8. Az autofágia mechanizmusa, jelentősége és TOR kináz-dependens szabályozása gerinctelen modellállatokban

Talajlakó fonalférgek (példa: Caenorhabditis elegans)

A Caenorhabditis elegans egy viszonylag egyszerű felépítésű, kb. 1 mm hosszú, talajlakó faj. Az 1960-as években alkalmazták először az egyedfejlődés és az idegrendszer genetikájának vizsgálatára. Előnyei hogy az áttetsző testében elhelyezkedő egyedi sejteket megfelelő fénymikroszkópos technikákkal látható fényben is tanulmányozni lehet, és laboratóriumi körülmények között a közönséges Eschericia coli baktériumtelepeket hordozó Petri csészékben egyszerűen tenyészthető. A peték kikelése után 4 lárvastádium (L1-L4) közbeiktatásával fejlődnek ki a szaporodóképes adultok, mintegy két nap leforgása alatt. Egy speciális, a normális körülmények között nem jellemző lárvaállapot (dauer stádium) révén az állatok a tartós tápanyaghiány vagy egyéb hátrányos körülmények közepette is hosszú ideig túlélnek (8.1. ábra).

8.1. ábra A Caenorhabditis elegans életciklusa.

A Caenorhabditis elegans életciklusa egy folyamatábra, melyben az egyes fejlődési stádiumok egy kör mentén helyezkednek el. Legfelül, 12 óránál, az adult állatból indul ki a embrionális fejlődés lépéseit ábrázoló 6 ovális kör. Utána kezdődnek az egyes lárvastádiumok, egy külön elágazásban ábrázolva a Dauer lárvastádiumot.

A C. elegans embrionális fejlődése 14 óra alatt zajlik le. A peték kikelése után 4 lárvastádium (L1-L4) közbeiktatásával fejlődnek ki a szaporodóképes adultok, mintegy két nap leforgása alatt. A tartós tápanyaghiány vagy egyéb hátrányos körülmények közepette egy speciális, a normális körülmények között nem jellemző lárvaállapot (dauer stádium) révén hosszú ideig túlélhetnek, majd megfelelő tápanyagellátottság esetében adultokká is fejlődhetnek. Forrás: www.wormatlas.org

Autofágia az élethossz szabályozásában

A fonalférget előszeretettel használják az ecetmuslicával együtt élethossz vizsgálatokra, azaz hogy a különféle genetikai hátterek vagy környezeti hatások hogyan befolyásolják azt, hogy ezek az állatok meddig élnek. Ezekből az eredményekből természetesen nem jósolható meg az emberek várható élettartama, hiszen azt rengeteg olyan környezeti, lélektani és szociális hatás befolyásolja amit nem lehet ilyen egyszerű gerinctelen modellek esetén figyelembe venni. Valószínűleg leszűrhetőek azonban olyan általános fiziológiai tényezők és sejtbiológiai folyamatok, melyek szerepet játszhatnak a humán élethossz meghatározásában.

Férgek esetén ismert hogy az inzulin receptorát kódoló gén (DAF-2, dauer formation abnormal 2) funkcióvesztése nagymértékben megnöveli a mutáns állatok élethosszát. A feltételezések szerint ez annak köszönhető, hogy lecsökken a sejtnövekedés és anyagcsere intenzitása. Beth Levine munkacsoportja mutatta ki azt elsőként, hogy az inzulin jelátvitel csökkenése az élethosszt autofágiában szereplő génektől függő módon növeli meg, majd arra is fény derült, hogy az autofágia gének funkcióvesztése a vad típusú férgek élethosszát is lerövidíti (Melendez és mtsai, 2003). A későbbi vizsgálatok alapján az autofág gének a lecsökkent táplákozási ráta, TOR aktivitás (lásd később) vagy mitokondriális működés által kiváltott élethosszt megnövelő hatáshoz is nélkülözhetetlennek bizonyultak férgekben. Úgy tűnik tehát, hogy akár minden, az élethosszt megnövelő behatás részben az autofágia révén fejtheti ki hatását (Tóth és mtsai, 2008).

Az autofágia szerepe a csíravonal specifikáció során

A fonalférgek korai embrionális fejlődése szigorúan szabályozott, az osztódások során keletkező sejtek pozíciója és későbbi sorsuk is determinált. A leendő ivarsejteket létrehozó csíravonal sejtjeire jellemző az RNS-ben gazdag P granulumok citoplazmás jelenléte, melyek feltételezhetően a csírasejtekre jellemző génexpressziós mintázat kialakításában vesznek részt (8.2. ábra).

A képen két fekete-fehér mikroszkópos kép látható. A bal oldalon a két sejtes embrió jobb alsó részében található fehér pöttyökre mutató nyílfej jelzi a P-granulumokat. A jobb oldali ábrán ugyanolyan fehér nyílfejek mutatják az adultokban jelen levő P-granulumokat.

8.2. ábra P-granulumok jelenléte kétsejtes embrióban és a csírasejtekben (A) 2 sejtes fonalféreg embrió posterior sejtjében P-granulumok jelenléte látható. (B) Hermafrodita adultokban a csírasejtekben vannak jelen a P-granulunok. A nyílfejek a P-granulumokat jelölik mindkét ábrán. Forrás: Development 2008, 135(5): 983-993.

