11. Szelektív autofág lebontás

Chaperone-mediált autofágia

A korábban már tárgyalt CMA útvonalon a KFERQ aminosavszakaszt hordozó fehérjék kerülhetnek a lizoszómába. Ez a motívum a citoszólikus fehérjék harmadában megtalálható, így feltételezhetően egyéb, még nem ismert tulajdonságok is befolyásolják az útvonal szelektivitását. A folyamat jelentőségére még igen kevés adat van, nagyon sok ezzel kapcsolatos biokémiai vizsgálatot sejtlizátumokon végeztek (Wong és Cuervo, 2010). A feltételezések szerint több, humán betegségekben szereplő fehérje is képes ezen az útvonalon lebomlani, mint például a synuclein fehérjék. Egy új tanulmány azt sugallta, hogy a Parkinson betegségben szerepet játszó mutáns synuclein a lizoszómális receptorként működő LAMP-2A csatornákhoz kötődik ugyan, de a lumenbe nem tud transzlokálódni (11.1. ábra). A csatornák eldugítása miatt pedig egyéb fehérjék CMA útvonalon történő bejutása is gátlódhat.

A rajzon egy vázlatos lizoszóma és rajta egy LAMP-2A csatonra látható. A felső részen a kékkel jelölt normál synuclein fehérje átjut ezen a csatornán, míg az alsó képen a mutáns fehérje megreked a csatornában.

11.1. ábra A mutáns synuclein gátolhatja a CMA útvonalat. In vitro vizsgálatok azt suggalják, hogy míg a normális synuclein fehérje képes a chaperone-mediálta autofágia útján lebomlani, addig a Parkinson-kór esetén előforduló mutáns változat a LAMP-2A receptorhoz kötve gátolhatja a CMA-függő lebontási útvonal működését.

Mikroautofágia

A mikroautofágia vizsgálatát előszeretettel, végzik az egysejtű Pichia pastoris-ban, amely egy metilotróf élesztőfaj. Ezzel összhangban metanol tartalmú táptalajon tenyésztve rengeteg peroxiszóma keletkezik a sejtekben. Ha a táptalajt etanol-tartalmúra cserélik, akkor a feleslegessé váló peroxiszómák egy kivételével szelektív makroautofágia (makropexofágia) révén lebomlanak. Ebben döntően a kanonikus makroautofágiához is szükséges gének szerepelnek. Viszont glukóz-tartalmú táptalaj hatására a peroxiszómák szelektív mikroautofágiával (mikropexofágiával) jutnak a vakuólumba (11.2. ábra).

A rajz fekete-fehér. Az ábra bal oldalán egy vázlatos sejtet láthatunk, sejtmaggal, egy nagyobb vakuólummal és számos kisebb peroxiszómával. Etanol hatására (jobb felső rész) a peroxiszómákat kettős membrán veszi körül, elindul a makroautofágia. Az ábra jobb alsó részében a glükóz hatását szemléltetik, a vakuólum bekebelezi a peroxiszómát, mikroautofágia útján bomlik le.

11.2. ábra A pexofágia útvonalai. A metanol-tartalmú táptalajon tartott Pichia élesztő sejtek rengeteg peroxiszómát tartalmaznak. Etanol hatására az immáron feleslegessé váló peroxiszómák makroautofágia (makropexofágia), míg cukros táptalajon mikroautofágia (mikropexofágia) révén bomlanak le. Varga Ágnes ábrája.

A különbség oka még nem ismert, de ez lehetőséget ad az indukálható szelektív peroxiszóma autofágia vizsgálatára (11.3. ábra).

Az elektronmikroszkópos felvételek fekete-fehérek. Az ábra bal oldalán a szürkés színű citoplazmában jól felismerhetőek a fekete közepű peroxiszómák. A jobb oldali felvételen ilyen peroxiszómákat láthatunk egy világosabb hátterű vakuólumban.

11.3. ábra Pexofágia elektronmikroszkóppal vizsgálva. A metanol tartalmú táptalajon felszaporodó peroxiszómák (bal oldali kép) a táptalaj lecserélése következtében feleslegessé válnak, így (mikro- vagy makro-) autofágia révén bekerülnek a vakuólumba (V, jobb oldali kép). Pichia pastoris esetén a jellegzetes, az elektron mikroszkópos képen szinte fekete fehérjekristály jelenléte teszi könnyen felismerhetővé a peroxiszómákat (P). Forrás: Mol. Biol. Cell 2005; 16 (2), 446-457.

A mikropexofágiában eredetileg leírt PAZ és GSA gének egy része a későbbiekben allélikusnak bizonyult a központi Atg génekkel, de a folyamat molekuláris eseményeinek megértésétől még messze állunk (Sakai és mtsai, 1998).

