IV. fejezet - Apoptózis

Tartalom

14. Az apoptózis felfedezése és jellemzése C. elegans-ban
A sejtpusztulás vizsgálatának korai szakasza
A programozott sejthalál hipotézisének igazolása, genetikai és molekuláris folyamatainak alapvető jellemzése a Caenorhabditis elegans fejlődésének tanulmányozása alapján
Ellenőrző kérdések
Irodalom
15. A kaszpázok szerepe az apoptózisban
Az apoptózis jelensége
A kaszpáz molekulacsalád
A kaszpázok élettani funkciói
Az apoptózis és a kaszpáz aktivitás betegségekben betöltött szerepe
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom
16. A sejthalál receptorok, apoptózis külső stimulusra (I. típus)
Indukció a halál receptorokon keresztül
A DISC komplex
Receptor-függő sejthalál útvonalak
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom
17. A Bcl-2 fehérjecsalád és az apoptózis
A gerincesek Bcl-2 fehérjecsaládja
A külső mitokondriális membrán ellenőrzésének fontossága
A Bcl-2 fehérjék nem-apoptotikus funkciói
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom
18. A mitokondriumok, apoptózis belső stimulusra (II. típus)
A mitokondriumok morfológiája és hálózata
A mitokondriális hálózat átszervezésének jelentősége
A mitokondrium és az apoptotikus szignálok
A mitokondriális sejthalál kaszpáz-függő és kaszpáz-független útvonala
A külső és a belső halálszignál útvonal összekapcsolása
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom
19. Az apoptózis szabályozása: a IAP-ok, a hősokk fehérjék és a p53
A IAP fehérjecsalád
Az apoptózis-szabályozó hatások
A hősokk fehérjék
A p53 szerepe az apoptózis szabályozásában
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom
20. Az apoptózis és az immunrendszer működése
Az öröklött és a szerzett immunitás
A T limfociták, mint ölő sejtek
Az apoptotikus sejtmaradványok eltakarítása
A piroptózis
Ellenőrző kérdések
Felhasznált és ajánlott irodalom

14. Az apoptózis felfedezése és jellemzése C. elegans-ban

A sejtpusztulás vizsgálatának korai szakasza

A sejtpusztulás iránti érdeklődés fellendülésében, a folyamat részletes morfológiai jellemzésében fontos szerepet játszott az elektronmikroszkópia. Benjamin F. Trump (függelék 17. ábra) és munkatársai 1965-ben egy sorozat cikket közöltek a májsejtek pusztulásáról (Trump és mtsai., 1965a; Trump és mtsai., 1965b; Trump és mtsai., 1965c; Trump és mtsai., 1965d). Ezekben elektronmikroszkópos vizsgálatok alapján leírták és elemezték a sejtek káros hatások okozta letális sérülés általi pusztulásának, a nekrózisnak az ultrastruktúrális jellegzetességeit. A nekrózis elnevezés a halott jelentésű görög „necros” szóból származik.

Az 1960-as és 70-es években további vizsgálatok alapján megfogalmazták a nekrózis fő jellegzetességeit, amelyek a következőek. A szövetek nagyobb területein lévő, egymással szomszédos sejtek és a bennük lévő mitochondriumok megduzzadnak. A sejtmag és az intracelluláris komparmentumok szétesnek, a sejtmembrán felhasad és a nekrotikus sejtek beltartalma kijut az extracelluláris térbe (14.1. ábra), ahol emiatt gyulladás keletkezik. A nekrózis alapvetően passzív folyamat, amely nem igényel energiát.

szürke árnyalatos képen szétesett sejt organellumai láthatóak

14.1. ábra Szétesett, nekrotikus májsejt

A következő jelentős lépést John F. R. Kerr (függelék 20. ábra) és munkatársai tették, akik szintén májon végzett vizsgálataik során a sejtek nagyobb csoportjait érintő nekrózis mellett elszórt egyedi sejtek pusztulását figyelték meg, amit a fő morfológiai jellegzetességük alapján zsugorodásos sejtpusztulásnak (shrinkage necrosis) neveztek el. Ebben az esetben az elpusztult sejtek egyenként, szétszórtan helyezkednek el és nem következik be gyulladás (Kerr, 1971).