Hong Zhang kutatócsoportja egy nagyléptékű genetikai screen során olyan géneket keresett, amelyek a P granulumoknak az utódsejtekben való egyenlőtlen eloszlását szabályozzák fejlődő féreg embriókban. Normális esetben ilyen granulumok csak a csírasejtek őseiben találhatók (Tian és mtsai, 2010). Zhang irányításával az autofág gének számos mutánsát izolálták, amelyekben a csírasejtek mellett a leendő testi sejtek is P granulumokat tartalmaztak (8.3. ábra).

A képen két oszlopba rendezve látható a vad típusú és az autofágia mutáns C. elegans egyedfejlődése. A szürke színű osztódó sejtekben a bal oldali oszlop esetében csak a jobb oldali sejtekben láthatunk zöld színnel jelzett P-granulumokat, míg a jobb oldali oszlop esetében a zöld pettyek már minden sejtben jelen vannak az oszlop harmadik ábráján.

8.3. ábra P-granulumok elhelyezkedése C. elegans egyedfejlődése során A vad típusú fonalférgekben a P-granulumok csak a csírasejtekben és az azokat létrehozó embrionális sejtekben vannak jelen. Az autofág mutánsokban a testi sejtekben is kimutatható a P-granulumok jelenléte. Forrás: F1000 Biol Rep. 2009: 29, 1:49.

Ebből azt a következtetést lehetett levonni, hogy a P granulumok eloszlását az autofágia is szabályozza a testi sejtekben található struktúrák szelektív lebontása révén. Ez az ektopikus P granulum (EPG) screen a már élesztő vizsgálatok alapján ismert autofág gének homológjai mellett több, állati sejtekre specifikus, autofágiához szükséges gént is azonosított. Ilyen például az emlős VMP1 (más néven TMEM49). Ez a döntően az endoplazmás retikulumban elhelyezkedő fehérje még nem ismert módon szükséges a megfelelő méretű fagofór kialakulásához és záródásához.

Rovarok (példa: Drosophila melanogaster)

A gerincteleneken folyó kísérletek másik kedvelt alanya a Drosophila melanogaster, amely laboratóriumi körülmények között üvegfiolákban könnyen tenyészthető. Bár egyedfejlődése lassabb mint a fonalféregé (az imágók kikelése mintegy 10 nappal a peterakást követően várható), testfelépítésének bonyolultságát, szerveit és élettanát tekintve jóval közelebb áll az emlősökhöz, mint a férgek. Nagy előnye az igen szofisztikált genetikai eszközkészlet, amellyel például genetikai mozaik állatok hozhatók létre. Ennek során különböző genotípusú sejtek egyazon állatban vagy szövetben vizsgálhatók, tehát bizonyos mutációt homozigóta formában hordozó vagy éppen egy adott fehérjét túltermelő sejteket kontroll sejtek vesznek körül. A mozaik analízis nem csak az egyébként a szervezet szintjén letalitást okozó mutációk vizsgálatát teszi lehetővé, hanem az egyazon szöveten belül elhelyezkedő, egymással szomszédos kontroll és genetikailag manipulált sejtek összehasonlítása a biológiai rendszerekre egyébként igen jellemző variabilitást is nagyrészt kiküszöböli.

A muslica teljes átalakulással fejlődő rovar, amely a metamorfózis során lárvából kifejlett adulttá alakul (8.4. ábra).

A rajz az ecetmuslica életciklusát ábrázolja egy kör mentén. Legfelül, 12 óránál, az imágóból indul a körfolyamat az óra mutatójával megegyező irányban, az embrió, lárva és bábállapotokon át.

8.4. ábra A Drosophila melanogaster életciklusa Az ecetmuslica teljes átalakulással fejlődő rovar, amely a metamorfózis során lárvából kifejlett adulttá alakul. A megtermékenyülést követően a pete burkán belül zajlik le körülbelül egy nap alatt az embriogenezis. A kikelést követően 3 lárvastádiumot különíthetünk el (L1, L2, L3). Az harmadik lárvastádiumot két részre oszthatjuk: táplálkozó (F, feeding) és vándorló (W, wandering) szakaszra. A L3W lárvák száraz helyet keresve vándorolnak, majd ezt követi a puparium (előbáb) kialakulása. A metamorfózis folyamata során a lárvából 4 nap alatt kifejlett imágó alakul ki.

A petékből kikelő lárvák szélsőségesen alkalmazkodtak a rothadó gyümölcsben vagy hasonló táplálékban történő minél gyorsabb növekedéshez. A lárvát alkotó szövetek nagy része poliploidizálódik, így a citokinéziseket megspórolva hatalmasra nő. Például a májunkhoz és zsírszövetünkhöz hasonló zsírtest a lárvális fejlődés 4 napja alatt (L1-L3 stádiumok) tömegét mintegy 200-szorosára növeli. Ezek a szervek a rengeteg raktározott biomassza révén megfelelő raktárt biztosítanak a diploid sejtek részére éhezés vagy metamorfózis során. Ilyen körülmények közepette a zsírtesthez hasonló poliploid szövetekben döbbenetes mértékű autofág indukció figyelhető meg, amely a hemolimfába jutva biztosítja az imágót kialakító diploid szövetek táplálását külső tápanyag hiányában is. A nagymérvű éheztetési vagy fejlődési autofág válasz és a mozaik analízis kombinációja együttesen a muslicát kiváló modellállattá teszik az autofágia sejtszintű vizsgálatára. Emellett a féreg modellhez hasonlóan az autofágia fiziológiás jelentősége is tanulmányozható.