(Makro)autofágia

Ubiquitinilált fehérjék lebontása

Mint azt már korábban említettük, az autofágia fő útvonala igen fontos szerepet játszik az ubiquitinilált fehérjék lebontásában. Ezt megfelelő szelektív autofág receptor fehérjék biztosítják. A plazmamembránban elhelyezkedő receptoroktól eltérően itt a receptor kifejezés csak arra vonatkozik, hogy ezek a molekulák képesek kétféle fehérjét összekapcsolni. Közülük az egyik maga az ubiquitin, természetesen itt a (poli-) ubiquitinilált fehérjékre kell gondolni. A másik pedig az Atg8/LC3 családba tartozó, ubiquitin-szerű fehérjék. Ezen fehérjék interakcióinak az eredménye az lesz, hogy az ubiquitinilált fehérjék (a szállítmány) a képződő, Atg8-cal borított fagofórhoz kötődnek a receptoron keresztül, majd együttesen a létrejött autofagoszóma belsejébe kerülnek (Lamark és Johansen, 2010). A legtöbbet vizsgált Atg8-cal szelektíven kölcsönhatásba lépő fehérje a p62 (más néven SQSTM-1, sequestosome-1). A p62 az ubiquitinilált fehérjéket UBA (ubiquitin-associated) doménje révén képes kötni, az Atg8/LC3-hoz pedig egy rövid peptidszakasz, az AIM/LIR motívum (Atg8 interacting motif/LC3 interacting region) révén köt (11.4. ábra).

Az ábrán felül a humán p62, alatta pedig a Drosophila p62 LIR-motívumának aminosavsorrendje, és azok fehérjében betöltött poziciója van feltüntetve. Piros színnel a kritikus, konzervált W és L aminosavak vannak kiemelve.

11.4. ábra A LIR motívum. A képen a humán és muslica p62 fehérjék LC3-mal, illetve Atg8-cal interakcióba lépő régióját (LIR) alkotó aminosavak sorrendje van feltüntetve. Forrás: Int J Cell Biol. 2012; 146767.

Ez egy körülbelül 8 aminosavas, általában rendezetlen fehérjerégióban elhelyezkedő szakasz. Az első három aminosav között gyakran vannak savas oldalláncúak, a negyedik (0. pozíciónak tekintett) mindig egy aromás (triptofán, tirozin vagy fenilalanin), utána két savas vagy apoláros, végül pedig a 3. pozícióban egy apoláros oldalláncú (leucin, izoleucin vagy valin) aminosav helyezkedik el (11.5. ábra).

Az ábra fekete-fehér, rajta a LIR régió konszenzus szekvenciája. Egy szögletes zárójelben szerepelnek azok az aminonosavak, amelyek a kötőhelyben az adott pozíciót elfoglalhatják.

11.5. ábra A LIR régió konszenzus szekvenciája. A bizonyítottan Atg8/LC3 molekulákat interakcióba lépő fehérjék kötőszekvenciáit összehasonlítva lehetséges konszenzus szekvenciát meghatározni, ami az ábrán van feltüntetve. Fontos, hogy a 0. pozícióban levő aromás aminosav (W, F, vagy Y) és a 3. pozícióban elhelyezkedő apoláros oldalláncú aminosav (I, L vagy V) játszik döntő szerepet a kölcsönhatás során, így a többi aminosav a konszenzustól természetesen eltérhet, mint az a 4. ábrán bemutatott p62 példák esetén is látható.

A legkritikusabb a 0. és 3. pozíció, mert ezek az aminosavak az Atg8/LC3 fehérje felszínén található mélyedésekbe kötnek (W és L hely, mert ide dokkolnak a triptofán- és a leucin-szerű oldalláncok) (11.6. ábra).

Az ábrán az Atg8/LC3 fehérje családjába tartozó fehérjék alapszerkezete látható. A szürkével jelölt aminosavlánc olyan térszerkezetet vesz fel, mely két hurkot, két világoskékkel jelölt kötőhelyet (W és L hely) hoz létre.

11.6. ábra Az Atg8/LC3 családba tartozó fehérjék térszerkezete. Az ábra a jellegzetes, ubiquitin-foldnak nevezett térszerkezetű Atg8/LC3 fehérjék felszínén található W és L helyeket mutatja be. Ezekhez kötnek a partnerfehérjék LIR régiójának 0. pozíciójában levő aromás és a 3. pozícióban található apoláros aminosav oldalláncok. Nagy Péter ábrája.

