9. Az autofágia kutatás során jelenleg leggyakrabban alkalmazott módszerek élesztő, gerinctelen és emlős rendszerekben

Az Atg fehérjék hierarchiája

Az Atg géntermékek működését taglaló fejezetben leírtak alapján elmondható, hogy ezek a fehérjék funkcionális csoportokba rendezhetők, és egymásutániságuk nagyjából meghatározható. Persze nem fejthetőek lineáris sorba, hiszen egy egymással bonyolult kapcsolatokkal rendelkező hálózatként működnek, nem pedig úgy mint például a glikolízis során az egymást követő enzimek. Az eddig idézett publikációkban az Atg gének hierarchiáját döntően lokalizációs vizsgálatokkal próbálták meghatározni (Suzuki és mtsai, 2007; Itakura és Mizushima, 2010). Az Atg fehérjék többsége legalábbis átmenetileg megtalálható a képződő fagofór területén, így a fluoreszcens riporter fehérjék (ilyen például az adott fehérjéhez géntechnológiai módszerekkel fúzionált GFP [green fluorescent protein] vagy mCherry), vagy immunofluoreszcens festések alapján az endogén fehérje specifikus, a fluoreszcens mikroszkópban pöttyöket alkotó elhelyezkedése vizsgálható, és az egyéb megfelelő PAS markerekkel történő kolokalizációja meghatározható. Ilyen marker élesztőben a pro-API aggregátum. Magasabb rendőekben a p62 és más szelektív autofág szállítmányok (angolul cargo) használhatók az Atg fehérjéket is hordozó PAS azonosítására. Amennyiben az általunk vizsgált gén hiányában ez a specifikus lokalizáció eltűnik, akkor feltehető, hogy a (riporter) fehérje megfelelő célbajutásához az adott gén működése szükséges. Fontos kiemelni, hogy ez a módszer is egyfajta episztázis analízisnek tekinthető, bár sok szempontból különbözik a klasszikus, kettős mutánsokra építő genetikai vizsgálatoktól.

Az eddigi élesztő és emlős sejttenyészeti vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy az Atg1 kináz komplex aktiválódik először (legalábbis éhezés esetén), és ezt követik a lipid kináz komplex és effektorai. Emlős sejttenyészeti sejtekben ezek a fehérjék előszeretettel lokalizálnak a korábban már tárgyalt omegaszómákhoz. Az Atg8-nak a képződő fagofóron való megjelenése viszonylag késői esemény, amihez az Atg2 és VMP1 gének kivételével minden eddig ismert központi autofág gén működése szükséges. Központi autofág gén alatt az egyszerűség kedvéért azokat a géneket értjük, melyek hiányában a megfelelő stimulus által indukált autofagoszóma képződés gátolt, és az adott géntermék a fagofór keletkezésében közvetlen szerepet játszik (tehát kiesése nem egy felsőbb szabályozási útvonal, mondjuk a növekedési jelátvitel aktiválása révén fejti ki autofágia-gátló hatását).

A következő fejezetekben áttekintjük az autofágia kutatásában jelenleg leggyakrabban használt módszereket, melyek alkalmazhatóak az élesztőtől az emberi sejtekig.

Fluoreszcens és konfokális mikroszkópia

Az előző bekezdésben említett lokalizációs vizsgálatokhoz szükséges a megfelelő endogén fehérjét felismerő ellenanyag (melyet fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyag segítségével teszünk láthatóvá), vagy specifikus riporter fehérje kifejeztetése az adott sejtben vagy élőlényben. Az első megközelítés előnye hogy jobban reprezentálhatja a valós viszonyokat, bár a immunjelöléshez szükséges fixálás okozhat műterméket. Az utóbbi megközelítés hátránya, hogy rendszerint overepresszált fúziós fehérjéken alapul, ami gyakran nem reprezentálja megfelelően az endogén fehérje kifejeződési szintjét és lokalizációját. Nagy előnye viszont, hogy lehetővé teszi mikroszkópos videók készítését, ami betekintést enged a folyamat dinamikájába.

Az autofágia vizsgálatok során messze a leggyakrabban használt marker fehérje az Atg8 és homológjai. Emlősökben több géncsalád is ide tartozik, közülük az LC3 nevezetű fehérjét érdemes kiemelni. Ezeket a riportereket vagy immunjelöléseket az esetek döntő többségében arra használják, hogy a mikroszkópban látható, adott területre eső vagy sejtenkénti átlagos pöttyszámot meghatározzák (9.1. és-9.2. ábra).