Az autofágia hormonális szabályozása

A muslica és a hasonló rovarok vedlésének és metamorfózisának szabályozása sokoldalúan és részletesen tanulmányozott folyamat (Riddiford, 1993). A vedlési hormon (ekdizon) egy szteránvázas molekula (8.5. ábra), szintje az egyes lárvastádiumok végén megemelkedik.

A vedlési hormon aktív formájának (20-hidroxi-ekdizon) térszerkezete fekete-fehérben.

8.5. ábra A vedlési hormon aktív formájának (20-hidroxi-ekdizon) szerkezete. Forrás: Wikipedia.

Amennyiben a juvenilis hormon szintje magas, akkor ez az ekdizon csúcs a következő lárvastádiumba vezető vedlést fogja kiváltani. Az utolsó (muslicáknál a harmadik) lárvastádium során azonban a juvenilis hormon szintje lecsökken, és ilyenkor a magas ekdizon szint a metamorfózis megkezdését okozza. Első lépésben egy enyhe ekdizonszint emelkedés váltja ki az addig táplálkozó állatok viselkedésének megváltozását: vándorolni kezdenek. A vándorlás célja hogy megfelelően száraz helyet találjon magának az állat a bábozódáshoz, és így megkönnyítse a kifejlett imágó kikelését. A vándorló viselkedést kiváltó ekdizon csúcs indukálja a lárvális zsírtest és bél autofágiáját már a bebábozódás előtt lepkefélék lárváiban (Sass és Kovacs, 1975). Drosophilaesetén ez nagyjából 108 órával a peterakást követően, a 3. lárvastádium vége felé történik meg (Rusten és mtsai, 2004). Egy következő, nagyságrenddel magasabb ekdizonszint emelkedés hatására 120 óránál következik be a pupárium formálódás, mely az előbáb (prepupa) stádium kezdete. 12 óra múlva egy újabb ekdizon csúcs váltja ki a tulajdonképpeni vedlésnek tekinthető változást, és innentől beszélünk a tulajdonképpeni bábállapotról (pupa).

A vándorlás kezdetén a poliploid szövetekben megfigyelhető autofág indukció már korábban is kiváltható éhezéssel. Ezt a laborban a kb. 80-90 órás lárvák 20%-os cukoroldatba helyezésével a legkönnyebb kísérletesen vizsgálni, ugyanis ebben a tömény oldatban a lárvák nem süllyednek el, így sem a megfulladás, sem pedig a szétmászás nem okoz problémát. Megjegyzendő, hogy az állati szervezetek igen jelentős pufferkapacitással bírnak a tápanyagokra nézve, így a vérben vagy hemolimfában keringő aminosavak mennyisége ilyen körülmények közepette sem csökken drasztikusan. Az élesztősejtekkel ellentétben az autofág indukció döntően hormonális változások révén zajlik. Mind az éhezés, mind pedig a vándorlást kiváltó ekdizon csúcs eredménye az lesz, hogy a zsírtest sejtekben inaktiválódik az inzulin receptor (InR) szabályozta sejtnövekedési útvonal, mivel az agy pars intercerebralis részében található neuroszekréciós sejtek kevesebb inzulin-szerű növekedési faktort (IGF, insulin-like growth factor) szekretálnak. Kövessük végig hogy hogyan működik ez a jelátviteli út!

Az inzulin/PI3K/AKT és TOR jelátviteli utak szerepe

Az InR a receptor tirozin kinázok családjába sorolható, amikor aktív akkor foszforilálja az inzulin receptor szubsztrát (IRS) fehérjét. Az IRS ennek hatására köti és aktiválja az I. osztályba tartozó PI3K lipid kinázt. Fontos megjegyezni hogy ez különbözik a III. osztályba tartozó Vps34-től, amely a legősibbnek tekinthető, már élesztőben is jelen van. Az aktiválódott I. osztályú PI3K szubsztrátja is más, ez ugyanis a plazmamembránban található foszfatidil-inozitol 4,5-bisz-foszfátot alakítja foszfatidil-inozitol 3,4,5-trisz-foszfáttá (PIP3). A PIP3 foszfolipidhez specifikusan kötő doménnel rendelkező fehérjék (ilyen az ún. PH domén) lesznek ennek a másodlagos hírvivő anyagnak az effektorai. Elsősorban a PDK1 (foszfolipid-dependens kináz), amely az AKT szerin-treonin kinázt fogja aktiválni. Az AKT PDK1 általi foszforiláció mellett szintén hordoz PH domént, tehát ugyanazt a foszfolipidet fogja kötni a plazmambránban. Az aktív AKT serkenti a sejtnövekedést és gátolja az apoptózist, továbbá a TOR jelátvitel aktivitását is növelni tudja (8.6. ábra).