Az UBA és AIM/LIR mellett a p62-ben szintén megtalálható PB1 domén is elengedhetetlen a megfelelő funkcióhoz, ugyanis ez biztosítja azt hogy a p62 másik p62 fehérjével, vagy egyéb PB1 domént hordozó molekulákkal aggregálódni tudjon. Így jön létre az a szelektív receptorokat és ubiquitinilált fehérjéket egyaránt tartalmazó aggregátum, ami köré tud nőni a képződő fagofór (11.7. ábra).

Az ábra fekete-fehér. A feketével jelölt p62 fehérjén fehérrel láthatóak a kiemelt régiók.

11.7. ábra A p62 fehérje doménszerkezete. A diagram a p62 autofágia szempontjából lényeges doménjeinek elhelyezkedését mutatja be: a PB1 aggregációt, a LIR motívum LC3 kötést, az UBA domén pedig az ubiqutinilált fehérjék kötését biztosítja.

Mint azt már korábban láttuk, autofágia hiányában ezen aggregátumok száma és mérete is drasztikusan megnő a sejtekben. A p62 nem az egyetlen ilyen típusú receptorfehérje. Közvetlen kötőpartnere az NBR1 (neighbor of BRCA1), ami szintén rendelkezik PB1, LIR és UBA doménekkel, bár ez a PB1 doménjára jellemző sajátosságok miatt önmagával nem tud aggregátumot képezni (11.8. ábra).

Az ábra fekete-fehér. A feketével jelölt NBR1 fehérjén fehérrel láthatóak a kiemelt régiók.

11.8. ábra Az NBR1 fehérje doménszerkezete. A diagram az NBR1 autofágia szempontjából lényeges doménjeinek elhelyezkedését mutatja be: a PB1 aggregációt, a LIR motívum LC3 kötést, az UBA domén pedig az ubiqutinilált fehérjék kötését biztosítja.

Létezhetnek egyéb, még kellőképpen nem ismert jelek is, amelyek a kóros fehérjeaggregátumok szelektív autofág lebontását teszik lehetővé. A neurodegenerációs betegségek egy csoportjára jellemző, hogy mutáns, például poliglutamin expanziót hordozó fehérjék aggregátumai halmozódnak fel a sejtekben, mint az a Huntington-kór esetén is megfigyelhető. Mutáns huntingtin fehérjét kifejező tenyésztett sejtek vagy egér modellek esetén leírták, hogy az autofágia megfelelő hatóanyagokkal (például rapamicin) történő fokozása csökkenti a kóros aggregátumok szintjét és a patológiás folyamatok ellen hat (Ravikumar és mtsai, 2004).

Mitofágia

Mitofágia során a képződő fagofór szelektíven, egy adott mitokondriumot körbenőve hozza létre az autofagoszómát (11.9. ábra).

Az elektronmikroszkópos felvétel fekete-fehér. A szürke citoplamzában egy sötétebb színű, nagyméretű, membránnal határolt mitokondrium látható. Ehhez asszociálva találjuk a fagofórt, melynek kettős membránja közötti tér fehér, üresnek tűnik.

11.9. ábra Mitofágia. A mitokondrium szelektív lebontása (mitofágia) során a képződő fagofór (f) a mitokondrium felszínéhez asszociálva jön létre és növi körbe a degradációra szánt organellumot, így a környező citoplazma gyakorlatilag nem kerül bele az autofagoszómába. Kovács Attila felvétele.

A mitofágia jelensége igen jellemző a korai a retikulocita érés során, hiszen ilyenkor az összes mitokondrium eliminálódik, az érett vörövértestben már nincsenek jelen. Ebben a folyamatban szintén egy LIR motívummal rendelkező fehérje, a Nix játszik fontos szerepet (Novak és mtsai, 2010). Érdekes módon a Nix génkiütött egerek retikulocitáiban a mitokondriumok körbeveszik az autofagoszómákat ahelyett hogy bekerülnének.

Már évtizedekkel ezelőtt leírták, hogy a megtermékenyítést követően a spermiumokból származó mitokondriumok ubiquitinilálódnak. Jól ismert hogy a mitokondriumok maternálisan öröklődnek. Sokáig nem volt világos, hogy az apai mitokondriumok hogyan eliminálódnak a zigótából. A legújabb eredmények alapján a spermiumokból származó, ubiquitinilált mitokondriumok részben szelektív autofágia révén bomlanak le (Sato és Sato, 2013). Még nem ismert hogy milyen mechanizmus biztosítja azt, hogy csak az apai mitokondrium ubiquitinilálódjon. Elképzelhető, hogy a spermiumokra jellemző, igen intenzív mozgáshoz szükséges rengeteg energia igen rövid idő alatt történő előállítása olyan mértékben károsítja ezeket az organellumokat, hogy ez a károsodás lesz a jel a szelektív lebomlásra.