Fénymikroszkópos felvétel egy Drosophila lárva zsírtestjéről. A bal oldalon a színes felvétel látható kék sejtmagokkal, piros Atg8 és zöld GFP jelöléssel. A bal oldali ábra fekete-fehér, csak az Atg8 jelölést mutatja a jobb láthatóság érdekében. Itt a géncsendesített sejtek sárgával körberajzoltak.

9.1. ábra Endogén Atg8 immunofluoreszcens jelölése. Jól táplált L3 stádiumú lárvák zsírtestsejtjeiben a Syntaxin 17 géncsendesítés (mely csak a pöttyszerű eloszlást mutató GFP-t expresszáló sejtekben történik meg) az endogén Atg8-pozítív autofagoszómák felhalmozódásához vezet. Ez a jobb oldali panelen még szembetűnőbb, ez ugyanis csak az Atg8 immunfestés képét mutatja. A környező kontroll sejtekben ilyen Atg8 jelölést nem látunk. Piros: anti-Atg8, zöld: GFP, kék: sejtmag. Takáts Szabolcs felvétele.

Fénymikroszkópos képek emlős sejtekről, a felvételek fekete-fehérek. A bal oldalon 0 órás állapotban a sejtek autofluoreszciája ad hátterét, GFP-pozitív strukturákat alig találunk a sejtben. Jobb oldalon 2 órás éhezés után megjelennek nagy számban a GFP-pozitív, de itt fehér autofagoszómák.

9.2. ábra GFP-fúziós LC3 riporter vizsgálata. A GFP-LC3-at kifejező tenyésztett emlős sejtekben 2 órás éhezés hatására drasztikusan megnő a GFP-pozitív autofagoszómák száma a kontroll, jól táplált sejtekhez (0 óra) viszonyítva. Forrás: Mol. Biol. Cell 2004; 15 (3), 1101-1111.

Mivel az Atg8/LC3 fehérje döntően az autofagoszómákat jelöli, ezzel a módszerrel az autofagoszóma számot lehet megbecsülni(Kabeya és mtsai, 2000). Talán az egyik legfontosabb ezzel kapcsolatos kutatás során Noboru Mizushima vezetésével létrehoztak egy GFP-LC3 riportert kifejező transzgénikus egértörzset (Mizushima és mtsai, 2004). Ennek vizsgálatával leírták, hogy alapszinten a csecsemőmirigy és a szemlencse sejtjeire viszonylag sok GFP-LC3 pötty jellemző, és ezek száma 24 órás éhezés hatására nem változik. Ezzel ellentétben a máj, szívizom vagy musculus gastrocnemius éhezés során igen erőteljes GFP-LC3 pöttyszám növekedést, tehát autofág indukciót mutat.

Az Atg8/LC3 mellett egyéb Atg fehérje vagy szelektív szállítmány lokalizációját is lehet tanulmányozni a fenti jelölési módszerrel. Leggyakrabban az egyes komplexekből az Atg1/ULK fehérjét, Atg14-et, Atg9-et, Atg18-at, és az Atg16 vagy Atg5 fehérjéket vizsgálják (ez utóbbi kettőt fagofór markernek is tekintik, mivel az autofagoszóma létrejöttekor disszociálnak). Fontos azonban megemlíteni, hogy ezen Atg fehérjék lokalizációját leginkább az autofágia központi mechanizmusát célzó kutatásoknál vizsgálják.

A módszerek következő csoportja olyan vegyületek alkalmazásán alapul, amelyek a membránokon átdiffundálva a lizoszómák belsejébe kerülnek, ahol a savas kémhatás következtében protonálódnak (un. lizoszomotrop ágensek). Az így fellépő pozitív töltés megakadályozza kijutásukat, tehát a lizoszómák belsejében felhalmozódnak. Ezekre a vitális, élő sejteken alkalmazott festésekre egy példa a Lysotracker Red, amely egy pirosan fluoreszkáló vegyület. A Drosophila zsírtest vizsgálata során előszeretettel alkalmazzák (Scott és mtsai, 2004), mivel valamilyen okból kifolyólag a jól táplált állatok sejtjeiben levő lizoszómákat nem jelöli, csak az éhezés hatására képződő autolizoszómákat festi (9.3. és 9.4. ábra). Ennek oka lehet például az, hogy a lizoszómák ilyenkor aktiválódnak, és pH-juk éhezés hatására lecsökken.