Az ábra az Akt kináz szabályozását és hatásait mutatja be egy folyamatábrán, ahol a gátló kapcsolatok piros nyíllal, a serkentőek zöld színű nyíllal vannak ábrázolva.

8.6. ábra Az Akt kináz szabályozása és hatásai. A foszfatidil inozitol 3 kináz (PI3K) a plazmamembránban található foszfatidil-inozitol 4,5-bisz-foszfátot (PIP2) alakítja foszfatidil-inozitol 3,4,5-trisz-foszfáttá (PIP3). A folyamat reverzibilis, a PTEN (phosphatase és tensin homolog) a PIP3 PIP2-vé való visszaalakulását katalizálja. A PDK1 (foszfolipid-dependens kináz) foszforilálja és így serkenti az Akt-ot, aktiválásához viszont PIP3 kötés is szükséges. Az aktív Akt serkenti a proliferációt, túlélést és migrációt (zöld nyilak), és gátolja a TSC1/2 komplexet (piros nyíl). Ennek hatására az mTOR aktivitása is nő, ami szintén serkenti a sejtnövekedést és a hipertrófiát. Pircs Karolina ábrája.

A TOR elnevezése a target of rapamycin rövidítése. A rapamycin (más néven sirolimus) egy makrolid típusú hatóanyag, melyet gombaellenes és immunszuppresszáns (például szervátültetésnél a kilökődést megakadályozó) kezelésekre, újabban pedig rákellenes szerként használnak. Eredetileg egy Húsvét-szigetekről (Rapa Nui, innen ered a rapamycin név) származó talajmintában fedezték fel, a Streptomyces hygroscopius baktériumfaj termeli a vele kompetícióban álló gombák térnyerésének megakadályozására. A sejtekbe jutva a rapamicin az FKBP12 (FK506-binding protein of 12 kDa) alkot komplexet, és együtt a TOR kinázhoz kötődve inaktiválják azt. A TOR szerin-treonin kináz az egyik legjelentősebb jelátviteli csomópont az eukarióta sejtekben, ugyanis a sejt energiaszintjét, az aminosavak mennyiségét és többsejtűekben a különféle növekedési faktorok jeleit integrálja (8.7. ábra).

A bal oldalon a TORC1 komplex látható (az egyes alegységek: kék a TOR, piros a GβL, zöld a Raptor), zöld nyíllal ábrázolva a serkentő, pirossal pedig a gátló folyamatokat. A jobb oldalon helyezkedik el a TORC2 (az egyes alegységek: kék a TOR, piros a GβL, sárga a Rictor) és a működését befolyásoló tényezők fekete nyíllal összekötve.

8.7. ábra A TORC1 és TORC2 komplexek felépítése, szabályozódása és hatásaik A növekedési faktorok, glükóz, aminosavak és egyéb tápanyagok serkentik a TORC1 komplex működését. A rapamycin és különböző stresszhatások viszont gátolják a TORC1-et. Az aktív TORC1 gátolja az autofágiát, serkenti a sejtosztódást, a fehérjeszintézist és bizonyos gének transzkripcióját. A TORC2 működését főleg növekedési faktorok befolyásolják, és legfőképpen a citoszkeletonra hat. A TORC1 és a TORC2 komplexek közötti különbséget a Raptor vagy Rictor alegység jelenléte határozza meg. Nagy Péter ábrája.

Élesztőben két homológ gén (TOR1 és TOR2) létezik, de a TOR2 funkciója eltér, citoszkeletális változásokat szabályoz. Magasabbrendűekben ugyan csak egy TOR gén található, viszont itt is két fehérjekomplexet képez: mTORC1 (mammalian or mechanistic TOR complex 1) és mTORC2, az élesztőhöz hasonló funkciókkal. Megjegyzendő hogy rapamicinre csak az mTORC1 érzékeny. A fő különbség az komplexek összetételében az, hogy az mTORC1 egyik alegysége, a raptor (rapamycin-sensitive companion of TOR) helyett az mTORC2 esetén a rictor (rapamycin-insensitive companion of TOR) fehérjét találjuk. A TOR-t több kis GTPáz fehérje is aktiválja, ezek egyike a Rheb. A fent említett AKT a TOR aktivitását úgy képes serkenti, hogy a TSC1-TSC2 (tuberous sclerosis 1, 2) komplexet foszforilálva gátolja annak Rheb-re kifejtett GTPáz aktivátor működését, tehát a Rheb így több ideig lesz aktív, mielőtt GTP-t hidrolizálna.

A TOR fő kimenetei közé tartozik a transzláció serkentése és az autofágia gátlása. A TOR szubsztrátja például az S6K (S6 kináz), amely így aktiválódva a riboszóma kis alegységének 6. számú fehérjéjét foszforilálja, ezáltal serkenti a transzlációt. Egy másik TOR szubsztrát a 4EBP (eIF-4E binding protein), ami a 4E jelű transzlációs iníciációs faktort kötve gátolja a fehérjeszintézist. A 4EBP TOR által történő foszforilációja megakadályozza az eIF-4E-hez történő kötését, azaz kikapcsolja az iníciáció gátlást. A TOR itt nevesített harmadik szubszrátja pedig az Atg1 kináz, amelyet inaktivál. Az éhezés, vagy magasabb rendűeknél a növekedési faktorok megvonása a fentiekkel ellentétes folymatokhoz vezet, tehát transzláció gátlást és autofág indukciót okoz (8.8. ábra).