A sejtpusztulással kapcsolatos irodalmi ismeretek és saját kutatásaik áttekintése alapján J.F.R. Kerr, A. H. Wyllie és A. R. Currie 1972-ben publikált mérföldkőnek számító cikket publikált (Kerr és mtsai., 1972). Ebben arra a következtetésre jutottak, hogy a sejthalálnak ez a zsugorodásos típusa előfordul ugyan káros hatások nyomán is (pl. rákos szövetekben kemoterápia hatására) a jellemző azonban az, hogy normális fiziológiás körülmények között rendszeresen és spontán módon jelentkezik egy sor szövetben, és feltehetően azok megújulását szolgálja. Különösen gyakori az egyedfejlődés során egy sor szerkezetváltozással járó átrendeződési folyamatban, pl. az újjak képződésekor, vagy a hím és női ivarszervek kialakulásakor emlősökben, a farok regressziójakor békákban, hogy csak néhány gerinces példát említsünk.

Kerr és munkatársai részletesen leírták a szétszórt egyedi sejteket érintő sejtpusztulási folyamat morfológiailag megfigyelhető szakaszait. Első lépésként a halálra ítélt sejtek leválnak szomszédjaiktól. A rögzített és festett preparátumokon a sejtek a normálisnál sötétebbnek mutatkoznak, zsugorodnak. Különösen elektronmikroszkópos képeken jellemző és szembetűnő, hogy sejtmagjukban holdsarló szerűen kondenzálódik a kromatin (14.2-14.3. ábra).

szürke árnyalatos képen a sejt baloldalán látható sejtmag belsejében éles határral holdsarló szerűen elkülönülő sötét terület látható

14.2. ábra A sejtmag kromatin állományának az apoptózisra jellemző holdsarló alakú éles határral történő elkülönülése sötét és világos területre izolált hasnyálmirigy acinus sejtben

szürke árnyalatos képen a sejt baloldalán látható sejtmag belsejében éles határral holdsarló szerűen elkülönülő sötét terület látható

14.3. ábra A sejtmag kromatin állományának az apoptózisra jellemző holdsarló alakú éles határral történő elkülönülése sötét és világos területre eritroblasztban

Ezt követően a sejtmag (14.4. ábra) és a sejt is fragmentálódik, ami azt jelenti, hogy a sejtről plazma membránnal borított kisebb citoplazma részek tűrődnek ki, majd válnak le (14.5-14.6. ábra). Ezek közül sok a sejtmag fragmentumait is tartalmazza. A leváló részek megjelenése az élénk fantáziájú szerzőket a lombhullásra emlékeztették. Ennek alapján a folyamat megnevezésére a görög apoptózis szót választották, ami a virágszirmok, vagy levelek lehullását jelenti (Kerr és mtsai., 1972).

szürke árnyalatos képen a sejtben széteső sejtmag látható, a citoplazmában néhány autofág vakuóla is található

14.4. ábra A sejtmag szétesése az apoptózis folyamatának középső szakaszában. A hasnyálmirigy acinus sejtben autofág vakuólák is láthatóak

szürke árnyalatos képen a sejt perifériáján lefűződő citoplazma részek mutatkoznak

14.5. ábra A fragmentálódás kezdetén lévő apoptotikus izolált májsejt

szürke árnyalatos képen látható, hogy a sejt teljes citoplazmája fragmentálódott

14.6. ábra Egy teljesen fragmentált apoptotikus izolált hasnyálmirigy sejt

A leváló sejtrészletek az un. apoptotikus testek (apoptotic bodies), amelyeket a szomszédos tovább élő sejtek, vagy fagocita sejtek kebeleznek be és emésztenek meg. A folyamat alapvető jellegzetessége, hogy az elpusztult sejtek fragmentálódott részei mindvégig plazma membránnal borítottak, citoplazma tehát nem jut ki az extracelluláris térbe, ezért gyulladás sem keletkezik. Az emésztés intracellulárisan zajlik a bekebelező sejtek lizoszomális rendszerének segítségével.