Fénymikroszkópos felvétel egy Drosophila lárva zsírtestjéről. A felvétel színes, kék sejtmagokkal, a piros festék homogén hátteret képez.

9.3. ábra Jól táplált Drosophila lárva zsírteste, Lysotracker Red festéssel. A jól táplált állatok sejtjeiben levő lizoszómákat nem jelöli a pirosan fluoreszkáló festék, csak homogén hátteret látunk. Kárpáti Manuéla felvétele.

Fénymikroszkópos felvétel egy Drosophila lárva zsírtestjéről. A felvétel színes, kék sejtmagokkal. A piros festék élénk pöttyökként jeleníti meg a kialakult autolizoszómákat.

9.4. ábra Éheztetett Drosophila lárva zsírteste, Lysotracker Red festéssel. Az éheztetés hatására megjelenő autolizoszómákat jelöli a pirosan fluoreszkáló festék. Kárpáti Manuéla felvétele.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

Minden kétséget kizáróan ez a legrégebben, már az autofágia kutatás kezdeteitől alkalmazott metódus, de még ma is igen nagy jelentőségű. Felbontása révén ezzel a technikával közvetlenül vizsgálható a fagofór, az autofagoszóma és az autolizoszóma ultrastruktúrája, a határoló membránok felépítése stb (9.5-9.7. ábra).

Fekete-fehér elektronmikroszkópos felvétel. A szürke citoplazmában látható a kettős membránú fagofór, melynek membránjai között az üreg fehér.

9.5. ábra A fagofór elektronmikroszkópos morfológiája. A képen látható, résszerű ürege alapján könnyen felismerhető fagofór már majdnem teljesen körbezárult. Kovács Attila felvétele.

Fekete-fehér elektronmikroszkópos felvétel. A szürke citoplazmában láthatóak a kettős membránnal határolt autofagoszómák. Ezeknek a kettős membrán között kialakult tér miatt egy fehér gyűrű veszi körbe. A jobb oldalon lévő kutikula hullámos, csíkolt szerkezetet mutat.

9.6. ábra Autofagoszómák elektronmikroszkópos morfológiája. Syntaxin 17 mutáns muslica lárvák epidermisz sejtjeiben igen nagy számú, kettős membránnal határolt autofagoszóma (egy részüket nyílhegy jelöli) halmozódik fel. A kép jobb oldali részén a kutikula igen jellegzetes szerkezete látszik. Juhász Gábor felvétele.

Fekete-fehér elektronmikroszkópos felvétel. A szürke citoplazmában láthatóak az erősen elektrodenz, így fekete színű autolizoszómák. A mellette levő autofagoszómák a 9.6. ábrán leírtaknak felelnek meg, méretük sokkal kisebb, mint az autolizoszómáké.

9.7. ábra Autolizoszómák elektronmikroszkópos morfológiája. A vad típusú muslicalárvák zsírtest sejtjeiben éhezés hatására rengeteg heterogén beltartalmú autolizoszóma (nyilak) képződik. Az erős elektron denzitás a degradáció következménye. A nyílhegyek autofagoszómákra mutatnak. Forrás: Autophagy 2012: 8(7), 1124-35.

Fontos azonban hogy nem csak a bonyolult mintaelőkészítés és a mikroszkóp kezelése, hanem a látott struktúrák felismerése, megfelelő interpretálása is igen nagy gyakorlatot igényel. Az általánosan alkalmazott kémiai, glutáraldehiddel történő rögzítést követő víztelenítés és beágyazás egy igen jellegzetes műterméket okoz: a fagofór membránok, valamint az autofagoszóma külső és belső membránjai gyakran elválnak egymástól a biológiai minta eltérő mértékű zsugorodása miatt (Eskelinen és mtsai, 2011). A jelenség egyik oka az lehet, hogy ezek a membránok gyakorlatilag nem tartalmaznak transzmembrán fehérjéket, és a glutáraldehid elsősorban a fehérjék között létesít kovalens keresztkötéseket a rögzítés során, így a lipidekben gazdag sejtalkotók kevésbé jól őrződnek meg. Ez az üresnek tűnő tér viszont igen megkönnyíti az ilyen korai autofág struktúrák felismerését (Kovacs és mtsai, 2000).

Természetesen lehetséges ultrastrukturális szinten is immunjelölést alkalmazni. Ennek során a másodlagos ellenanyag nem fluoreszcensen jelölt, hanem apró (5-20 nanométer átmérőjű) aranyszemcséhez van kapcsolva. Az elektronmikroszkópos felvételeken ilyenkor az aranyszemcsék az ellenanyag által felismert fehérje (például az LC3 vagy a p62) helyét reprezentálják (9.8. ábra).