Az mTORC1 komplex alegységei: maga az mTOR barackszínű, a Deptor zöld, az mLST8 kék, a Raptor sárga és középen helyezkedik el, míg a PRAS40 szintén sárga, de jobb oldalon található. Az mTORC1 által szabályozott folyamatokhoz fekete serkentő és gátló nyilak mutatnak.

8.8. ábra Az aktív emlős mTORC1 által szabályozott legfontosabb folyamatok. Az mTORC1 5 alegységből épül fel: az mTOR-ból, a Raptorból, a Deptorból, a PRAS40-ből és az mLST8-ból. Az mTORC1 serkenti a riboszómák biogenezisét és bizonyos gének transzkripcióját. Az S6 kinázt aktiválva és és a 4E-BP-t gátolva serkenti a fehérjeszintézist és metabolizmust. Az mTORC1 többek között az Atg1 foszforilációja révén gátolja az autofágiát. Csikós György ábrája.

Említésre érdemes, hogy a legújabb eredmények alapján az mTORC1 a lizoszómákhoz kötődve aktív, amihez egy másik, Rag típusú GTPáz általi aktiváció is szükséges. Éhezés során a TOR inaktiválásra kerül és így indukálódik az autofágia. Ennek eredményeképpen az autolizoszómális lebontás révén rengeteg hasznos alapanyag fog újrahasznosulni. Ezek viszont képesek a TOR-t reaktiválni, vagyis így egy negatív visszacsatolással szabályozódhat le az autofág indukció. Feltételezik, hogy a TOR aktivitását valamiképpen a lizoszómákban található, illetve onnan kijutó aminosavak mennyisége befolyásolja (8.9. ábra).

Az ábra fekete-fehér. Az autofagoszómák a kép bal oldalán kettős membránnal határolt kör alakú képletek. Az mTORC1 egy középen elhelyezkedő szürke rombusz. A lizoszóma az ábra jobb oldalán helyezkedik el, a felszínén két vastag fekete vonallal jelzett protonpumpával.

8.9. ábra Feltételezések szerint a lizoszómákban található aminosavak mennyisége szabályozza a mTORC1 aktivitását. Az mTORC1 gátlása révén autofágia indukálódik, melynek során az autofagoszómák szállítják a citoplazmás fehérjéket és organellumokat a lizoszómákba. A vakuoláris (v-) ATPáz komplex biztosítja a fehérjék aminosavakra történő bontásához szükséges savas pH-t a lizoszómális proteázok számára. A lebontás során keletkező aminosavak aktiválják az v-ATPázhoz kötődő mTORC1-et, amely negatív visszacsatolási hurok révén a további autofagoszómák keletkezését gátolja. Forrás: Autophagy 2012; 8(12): 1875-6.

Az inzulin/PI3K/AKT és TOR jelátviteli rendszerek autofágiában játszott szerepét Thomas Neufeld kutatócsoportja elsők között igazolta Drosophila mozaik analízis révén (ezt illusztrálják a 8.10-8.11-8.12-8.13. ábrák).

A képen színes fluoreszcens mikroszkópos kép látható. A bal oldalon a háromcsatornás képen kék színnel jelzettek a sejtmagok, zöld színűek a GFP pozitív klónsejtek és pirossal jelölt az mCherry-Atg8a. A jobb oldalon fekete-fehérben csak a piros csatorna van kiemelve, a klónsejtek sárgával körbe vannak rajzolva és jól látszanak benne az mCherry-Atg8a pöttyök.

8.10. ábra Az Akt csendesítésének hatása az autofágiára. Jól táplált Drosophila lárvák zsírtestsejtjeiben a zöld (GFP pozitív) Akt géncsendesített klónsejtekben megnövekszik az mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúrák mennyisége a szomszédos kontroll sejtekhez képest, ami megnövekedett autofág aktivitásra utal. Jól látható, hogy a szomszédos kontroll sejtekhez képest jelentős mértékben lecsökkent az Akt géncsendesített klónsejtek mérete is. Piros: mCherry-Atg8a, zöld: GFP, kék: sejtmag. Nagy Péter ábrája.

A képen színes fluoreszcens mikroszkópos kép látható. A bal oldalon a háromcsatornás képen kék színnel jelzettek a sejtmagok, zöld színűek a GFP pozitív klónsejtek és pirossal jelölt az mCherry-Atg8a. A jobb oldalon fekete-fehérben csak a piros csatorna van kiemelve, a klónsejtek sárgával körbe vannak rajzolva és jól látszanak benne az mCherry-Atg8a pöttyök.

8.11. ábra A TOR géncsendesítés hatása az autofágiára. Jól táplált Drosophila lárvák zsírtestsejtjeiben a zöld (GFP pozitív) TOR géncsendesített klónsejtekben megnövekszik az mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúrák mennyisége a szomszédos kontroll sejtekhez képest, ami autofág indukcióra utal. Vegyük észre hogy a kontroll sejtekhez képest jelentős mértékben lecsökken a TOR géncsendesített klónsejtek mérete is. Piros: mCherry-Atg8a, zöld: GFP, kék: sejtmag. Nagy Péter ábrája.