A mitofágia jelentőségét és molekuláris mechanizmusát legjobban a Parkinson-kórral kapcsolatos vizsgálatok alapján ismerjük (Youle és van der Bliek, 2012). A mitokondriumok egy nagyon dinamikus hálózatot alkotnak, amelyre folyamatos fúziók és fissziók jellemzőek. Az örökletes Parkinson-kórt kiváltó recesszív mutációk vizsgálata derített fényt arra, hogy a PINK1 szerin-treonin kináz és a Parkin ubiquitin ligáz kiesése a substantia nigra pars compacta részében található dopaminerg idegsejtjeinek pusztulásához vezethet. A későbbi molekuláris adatok alapján körvonalazódik ezen fehérjék mitofágiában betöltött szerepe. Leírták, hogy a mitokondriumok károsodása (például az elektron transzport lánc szétkapcsolása, melyet megfelelő drogkezeléssel mesterségesen is elő lehet idézni) miatt valamilyen úton-módon a normálisan igen gyorsan lebomló, folyamatosan cserélődő PINK1 fehérje stabilizálódik az adott organellum felszínén. Ezt követi a Parkin citoszólból a mitokondrium felszínére történő transzlokálódása, melynek eredményeképpen több mitokondriális külső membrán fehérje is ubiquitinilálódni fog. Ezek közé tartoznak a mitofuzin fehérjék, amelyek hiányában a károsodott mitokondrium már nem képes fúzióra, izolálódik, majd feltehetően az ubiquitin cimkéknek köszönhetően szelektíven lebomlik (11.10. ábra).

Az ábrán kékkel látható reaktív oxigéngyökök károsítják a világoskékkel jelölt mitokondriumot. Ennek felszínén találjuk sárga téglalapban a hozzá kötődő fehérjéket, és rózsaszínnel az ubiquitin molekulákat. Innen nyilak vezetnek a szelektív autofágia irányába, melynek lépései vázlatosan láthatóak az ábra alsó részén.

11.10. ábra A mitofágia molekuláris mechanizmusa. A sérült mitokondriumokon még teljes egészében nem ismert mechanizmus révén stabilizálódik a PINK1 kináz. Ennek hatására a Parkin a citoszólból a mitokondrium felszínéhez transzlokálódik, és a mitokondrium külső membránján elhelyezkedő fehérjéket ubiquitinilálja. Ezután, feltehetően a p62 és hasonló szelektív autofág receptorok közvetítésével, az adott mitokondrium lebontásra kerül. Forrás: Biochem. J. 2012, 441: 523–540.

A folyamat elromlása (PINK1 vagy Parkin funkcióvesztés esetén) a károsodott mitokondriumok felhalmozódásához vezet, ami hozzájárulhat a Parkinson kórra jellemző neurodegenerációs tünetek kialakulásához.

Xenofágia

A görög xeno, azaz idegen szóból származó kifejezés arra utal, hogy az állati sejtek képesek a bejutó patogéneket (baktériumok, vírusok) szelektív autofágia révén lebontani. (11.11. ábra)

A narancssárgával jelölt fagoszómából kijutó patogén ubiquitiniláción esik át. Ezek után a specifikus autogfág receptorok a naranccsal jelölt p62, a zöld NDP52 és a szürke OPTN megkötik és szürke LC3 molekulákon át a zölddel jelölt fagofór belső membránjához kapcsolják a patogén baktériumot.

11.11. ábra A xenofágia folyamata. A citoplazmába kerülő patogén baktériumok felszínén elhelyezkedő fehérjék többféle, itt nem részletezett mechanizmus révén ubiquitinilálódnak, valamint további, specifikus autofág degradációt kiváltó jelek is megjelölhetik ezeket. Ezen molekuláris lépések hatására a specifikus autofág receptorok (mint például az NDP52, p62 és az optineurin) a baktérium és az LC3 kötése révén mediálják a patogén autofág lebontását. Forrás: Front. Immunol. 2013; 4:97.

Szigorú értelemben véve persze ezek nem saját fehérjék vagy organellumok, de mivel bekerültek a citoszólba így értelmezhetjük ezt az útvonalat az autofágia egyik változataként. A legújabb kutatások rámutattak, hogy az endocitotikus vezikulumokból a citoplazmába kijutó patogén baktériumok (például a Salmonella) felszíne ubiquitinilálódik. Ezt a p62 mellett egyéb szelektív receptorok is felismerik, ilyenek az optineurin és az NDP52, melyek szintén rendelkeznek LIR motívummal és ubiqutin is köthetnek, azonban PB1 doménjük nincs (11.12. ábra).