Az apoptózis kifejezés bevezetésénél lényegesen fontosabb, hogy Kerr és munkatársai feltételezték, hogy az apoptózis a sejtben aktiválódó program szerint megy végbe. Ezzel az emlősökre is kiterjesztették a programozott sejthalál koncepcióját, amit korábban rovarok fejlődési folyamatainak tanulmányozásakor fogalmazott meg Richard A. Lockshin és Carroll M. Williams (Lockshin és Williams, 1964).

Ezt követően a sejthalállal kapcsolatos kérdések egyre nagyobb érdeklődést keltettek. Új módszereket és kísérleti rendszereket fejlesztettek ki, amelyek révén néhány évtizeden belül sejt- és orvos biológiai szempontból is kiemelkedő eredmények születtek. Az apoptózis és a programozott sejthalál kifejezéseket mind a mai napig egyéni ízlés szerint szinonimákként, egymással párhuzamosan használják, de rendszerint ugyanazt a folyamatot értik alatta.

A programozott sejthalállal foglalkozó fejezetek általános bevezetésének lezárásaként meg kell még említenünk, hogy a sejtek pusztulásának a nekrózis és az apoptózis mellett számos más típusa és átmeneti formája is ismert. Könyvünk ezekkel csak utalásszerűen foglalkozik mivel jellemzésük nem kellően kidolgozott és csoportosításuk ma is élénk vita tárgya.

A programozott sejthalál hipotézisének igazolása, genetikai és molekuláris folyamatainak alapvető jellemzése a Caenorhabditis elegans fejlődésének tanulmányozása alapján

A tudomány fejlődése során gyakran előfordul, hogy egy probléma megoldásához a tovább lépést, a felvetődésétől távol álló terület eredményei teszik lehetővé. Ez történt az apoptózis esetében is. Az 1960-as években kezdődött az a munka, amelynek során a gének soksejtűekben való működésének felderítését tűzte ki Sydney Brenner (függelék 21. ábra). Ehhez egy új modell szervezetet vezetett be, az apró (a felnőtt állat kb. 1mm hosszú) és viszonylag egyszerű fonálférget, a Caenorhabditis eleganst. Ennek az állatnak a testfala mikroszkópban, vizes közegben, megfelelő megvilágítás mellett átlátszó (14.7. ábra), és Nomarski optikával minden egyes sejtje azonosítható, elsősorban a sejtmagja segítségével (14.8. ábra).

sárgásbarna háttérben kígyószerűen kanyargó testű féreg látható, a testfalon áttűnik a test egész hosszában végighúzódó bélcső

14.7. ábra Felnőtt hermafrodita C. elegans. Az átlátszó testfalon keresztül jól látszik a bélcső

kékeszöld háttérben a féreg testének középső része látható, amelynek a falán áttűnő sejtek egyenként megfigyelhetőek

14.8. ábra A C. elegans átlátszó testfalán át a test sejtjei egyenként azonosíthatóak Nomarski féle differenciál-interferencia kontraszt (DIC) rendszerű fénymikroszkópban

Életciklusa rövid, a jól táplált állatok négy lárvastádiumon (L1-L4) át válnak felnőtté. Kedvezőtlen körülmények között képesek nem táplálkozó tartós (un. dauer) lárva stádiumba lépni, ha pedig a helyzet jóra fordul onnan kilépni és továbbfejlődni (14.9. ábra).

vonalas képen nyilakkal ellátott kördiagramként ábrázolva látszik a C. elegans életciklusa

14.9. ábra A C. elegans fejlődésének fázisai

Az egyedek túlnyomó többsége hermafrodita, amelyek önmegtermékenyítéssel szaporodnak, míg nagyjából minden ötszázadik hím (14.10. ábra), és így keresztezésre is mód van.

két szürke árnyalatos kép közül a baloldalin föntről lefelé keskenyedő, míg a jobboldalin legyezőszerűen kiszélesedő farok vég látható