A képen színes fluoreszcens mikroszkópos kép látható. A bal oldalon a háromcsatornás képen kék színnel jelzettek a sejtmagok, zöld színűek a GFP pozitív klónsejtek és pirossal jelölt az mCherry-Atg8a. A jobb oldalon fekete-fehérben csak a piros csatorna van kiemelve, a klónsejtek sárgával körbe vannak rajzolva és jól látszik, hogy a környező sejtekhez képest nincs mCherry-Atg8a pozitív pötty sincs a klónsejtekben.

8.12. ábra A PI3K túltermeltetésének hatása az autofágiára. Éheztetett Drosophila lárvák zsírtestsejtjeiben a zöld (GFP pozitív), PI3K-t túltermelő klónsejtekben szinte teljes mértékben gátolt az mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúrák mennyisége a szomszédos kontroll sejtekhez képest, ami az autofág válasz hiányára utal. Jól látható, hogy a környező kontroll sejtekhez képest megnő a PI3K-t overexpresszáló klónsejtek mérete is. Piros: mCherry-Atg8a, zöld: GFP, kék: sejtmag. Nagy Péter ábrája.

A képen színes fluoreszcens mikroszkópos kép látható. A bal oldalon a háromcsatornás képen kék színnel jelzettek a sejtmagok, zöld színűek a GFP pozitív klónsejtek és pirossal jelölt az mCherry-Atg8a. A jobb oldalon fekete-fehérben csak a piros csatorna van kiemelve, a klónsejtek sárgával körbe vannak rajzolva és jól látszik, hogy a környező sejtekhez képest nincs mCherry-Atg8a pozitív pötty sincs a klónsejtekben.

8.13. ábra A Rheb túltermeltetésének hatása az autofágiára. Éheztetett Drosophila lárvák zsírtestsejtjeiben a zöld (GFP pozitív), Rheb-et túltermelő klónsejtekben nem láthatóak mCherry-Atg8a pozitív struktúrák a szomszédos kontroll sejtekkel szemben, ami gátolt autofág válaszra utal. A kontroll sejtekhez képest ebben az esetben is megnő a Rheb-et overexpresszáló klónsejtek mérete. Piros: mCherry-Atg8a, zöld: GFP, kék: sejtmag. Nagy Péter ábrája.

Ezek a folyamatok az állati sejtekben evolúciósan konzervált útvonalak (Scott és mtsai, 2004), emiatt kerültek ebben a fejezetben részletes leírásra.

Az autofagoszóma kialakulása és érésének élettani jelentősége

Az autofágia normális élethosszt és különféle sejtkárosító anyagok (mint például az oxidációs stressz) elleni hatékony védekezést befolyásoló szerepét Drosophila kísérletek is alátámasztják. Az Atg7 mutáns imágók fele például 30 napos korukra elpusztul, míg a kontroll állatoknál ez 42 napnak adódik (Juhasz és mtsai, 2007). Az oxidatív ágensekkel (parakvat vagy hidrogén-peroxid) történő kezelésre is érzékenyebbek ezek a mutánsok, feltételezhetően azért mert az ezen szerek által nagy mértékben károsodott fehérjék hatékony lebontásához az autofágia is hozzájárul. Különösen szembeötlő hogy az Atg7 mutáns muslicák nem képesek normálisan mozogni: repülési vagy mászási képességük koruk előrehaladtával drámaian lecsökken. Agyukban 30 napos korukra igen kiterjedt sejtpusztulás figyelhető meg, és mind biokémiai, mind ultrastruktúrális vizsgálatokkal kimutatható az ubiquitinilált fehérjeaggregátumok felhalmozódása (8.14-8.15-8.16. ábra).

A Western blot-on 5 oszlop különíthető el. Alul helyezkednek el a futtatáshoz kontrollként használt tubulin csíkok.

8.14. ábra Az ubiquitinilált fehérjék felhalmozódnak az Atg7 mutánsok agyában A western blot az ubiquitinilált nagy molekulasúlyú fehérjék felhalmozódását mutatja. Már a 3 napos imágók esetében is látható a kontrollhoz viszonyítva az ubiquitinilált fehérjék szintjének megnövekedése az Atg7 mutánsokban (1. és 2. oszlop) és ez az eltérés még szembetűnőbb a 30 napos, öreg adultok esetében (3. és 4. oszlop). Az M (marker) alatti oszlopban szereplő számok jelzik a molekulasúlyokat kiloDaltonban kifejezve. A mintákhoz használt futtatási kontroll a tubulin volt. Juhász Gábor ábrája.

Az elektronmikroszkópos felvétel fekete-fehér.

8.15. ábra Vad típusú muslicák idegrendszerének ultrastruktúrája. A képen neuronok láthatók, melyek jellegzetesen nagy sejtmagvai körül található perikaryon régió mutatja be a normális, 30 napos imágók agyára jellemző morfológiát. Juhász Gábor felvétele.

Az elektronmikroszkópos felvétel fekete-fehér.

8.16. ábra 30 napos Atg7 mutáns muslicák idegrendszerének ultrastruktúrája. A képen látható neuronok citoplazmájában számos fehérjeaggregátum látható (egy részük nyilakkal van jelölve). Ilyenk kóros inkluziós testeket kontroll állatok agyában nem találunk. Juhász Gábor felvétele.