Fekete-fehér elektronmikroszkópos felvétel. A szürke, egyenetlen citoplazmában látható egy egységesebb, világos szürke színű, membránnal nem határolt fehérjeaggregátum. Ezen fekete pöttyökként jelennek meg a p62-specifikus aranyszemcsék.

9.8. ábra Elektronmikroszkópos immunjelölés. A képen az Atg7 mutáns muslica imágók agyában felhalmozódó fehérje aggregátum (nyíllal jelölve) látható, amit az endogén p62-re specifikus ellenanyagot jelölő aranyszemcsék is világosan azonosítanak. M, mitokondrium. Juhász Gábor felvétele.

Western blot

Ezzel a biokémiai módszerrel vizsgálható poliakrilamid gélelektroforézist követően a fehérjemintákban (általában sejtekből készült lizátumokban) az adott ellenanyag által jelölt fehérje jelenléte és expressziós szintje. Az esetek döntő többségében megint az Atg8/LC3 fehérjét alkalmazzák, köszönhetően annak, hogy autofág indukció során rendszerint megnő a lipidált, aktív, feltehetően autofagoszóma-asszociált Atg8/LC3 szintje (9.9. ábra).

Fekete-fehér, Western blotról készült felvétel. A kép felső részében anti-Atg8 jelölést láthatunk. A bal oldalon, táplálkozó állatokban az alsó lipidált Atg8-II szintje alacsony, itt halványabb a csík. A jobb oldalon, éhező állatokban az Atg8-II szintje megnő, erősebb csíkot kapunk. Az ábra alsó részében anti-tubulin jelölést láthatunk, ez kontrollkénr szolgál, hogy a fehérjék mennyisége összehasonlítható-e.

9.9. ábra Anti-Atg8 Western blot Drosophila lárvákból készült fehérjemintán. Az Atg8 lipidációjának hatására megnő a fehérje elektroforetikus mobilitása, és jól látszik, hogyaz éheztetéssel indukált autofágia során megemelkedik a lipidált Atg8-II tubulinhoz viszonyított szintje. Varga Ágnes felvétele.

Mivel a lipidáció megnöveli a fehérje elektroforetikus mobilitását, így ez a metódus alkalmas ezen változás kimutatására.

A módszer szintén alkalmas egyéb poszttranszlációs módosítások kimutatására is. Például az Atg fehérjék foszforilációs állapota változik az autofág indukció során, és ez az adott fehérje elektroforetikus mobilitását csökkenti (9.10. ábra).

Fekete-fehér, Western blotról készült felvétel. A minták sorrendje 0, 10, 30, 60, 120, 140 perces éhezés, tehát egy éhezési sor. Az ULK1 fehérje mennyisége és foszforilációs szintje is csökken, itt két csíkot láthatunk a blotton, az alsó kezdetben erősebb, mint a felső. A következő blot anti-Atg13 jelölést tartalmaz. A foszforilációs szint itt nő, a kezdeti egységes fekete csíkból elmosódott, vastag csík lesz. A következő 4E-BP1 blotton a fehérje kezdetben több, hiperfoszforilált csíkot ad, az éhezési sor végére azonban egy defoszforilált, nagyobb mobilitású, egységes fekete csíkot adó forma marad. A következő két blöot az S6K-P illetve S6K. Az alsóbb, S6K blotton nincsen szembetűnő változás, két csíkot egy foszforilált és egy defoszforilált fehérjét jelölő fekete csíkot látunk. A foszforilált formát jelölő blotton azonban szembetűnik, hogy az éhezési idő növekedésével nő a S6K-P fehérje mennyisége is. Az utolsó, LC3 fehérjét mutató blotton hasonló elrendeződést látunk, mint a 9.9. ábrán, éhezés hatására a lipidált LC3-II mennyisége megnő.

9.10. ábra Foszforiláció hatása a fehérjék elektroforetikus mobilitására. Éhezés (St, azaz starvation) hatására csökken a TOR szubsztrátjainak, azaz az ULK1, 4E-BP1 és S6K fehérjék foszforilációs szintje. Vegyük észre, hogy az ULK1 és 4E-BP1 fehérjék elektroforetikus mobilitása csökken, míg az S6K esetén csak a foszforilált formára specifikus (S6K-P) ellenanyag alapján szembetűnő a változás. Jól látszik, hogy az autofág indukció során a lipidált LC3-II mennyisége megnő. Forrás: Mol. Biol. Cell 2009: 20 (7) 1981-1991.

