, melyet az Atg1 szerin-treonin kináz (emlősök homológjai az ULK1 és 2) mellett az Atg13 és az Atg17 alkot, egyéb fehérjék mellett. Az Atg17 élesztőben autofágia-specifikus, a Cvt útvonalban az Atg11 funkcionál ezen komplex alegységeként. Említésre érdemes hogy ámbár az élesztő Atg17 homológjait nem találjuk meg állati sejtekben, egy hasonló szerepű fehérje, a FIP200 viszont megtalálható az Atg1/ULK komplexben. Az Atg1 kinázra jellemző hogy autofoszforilációra képes, továbbá állati sejtekben az Atg13-at foszforilálja. Egyéb szubsztrátjai még kevéssé ismertek.

A fagofór kialakulásához szintén kulcsfontosságú az Atg9. Ez az egyetlen integráns membránfehérje (6 transzmembrán domént tartalmaz) az Atg géntermékek között, így csak vezikulák formájában szállítódhat. Az Atg9 az eddigi eredmények alapján a Golgi készülék és az endoszómák területén lelhető fel, ami arra utal, hogy a fagofór membránkomponenseinek egy része ezen sejtalkotókból származhat.

Az autofág fehérjék harmadik csoportját egy autofágia-specifikus lipid kináz komplex alkotja. Ennek katalitikus alegysége a Vps34, amely egy foszfatidil-inozitol 3-kináz (PI3K, és a III. osztályba tartozik, lásd később). Működése során ezt a membránalkotó lipidet képes az inozitol cukorgyűrű 3. szénatomjához kapcsolódó hidroxilcsoportján foszforilálni, ezáltal foszfatidil-inozitol 3-foszfáttá (PI3P) alakítani. A komplex további alegységei közé tartozik a szerin-treonin kináz Vps15, az Atg6 (emlős homológja a Beclin-1), valamint az Atg14. Ez utóbbi szerepe az, hogy autofágia-specifikussá tegye a komplex működését. A PI3P ugyanis nem csak a fagofórok és autofagoszómák, hanem az endoszómák membánjában is jelen van, döntően a Vps34 aktivitásának köszönhetően. Az endocitotikus útvonalban szereplő lipid kináz komplexben azonban az Atg14 alegység helyett a Vps38 (emlősökben UVRAG) található meg.

A negyedik csoportot az Atg18 (emlősökben WIPI1-4) és Atg2 fehérjék komplexe alkotja. Az Atg18 PI3P kötő motívummal rendelkezik, így a lipid kináz komplex effektora. Mindkét fehérje köt az Atg9-hez is, így feltételezhetően annak aktivitását, elhelyezkedését befolyásolja. Említésre érdemes hogy emlősökben leírtak egy másik PI3P effektort is, melyet DFCP1-nek neveznek, mivel két specifikus lipidkötő domént hordoz (double FYVE domain containing protein 1). A DFCP1 nem minden élőlényben fordul elő, és ahol megtalálható azokban a sejtekben a hiánya nem gátolja az autofágiát. Vizsgálata azonban kiderítette, hogy bizonyos tenyésztett sejtvonalakban a DFCP1 az endoplazmás retikulum egy speciális szubdoménjében helyezkedik el, ott ahol az autofagoszómák keletkeznek. Ez a terület az autofagoszóma keletkezésének bizonyos fázisában omega alakú görbületet mutat, ennek alapján omegaszómának nevezték el. Ezen kísérletek felvetették annak a lehetőségét, hogy a fagofór képződéséhez az ER membrán is hozzájárulhat. Az hogy a kapcsolat mennyire direkt, azaz hogy van-e közvetlen membránösszeköttetés vagy vezikuláris transzport zajlik-e az ER és a fagofór között, még nincs megnyugtatóan bizonyítva.