Mivel hasonló fenotípusokat találtak idegsejtspecifikus Atg7 vagy Atg5 deléciót hordozó génkiütött egereknél is, ezen vizsgálatok alapján elmondható, hogy az ubiquitin-proteaszóma rendszer mellett az autofágia is szükséges ezen lebontásra szánt fehérjék hatékony eliminálásához. Az utóbbi évek kutatásai során kiderült hogy ebben a folyamatban specifikus, ubiquitint és Atg8 homológokat egyaránt kötni képes autofág receptor fehérjék szerepelnek (lásd később a szelektív autofágiáról szóló résznél).

A legújabb áttörést az autofagoszómák érése kapcsán Drosophila és humán sejttenyészeti adatok szolgáltatták (Itakura és mtsai, 2012; Takats és mtsai, 2013). Mivel a vezikulafúziók többségét SNARE (SNAP [Soluble NSF Attachment Protein] Receptor) fehérjék alkotta komplexek mediálják, ezért feltételezhető volt hogy az autofagoszómák és lizoszómák fúziójában is ilyen típusú fehérjék szerepelnek. A fúzió során három Q SNARE (Qa, b, c) és egy R SNARE alkot komplexet (a Q és R a már összeállt komplexben meghatározott helyet elfoglaló glutamin és arginin aminosavoldallácokra utal). Az élesztő sejtek esetén leírt, az autofagoszóma és a vakuólum fúziójában szereplő SNARE mechanizmus nem konzervált, valamint több adat is arra utal, hogy állati sejtekben az autofagoszómák elsősorban először késői endoszómákkal és nem feltétlenül közvetlenül lizoszómákkal egyesülnek. Kiderült hogy mind humán, mind pedig muslica sejtek esetén a Qa SNARE Syntaxin 17 kerül a már kialakult autofagoszóma külső membránjába, egyelőre még nem ismert módon. A Syntaxin 17 köti a SNAP29 (Drosophila-ban ubisnap) fehérjét, ami két SNARE domént (Qbc) hordoz, viszont a legtöbb SNARE-rel ellentétben nincs transzmembrán doménje. Ezek együttesen fogják a késői endoszómák és lizoszómák membránjában elhelyezkedő VAMP fehérjékkel (VAMP7 Drosophila és VAMP8 humán sejtek esetén, R SNARE) kialakítani a fúziót mediáló SNARE komplexet. A Syntaxin 17 mutáns imágók a kikelést követően néhány napon belül elpusztulnak, és többek között idegsejtjeikben is autofagoszómák nagymérvű felhalmozódását és az autolizoszómák hiányát tapasztalták (8.17. ábra).

Az elektronmikroszkópos felvétel fekete-fehér.

8.17. ábra Autofagoszómák felhalmozódása Syntaxin 17 mutáns, 2 napos imágók idegrendszerében. A képen látható neuronok citoplazmájának nagy részét kettős membránnal határolt autofagoszómák töltik meg, mivel késői endoszómákkal és lizoszómákkal fúzionálni nem képesek a Syntaxin 17 hiányában. Juhász Gábor felvétele.

Mivel mászási és repülési képességeik is jelentősen elmaradtak a kontroll állatokétól, ezek az adatok összeségében arra utalnak, hogy nem csak az autofágia korai lépései, hanem a már szekvesztrált citoplazmarészlet autofág lebontása is esszenciális.

Az autofág fehérjekomplexek működése állati sejtekben

A gerinctelen és emlős sejtekre is jellemző, az autofágia molekuláris mechanizmusát összefoglaló 8.18. ábra a Drosophila Atg fehérjék példáján mutatja be működésüket az autofágia egyes morfológiai lépései során.

Az autofágia mechanizmusának színes folyamatábrája. Egy világosbarna téglalapban, 2 oszlopban vannak feltüntetve az ábramagyarázatok. A bal oldali oszlop legfölső tagja egy az ábrákon barnával jelzett molekula, az Atg18a. Alatta a lila pálcikák jelentik az Atg9-et, a fekete kis körök az Atg8a-t, a zöld pálcikák pedig a Lamp1-et. A jobb oldali oszlopban lévő tagok felülről lefelé haladva: a fekete félkör a kettős lipidréteg, a zöld nyíl az aktiválás, a piros a gátlás, a piros hengeres pálcika pedig a protonpumpa. Bal oldalon a sejtmembránban egy fekete színű inzulin-receptor helyezkedik el. Utána következik a jelátvitel, ahol a folyamatokban zöld nyíllal jelzett az aktiválás, pirossal a gátlás. Ezután vannak ábrázolva az autofág struktúrák és a folyamatokat szabályozó komplexek. A struktúrák balról jobbra haladva a legfelső sorban: pre-autofág struktúra a felszínén lila pálcikákkal, egy fagofór egy mitokondrium körül, membránjában lila pálcikákkal és fekete körökkel és a kép oldalán egy a mitokondriumot körbezáró autofagoszóma, kettős lipidréteggel, lila és barna pálcikákkal, valamint fekete körökkel a membránjában. Ez a kör alakú struktúra egyesül egy zöld és piros hengeres pálcikákat tartalmazó lizoszómával, létrehozva az ábra bal alsó sarkában található autolizoszómát. Ennek felszínén jelen vannak a zöld, piros és lila pálcikák, valamint belsejében látható egy emésztődő mitokondrium, lila és barna pálcikákkal egyetemben.