Ez persze nem egy igazán specifikus változás, hiszen egy fehérje igen sok, akár több tucat aminosav oldalláncán is képes foszforilálódni és defoszforilálódni, és ezen események eredője határozza meg a gélben történő migráció sebességét. Ideális esetben használhatóak olyan specifikus ellenanyagok, amelyek az adott fehérje megfelelő szakaszát csak megfelelő foszforilációs állapot esetén ismerik fel. Mivel azonban az Atg fehérjék szabályozásának ilyen szintű biokémiai jellemzése még gyerekcipőben jár, ezért jelenleg ilyen vizsgálatokra még nem nagyon van lehetőség.

Az Atg8/LC3 mellett a másik leggyakrabban alkamazott teszt azon alapul, hogy bizonyos specifikus autofág szubsztrátok, vagy másik kifejezéssel élve szállítmányok mennyisége az autofág lebontással fordítottan arányos. Erre a legjobb példa a szelektív autofágiáról szóló fejezetben részletesen tárgyalásra kerülő p62. Tehát a p62 mennyisége autofágia indukciójakor elvileg csökken, míg az autofágia gátlása drasztikusan megemeli a mennyiségét (9.11. ábra). Megjegyzendő, hogy ezek a fehérjék többféle funkciót is ellátnak, és expressziójuk gyakran transzkripciósan is szabályozódik, így nem feltétlenül csak az autofág lebontástól függ az adott fehérje mennyisége.

Fekete-fehér, Western blotról készült felvétel. 2 hetes imágó fejekből készült minták. A minták sorrendben vad típusú kontroll, Atg7 mutáns és Atg8a mutáns állatokból készültek. A felső, anti-p62 blotton a vad típusú állatokban halvány csíkot látunk, míg a Atg7 és Atg8 mutáns állatokban erős fekete csíkok jelennek meg. Az alsó blotton tubulin kontrollt láthatunk.

9.11. ábra Anti-p62 western blot Drosophila fejekből készült fehérje mintákon. A p62 felhalmozódik az Atg7 (7-) és Atg8a (8a-) mutáns imágók fejében a kontrollhoz (wt, azaz wild type) viszonyítva. Forrás: PLoS One. 2012;7(8):e44214.

Genetikai analízis

Az 1990-es évek közepétől induló módszer mára már klasszikus megközelítési módnak számít. A genetikai analízisre korábban már említett példákban az Atg gének hiányát vizsgálták. Ha például ilyenkor lecsökkent a vizsgált férgek vagy muslicák élethossza, akkor ebből nagy valószínűséggel (de nem teljes biztonsággal) arra lehet következtetni, hogy a változás az autofágia gátlása miatt következett be. Tulajdonképpen ebben rejlik az élesztőben felfedezett autofág gének egyik fő jelentősége, hiszen így nem csak leíró jellegű, az autofágia szintjét dokumentáló kutatásokat lehetett végezni, hanem lehetővé vált ok-okozati viszonyok felderítését célzó, azaz mechanisztikus kísérletek kivitelezése is. Fontos kiemelni azonban azt, hogy ez a módszer egyrészt indirekt, másrészt pedig feltételezi hogy az adott Atg gén valóban csak az autofágiában szerepel. Ez sajnos nem mindig mondható el, vagy előfordulhat az is, hogy egy adott gén szerepét egyéb folyamatokban azért nem írták le, mert egyszerűen még senki sem vizsgálta.