Az ábra fekete-fehér. A feketével jelölt NDP52 és OPTN fehérjéken fehérrel láthatóak a kiemelt régiók.

11.12. ábra Az NDP52 és OPTN fehérjék szerkezete. A diagramok az NDP52 és Optineurin szelektív xenofágia receptorok autofágia szempontjából lényeges, LC3-at kötő (LIR) és ubiquitinnel kölcsönható (UBAN) régióinak elhelyezkedését mutatja be.

Ezen molekuláris lépések eredményeképpen a baktérium a lizoszómába jutva lebomlik (Randow és mtsai, 2013). Vegyük észre, hogy ez a mechanizmus sok hasonlóságot mutat a mitofágiával. Ez valószínűleg nem véletlen, hiszen a mitokondriumok egy ősi szimbionta baktérium leszármazottainak tekinthetők.

Egy igen érdekes megfigyelés az, hogy a lizoszómák különösen hatékonyan képesek elpusztítani és lebontani ezeket a mikroorganizmusokat. Proteomikai vizsgálatok során számos olyan rövid peptidet izoláltak lizoszómákból, amelyeknek igen erőteljes antimikrobiális hatása van. Kiderült hogy ezek a peptidek az autofágia révén a lizoszómába jutó citoszólikus fehérjékből származnak. Mivel a lizoszómában jönnek létre részleges emésztés révén, ezeket neo-antimikrobiális peptideknek is nevezik. Ilyen például a Fau vagy más néven rpS30, amely a riboszóma kis alegységének 30. számú fehérjéje (11.13. ábra).

Az ábra fekete-fehér. A citoplazmában levő Fau fehérjét körbeveszi egy kettős membrán, majd záródik, így létrejön az autofagoszóma. Lizoszómával történt egyesülés után a Fau AMP-kre bomlik. Ez a képlet baktériumokat tartalmazó autofagoszómával egyesül és hatékonyan elminálja azt.

11.13. ábra A neoantimikrobiális peptidek keletkezése. A citoszólikus fehérjék egy része, mint például a Fau (rpS30), autofágia révén a lizoszómába kerülve antimikrobiális peptidekre (AMP) bomlik le. Az ilyen peptideket tartalmazó lizoszómák rendkívül hatékonyan képesek a bekerülő baktériumokat elpusztítani. Varga Ágnes ábrája.

Ellenőrző kérdések

  1. Hogyan indukálható kísérletesen a peroxiszómák lebomlása?

  2. Milyen autofág receptorokat ismer, és milyen kritikus fehérjemotívumok jellemzőek ezekre?

  3. Milyen élettani és patológiás szerepe lehet a mitofágiának?

  4. Hogyan tudnak autofágia révén védekezni a sejtek a bejutó patogének ellen?

Irodalom

Lamark, T., és T. Johansen. 2010. Autophagy: links with the proteasome. Current opinion in cell biology. 22:192-198.

Novak, I., V. Kirkin, D.G. McEwan, J. Zhang, P. Wild, A. Rozenknop, V. Rogov, F. Lohr, D. Popovic, A. Occhipinti, A.S. Reichert, J. Terzic, V. Dotsch, P.A. Ney, és I. Dikic. 2010. Nix is a selective autophagy receptor for mitochondrial clearance. EMBO Rep. 11:45-51.

Randow, F., J.D. MacMicking, és L.C. James. 2013. Cellular self-defense: how cell-autonomous immunity protects against pathogens. Science. 340:701-706.

Ravikumar, B., C. Vacher, Z. Berger, J.E. Davies, S. Luo, L.G. Oroz, F. Scaravilli, D.F. Easton, R. Duden, C.J. O'Kane, és D.C. Rubinsztein. 2004. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat. Genet. 36:585-595.

Sakai, Y., A. Koller, L.K. Rangell, G.A. Keller, és S. Subramani. 1998. Peroxisome degradation by microautophagy in Pichia pastoris: identification of specific steps and morphological intermediates. J Cell Biol. 141:625-636.

Sato, M., és K. Sato. 2013. Maternal inheritance of mitochondrial DNA by diverse mechanisms to eliminate paternal mitochondrial DNA. Biochim Biophys Acta. 1833:1979-1984.

Wong, E., és A.M. Cuervo. 2010. Integration of clearance mechanisms: the proteasome and autophagy. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2:a006734.

Youle, R.J., és A.M. van der Bliek. 2012. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337:1062-1065.