Végezetül két ubiquitin-szerű protein konjugációs rendszer is szükséges az autofagoszómák létrjöttéhez. Az Atg8 és az Atg12 térszerkezete nagyon hasonló az ubiquitinéhez, bár az aminosavsorrend szintjén ez nem nyilvánvaló. Mindkét fehérje aktiválását az Atg7, egy E1-szerű enzim végzi. Ezután az Atg8-at az Atg3, az Atg12-t pedig az Atg10 szállítja (E2). Az Atg12 kovalensen kapcsolódik az Atg5 fehérjéhez, majd az Atg16-tal együtt egy nagy fehérjekomplexet alkotnak. Ez az Atg5-12-16 komplex a képződő fagofór membránokat kötve interakcióba lép az Atg3-Atg8 komplex-szel, így segíti elő az Atg8 konjugációját egy membránlipidhez, a foszfatidil-etanolaminhoz (Romanov és mtsai, 2012). A folyamat végeredményeképpen egy membránkötött Atg8 molekula jön létre, amely mind a fagofór, mind pedig az autofagoszóma felszínén megtalálható. Fontos, hogy az Atg8 és homológjai (ezek egyike emlősökben az LC3, microtubule accociated protein light chain 3) még az E1 enzimhez való kapcsolódás előtt limitált proteolízisen esnek át: az Atg4 cisztein proteáz lehasítja a C-terminushoz közeli glicint követő aminosavakat, ami a konjugációs lépésekhez szükséges. Hőérzékeny Atg4 mutáns élesztősejtek vizsgálata derítette ki hogy az Atg4 az autofágia egy későbbi lépésében is szerepel: az autofagoszóma külső membránjához kapcsolt Atg8-at szabadítja fel. Ez élesztőben szükséges ahhoz, hogy az autofagoszóma a vakuólummal fúzionálni tudjon. Az autofagoszóma belső membránján található Atg8 a vakuólumba/lizoszómákba jut, és ott lebomlik. Ezáltal az Atg8 és homológjai az autofágia során szelektíven lebomlanak, és állandó utánpótlásra van szükség (transzkripció és transzláció révén) a maximális degradációs kapacitás eléréséhez.

A fenti, stabilnak tekinthető komplexeken és rendszereken kívül még rengeteg, az Atg fehérjekomplexek közötti kölcsönhatás játszhat döntő szerepet az autofág indukció során, melyek felderítése jelenleg is folyamatban van.

Ellenőrző kérdések

  1. Milyen útvonalakon juthatnak a lebontandó anyagok a citoplazmából a lizoszómába?

  2. Hogyan fedezték fel az autofágiához szükséges géneket?

  3. Az Atg fehérjék milyen fő funkcionális csoportokba sorolhatók?

Irodalom

Harding, T. M., Morano, K. A., Scott, S. V. és Klionsky, D. J. (1995). Isolation and characterization of yeast mutants in the cytoplasm to vacuole protein targeting pathway. The Journal of cell biology131, 591-602.

Klionsky, D. J., Cregg, J. M., Dunn, W. A., Jr., Emr, S. D., Sakai, Y., Sandoval, I. V., Sibirny, A., Subramani, S., Thumm, M., Veenhuis, M. és mtsai (2003). A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes. Dev. Cell5, 539-545.

Mizushima, N., Yoshimori, T. és Ohsumi, Y. (2011). The role of Atg proteins in autophagosome formation. Ann. Rev. Cell Dev. Biol.27, 107-132.

Romanov, J., Walczak, M., Ibiricu, I., Schuchner, S., Ogris, E., Kraft, C. és Martens, S. (2012). Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation. EMBO J.31, 4304-4317.

Takeshige, K., Baba, M., Tsuboi, S., Noda, T. és Ohsumi, Y. (1992). Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants és conditions for its induction. The Journal of cell biology119, 301-311.

Thumm, M., Egner, R., Koch, B., Schlumpberger, M., Straub, M., Veenhuis, M. és Wolf, D. H. (1994). Isolation of autophagocytosis mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 349, 275-280.

Tsukada, M. és Ohsumi, Y. (1993). Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett.333, 169-174.