Gátlószerek alkalmazása

Már az 1960-as évektől alkalmaznak olyan kismolekulájú, a plazmamembránon átdiffundálni képes szereket, amelyek az autofág struktúrák megjelenését és a lebontás mértékét jellemzően befolyásolják. Mára már klasszikus autofágia indukáló szer a korábban említett rapamicin (9.12. ábra), amely a TOR gátlása révén fejti ki hatását. Hátránya viszont hogy nem specifikus az autofágiára, hiszen egyéb hatások mellett általános transzláció gátlást is okoz. A leggyakrabban alkalmazott autofágiát gátló szerek közé tartozik a 3-metiladenin (9.13. ábra), amely a foszfolipid kinázok specifikus inhibitora, így feltételezhetően a Vps34 gátlása révén hat az autofágiára. Emellett több olyan szer is ismert, amely a lizoszómára fejti ki hatását. Az élesztő esetén alkalmazott PMSF (9.14. ábra), vagy emlős sejtekben a leupeptin (9.15. ábra) gátolja bizonyos kritikus hidrolázok aktivitását, ami az autofág fehérjebontás csökkenéséhez vezet. A klorokvin (9.16. ábra) a Lysotracker Red-hez hasonlóan felhalmozódik a lizoszómákban, és egész egyszerűen neutralizálja, azaz a savas pH-t semleges felé tolja el. A vakuoláris H+ ATPázok gátlószerei (ilyen például a bafilomycin A1, 9.17. ábra) a savas pH-t létrehozó és fenntartó proton pumpa gátlásával éri el ugyanezt a hatást. A pH emelkedése ilyenkor a lizoszómában található savas hidrolázok aktivitását jelentősen lecsökkenti.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.12. ábra A rapamicin térszerkezete.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.13. ábra A 3-metiladenin térszerkezete.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.14. ábra A PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride) térszerkezete.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.15. ábra A leupeptin térszerkezete.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.16. ábra A klorokvin térszerkezete.

A térszerkezetet bemutató ábra fekete-fehér.

9.17. ábra A bafilomycin A1térszerkezete.

Ezen drogkezelések hátránya lehet az, hogy hatásuk nem specifikus az autofágiára nézve. Például a lizoszómális emésztés gátlása csökkenti a TOR kináz aktivitását a korábban már tárgyalt Rag GTPázokon keresztül, azaz nem csak az autofág lebontást gátolja hanem ezzel egyidejűleg az autofagoszóma keletkezés mértékét is megnövelheti (9.18. ábra).

Az ábra fekete-fehér. Rajta vázlatos autofagoszómák (kettős membránnal) és egy nagyobb lizoszóma látható. Vastag fekete színnel jelölt a v-ATPáz csatorna a lizoszóma membránjában, míg szürkével az MTORC1 komplex. A közük lévő aktiválásokat, gátlásokat nyilak jelzik.

9.18. ábra A lizoszómális lebontás gátlása a TOR komplexen keresztül befolyásolhatja az autofág indukciót. Alapesetben (A panel) az autofágia révén a lizszómában keletkező aminosavak reaktiválják a TOR komplexet, ami az autofágiát gátolja, így a folyamat idővel lecseng. A lizoszómális emésztés gátlása (B panel) a TOR inaktiválása révén kihathat az autofagoszómák keletkezésére, és a reaktivációt megakadályozza. Forrás: Autophagy 2012; 8(12): 1875-6.

Autofág fluxus vizsgálata

Az egyik legfontosabb kérdés az autofágia vizsgálata során az, hogy egy adott kezelés vagy genetikai manipuláció milyen hatással van az autofág lebontásra. A fent felsorolt módszerek többsége csak egy pillanatfelvételt szolgáltat a vizsgált folyamatról, és ezek alapján nem mindig egyértelmű a következtetés. Ha például egy adott kísérletben minden jel arra mutat hogy megnőtt az autofagoszómák száma, akkor ezt okozhatja korai indukció (több autofagoszóma keletkezés) vagy későbbi gátlás (ugyanannyi autofagoszóma keletkezik mint a kontroll sejtekben, de azok például nem fúzionálnak lizoszómákkal, ezért felhalmozódnak). Ezért mindig elegedhetetlen az autofág fluxus (azaz hogy mennyi anyag „folyik keresztül” az autofág útvonalon) vizsgálata. A folyamatot tehát lehetőség szerint teljes egészében kell vizsgálnunk, tehát a bemenet (autofagoszóma keletkezés) és a kimenet (autolizoszómális lebontás) mértékét és arányát is meg kell határoznunk.

Az egyik leggyakrabban alkalmazott technika a mikroszkópban látható Atg8/LC3 pöttyök számának, vagy western blot alapján a lipidált forma mennyiségének meghatározása lizoszómális lebontást gátló szer (mint a fent említett bafilomicin vagy klorokvin, vagy az E64 és pepsztatin kombinációja) nélkül és annak jelenlétében. Ezek a gátlószerek az autofág lebontást megakadályozzák, így megnövelik mind az Atg8/LC3 pöttyök számát, mind pedig a lipidált fehérjemennyiséget (9.19-9.21. ábrák).

Fénymikroszkópos felvétel egy Drosophila lárva zsírtestjéről. A bal oldalon a színes felvétel látható kék sejtmagokkal, piros mCherry-Atg8 jelöléssel. A bal oldali ábra fekete-fehér, csak az Atg8 jelölést mutatja. Mindkét képen elenyésző mennyiségű Atg8-pozitív struktúrát találunk.