8.18. ábra Az autofágia mechanizmusa Növekedési faktorok jelenlétében, például az inzulin-receptor közvetített módon aktiválodik az Akt1, amely gátolja a TSC1/2 komplexet. Ebben az esetben a TOR kináz aktitása megnő, és gátolja az autofágia iníciációjában központi szerepet játszó Atg1 kináz komplexet. Éhezés esetén a TOR gátlódik, ezáltal aktiválódik az autofágia folyamata. Az Atg1-kináz komplex (Atg1, Atg13, Atg101, FIP200) aktiválódása mellett az Atg9 membrán transzport fehérje szállít vezikulákat a létrejövő pre-autofág struktúrákhoz. A fagofór (izoláló membrán) kialakulásához szükséges a Vps34 lipid kináz komplex (Atg6, Atg14, Vps15, Vps34) működése. A fagofór érése és növekedése során körbeveszi a citoplazma egyes elemeit. Széleinek hóziója révén bezárul, és így létrehoz egy kettős membránnal határolt vezikulát. Ezt autofagoszómának nevezzük, melynek membránjában az Atg8a mellett esetleg még jelen van az Atg18a és az Atg9 is. Az éréshez és az autofagoszóma kialakulásához szükséges a PI3P effektor Atg18a, Atg2 és az ubiquitin-szerű konjugációs rendszerek (Atg3, Atg5, Atg7, Atg8a, Atg10, Atg12, Atg16) működése. Az autofagoszóma késői endoszómákkal és lizoszómákkal történő fúziójához szükséges a HOPS komplex jelenléte és megfelelő SNARE fehérjék (Syx17, SNAP29, VAMP7) működése. A lizoszóma membránjában található, erősen glikozilált LAMP fehérjék a membránt védik a savas hidrolázoktól. A lizoszómális protonpumpa (v-ATPáz), melyet a Vha fehérjék építenek fel, alakítja ki a lumenre jellemző savas pH-t. Az autolizoszómában működő lebontó enzimek (savas hidrolázok) hatására a bekebelezett anyag építőköveire bomlik. Nagy Péter ábrája.

Ellenőrző kérdések

  1. Milyen hatása van az élethosszra az autofág gének funkcióvesztésének férgekben és muslicákban?

  2. Mik azok a P granulumok, és miért csak a fejlődő C. elegans embriók csírasejtjeiben vannak jelen?

  3. Milyen hormonok és hogyan szabályozzák az autofágiát a teljes átalakulással fejlődő rovarok metamorfózisa során?

  4. Milyen úton és hogyan hatnak az inzulin-szerű növekedési faktorok (IGF) az autofágiára és a sejtnövekedésre?

  5. Milyen molekuláris mechanizmus biztosítja az autofagoszómák autolizoszómává alakulását?

Irodalom

Itakura, E., Kishi-Itakura, C. és Mizushima, N. (2012). The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell 151, 1256-1269.

Juhasz, G., Erdi, B., Sass, M. és Neufeld, T. P. (2007). Atg7-dependent autophagy promotes neuronal health, stress tolerance, and longevity but is dispensable for metamorphosis in Drosophila. Genes Dev. 21, 3061-3066.

Melendez, A., Talloczy, Z., Seaman, M., Eskelinen, E. L., Hall, D. H. és Levine, B. (2003). Autophagy genes are essential for dauer development and life-span extension in C. elegans. Science 301, 1387-1391.

Riddiford, L. M. (1993). Hormone receptors and the regulation of insect metamorphosis. Receptor 3, 203-209.

Rusten, T. E., Lindmo, K., Juhasz, G., Sass, M., Seglen, P. O., Brech, A. és Stenmark, H. (2004). Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Dev. Cell7, 179-192.

Sass, M. és Kovacs, J. (1975). Ecdysterone and an analogue of juvenile hormone on the autophagy in the cells of fat body of mamestra brassicae. Acta Biol Acad Sci Hung26, 189-196.

Scott, R. C., Schuldiner, O. és Neufeld, T. P. (2004). Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Dev. Cell 7, 167-178.

Takats, S., Nagy, P., Varga, A., Pircs, K., Karpati, M., Varga, K., Kovacs, A. L., Hegedus, K. és Juhasz, G. (2013). Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. J. Cell Biol.201, 531-539.

Tian, Y., Li, Z., Hu, W., Ren, H., Tian, E., Zhao, Y., Lu, Q., Huang, X., Yang, P., Li, X. és mtsai (2010). C. elegans screen identifies autophagy genes specific to multicellular organisms. Cell 141, 1042-1055.

Tóth, M. L., Sigmond, T., Borsos, E., Barna, J., Erdelyi, P., Takacs-Vellai, K., Orosz, L., Kovacs, A. L., Csikos, G., Sass, M. és mtsai (2008). Longevity pathways converge on autophagy genes to regulate life span in Caenorhabditis elegans. Autophagy 4, 330-338.