9.19. ábra mCherry-Atg8a riportert expresszáló muslica lárvák zsírteste. Jól táplált állatokban az autofagoszómákat és autolizoszómákat jelölő mCherry-Atg8a riporter nagyon kevés pöttyöt mutat. Pircs Karolina felvétele.

Fénymikroszkópos felvétel egy Drosophila lárva zsírtestjéről. A bal oldalon a színes felvétel látható kék sejtmagokkal, piros mCherry-Atg8 jelöléssel. A bal oldali ábra fekete-fehér, csak az Atg8 jelölést mutatja. Mindkét képen rengeteg Atg8-pozitív struktúrát találunk.

9.20. ábra mCherry-Atg8a riportert expresszáló, klorokvin kezelt muslica lárvák zsírteste. Jól táplált állatok több napig tartó klorokvin kezelése rengeteg mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúra felhalmozódásához vezet. Pircs Karolina felvétele.

Fekete-fehér Western blotról készütl felvétel. A minták sorrendje: jól táplált kontroll, éheztetett, valamint éheztetett és enzimgátlóval kezelt. A blot anti-LC3. A lipidált LC3-II mennyisége nő balról jobbra, egyre vastagabb fekete csíkot látunk.

9.21. ábra Lizoszómális gátlószer kezelés hatása a lipidált LC3 szintjére. Humán sejttenyészeti kísérletekben az éhezés megnöveli a lipidált LC3 II mennyiségét. Mivel az LC3 az autofágia során lebomlik, a lizoszómális enzimeket gátló E64d/pepsztatin A kezelés hatására felhalmozódik. Forrás: Mol. Biol. Cell 2012; 23 (5): 896-909

Amennyiben a vizsgált sejtben már eleve gátolt volt a lizoszómális lebontás, akkor viszont ezeknek a kezeléseknek elvileg nincs hatásuk. Sajnos azt egyelőre kevesen veszik figyelembe, hogy a TOR aktivitását csökkentheti a lizoszómális lebontás gátlása, emiatt maga a fluxus meghatározását célzó drogkezelés nem csak a lebontást, hanem az autofagoszóma keletkezést is befolyásolhatja (Juhasz, 2012).

Egy másik megközelítés azon alapul, hogy a lizoszóma az autofágia során szelektíven bekerülő fehérjéket lebontja. Ilyen protein például az Atg8/LC3, és az ehhez erősen kötő specifikus szállítmány, a p62 is. Ez a GFP-vel vagy mCherry-vel fúzionált riporterekre is igaz, viszont ezek a fluoreszcens fehérjerészek a lizoszómában kompakt térszerkezetük miatt jóval lassabban bomlanak le. Tehát western blot segítségével követhető, hogy mennyi GFP-LC3 vagy GFP-p62 bomlik le, mivel ez a lizoszómális proteolízis következtében keletkező, a lebomlott LC3 vagy p62 nélküli szabad GFP mennyiségével arányos (9.22. ábra).

Fekete-fehér Western blotról készütl felvétel. A minták sorrendje: jól táplált kontroll, éheztetett illetve vándorló állat. A blot anti-GFP, így láthatjuk a p62-GFP fúziós fehérjéket minden mintában 130 kDa magasságában. Az éheztett és a vándorló állatokban pedig plusz csíkot is láthatunk 27 kDa-nál, mely a szabad GFP jelenlétét mutatja. Az alsó anti-tubulin blot kontrollként szolgál.

9.22. ábra A GFP-fúziós p62 riporteren alapuló konverziós esszé. Autofágia indukciójakor a p62-GFP molekula p62 része gyorsan lebomlik, míg a lizoszómális degradációnak jobban ellenálló szabad GFP megjelenik a western blot kísérletekben. Ezen a képen az éheztetett (4) és vándorló (W) állatokban látható szabad GFP a táplálkozó (0) állatokban nem mutatható ki. Forrás: PLoS One. 2012; 7(8): e44214.

Ezt a technikát konverziós esszének nevezik, mivel a fúziós fehérje a lizoszómális emésztés következtében szabad GFP-vé vagy mCherry-vé alakul. Az Atg8/LC3 és a p62 fúziós riporterei mikroszkópos szinten is felhasználhatóak fluxus vizsgálatokra. Ehhez dupla, GFP és mCherry cimkét egyaránt hordozó riportereket használnak. Ezek a fúziós fehérjék a lizoszómába jutnak, ahol azonban a GFP fluoreszcenciája a savas pH hatására kialszik, az mCherry-vel ellentétben. Tehát például az mCherry-GFP-Atg8 riportert használva az autofagoszómák sárgák (egyszerre zöldek és pirosak), míg az autolizoszómák inkább pirosak (csak mCherry-pozitívak) lesznek (9.23. ábra).

Színes, fénymikroszkópos felvételek Drosophila lárvák zsírtestjéről. Mindkét képen kék színnel jelöltek a sejtmagok, a sejtekben nagy méretű fekete lipidcseppeket is találunk. A bal oldalon a sejt citoplazmája homogén, sárgás. Sárga nyilak mutatnak az erősen sárgán világító autofagoszómákra. A jobb oldali felvételen a citoplazma inkább zöld, benne a piros nyilak élénk piros autolizoszómákra mutatnak.

9.23. ábra Az mCherry-GFP-Atg8a riporter felhasználása autofág fluxus vizsgálatára. Az mCherry-GFP-Atg8a riportert expresszáló muslica lárvák zsírtestében rövid idejű éhezés során főként apró, sárga (mCherry és GFP pozitív) autofagoszómák láthatók (bal oldali panel). Hosszú ideig tartó éhezés esetén viszont a piros, csak mCherry fluoreszcenciát mutató autolizoszómák jelenléte jellemző (jobb oldali panel). Nagy Péter felvételei.

Összegzésül elmondható, hogy vizsgálataink során célszerű minél többféle kísérleti megközelítéssel vizsgálódni, hogy a különféle kísérletekben nyert adatok alapján minél megbízhatóbb következtetéseket tudjunk levonni az autofágiára nézve. Ezért is készült el nemrégiben egy, az autofágiával foglalkozó kutatók nagy részének részvételével megfogalmazott új ajánlás, amely a fenti módszerek tárgyalása mellett egyéb metodikákat is részletesen leír (Klionsky és mtsai, 2012).

Ellenőrző kérdések

  1. Az Atg fehérjkomplexek közül melyek szerepelnek a fagofór kialakulás kezdeti, és melyek akésőbbi lépéseiben?

  2. Fluoreszcens mikroszkóppal hogyan vizsgálható az autofágia?

  3. Milyen jellegzetes morfológiát mutatnak a különféle autofág struktúrák az elektronmikroszkópos felvételeken?

  4. Milyen biokémiai módszerrel és hogyan vizsgálható az autofágia?

  5. Mi az egyik legerősebb (bár indirekt) bizonyíték arra, hogy az autofágia egy adott folyamatban szerepel?

  6. Miért szükséges, és hogyan vizsgálható az autofág fluxus?

Irodalom

Eskelinen, E. L., Reggiori, F., Baba, M., Kovacs, A. L. és Seglen, P. O. (2011). Seeing is believing: the impact of electron microscopy on autophagy research. Autophagy 7, 935-956.

Itakura, E. és Mizushima, N. (2010). Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy 6, 764-776.

Juhasz, G. (2012). Interpretation of bafilomycin, pH neutralizing or protease inhibitor treatments in autophagic flux experiments: novel considerations. Autophagy 8, 1875-1876.

Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T., Yamamoto, A., Kirisako, T., Noda, T., Kominami, E., Ohsumi, Y. és Yoshimori, T. (2000). LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J.19, 5720-5728.

Klionsky, D. J. Abdalla, F. C. Abeliovich, H. Abraham, R. T. Acevedo-Arozena, A. Adeli, K. Agholme, L. Agnello, M. Agostinis, P. Aguirre-Ghiso, J. A. és mtsai (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8, 445-544.

Kovacs, A. L., Rez, G., Palfia, Z. és Kovacs, J. (2000). Autophagy in the epithelial cells of murine seminal vesicle in vitro. Formation of large sheets of nascent isolation membranes, sequestration of the nucleus and inhibition by wortmannin és 3-methyladenine. Cell Tissue Res.302, 253-261.

Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T. és Ohsumi, Y. (2004). In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol. Biol. Cell15, 1101-1111.

Scott, R. C., Schuldiner, O. és Neufeld, T. P. (2004). Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Dev. Cell 7, 167-178.

Suzuki, K., Kubota, Y., Sekito, T. és Ohsumi, Y. (2007). Hierarchy of Atg proteins in pre-autophagosomal structure organization. Genes Cells 12, 209-218.