14.10. ábra A hermafrodita állat farki vége meredeken elkeskenyedő fonálban végződik, míg a hímé legyezőhöz hasonlóan kiszélesedik

Brenner annak a gondolatnak a szellemében választotta ezt a modell állatot amelynek figyelembe vétele a mai kísérleti biológusok számára is fontos: „.. choosing the right organism for one’s research is as important as finding the right problems to work on.” Nézetének helyességét a később a C. elegans-szal dogozó kutatók számának exponenciális növekedése és a kutatások sikeréért 2002-ben kapott orvosi Nobel díj is igazolja.

A Brenner által irányított korai munka egyik fő iránya a C. elegans fejlődésmenetének minél részletesebb feltárása volt. Ennek során azt az elképesztően ambiciózus célt tűzték ki, hogy sejtről-sejtre feltérképezzék a fonálféreg egyedfejlődését. Ehhez Nomarski féle optikával fénymikroszkópban in vivo egyenként kellett felismerni az osztódások révén létrejött utód sejtmagokat és segítségükkel követni az utódsejtek mozgását. A munka nehézségét Robert Horvitz (függelék 22. ábra)aki az apoptózis C. elegans-ban való kutatásáért 2002-ben szintén orvosi Nobel díjat kapott, a következőkkel illusztrálta: „A simple analogy is to imagine that you are watching a bowl with hundreds of grapes, trying to keep your eye on each grape as it and many others move.” Mivel az egymást követő sejtosztódások menete minden egyes C. elegans egyedben tökéletesen azonos, ez a rendkívüli munka végül elvezetett a fejlődés során keletkező összes sejt leszármazási vonalának (cell lineage) pontos és teljes feltérképezéséhez (Sulston és Horvitz, 1977; Sulston és mtsai., 1983) (14.11-14.12. ábra).

vonalas ábrán követhető a sejtek osztódása a zigótától a lárva kikeléséig, minden sejt két utódját elágazó vonalrendszer illusztrálja

14.11. ábra A C. elegans embrionális fejlődése során kialakuló sejtek leszármazásának diagramja

vonalas ábrán követhető a zigóta osztódása után keletkező sejtek egy részének elnevezése és leszármazása

14.12. ábra Az osztódások sora a zigótától az ABala sejtig. A 14.11. ábra bal oldala kezdeti osztódásainak kinagyított képe. A sejtek elnevezésében látható „a”, „p”, „l” és „r” sorrendben az anterior, posterior, left, right, az utódsejteknek az osztódást követő pozícióját jelenti. „a” az osztódást követően elöl (anterior pozícióban), a „p” hátul (posterior pozícióban)

A sejtek leszármazásával foglalkozó kutatás vezetőjét és motorját, John E Sulstont (függelék 23. ábra) 2002-ben szintén orvosi Nobel díjjal jutalmazták. (Sulston további érdemeket szerzett a C. elegans genomjának szekvenálásában is.)

A sejtleszármazás feltérképezésének egyik legfontosabb eredményeként kiderült, hogy a hermafrodita egyedek fejlődése során keletkezett 1090 sejt közül ugyanaz a 131 (melyek közül 105 idegsejt) szigorú idő és térbeli rend szerint elpusztul (14.13.. ábra).

vonalas ábrán követhető a zigóta osztódása után keletkező sejtek egy részének elnevezése, leszármazása, és az, hogy közülük számosan apoptózissal elpusztulnak

14.13. ábra A teljes leszármazási diagram bal oldali részének kinagyítása az ABala sejttől a végső utódokig. Az x-el jelölt sejtek apoptózissal elpusztulnak.

A pusztuló sejtek nagyjából fél óra alatt lekerekednek, majd gyors zsugorodás után eltűnnek (14.14. ábra) (Horvitz, 2002; Sulston, 2002).

szürke árnyalatos képen egymás fölött két késői embrió látható közülük az alsóban gombszerűen kiemelkedő kerek struktúrák jelzik az apoptotikus sejteket

14.14. ábra C. elegans embrióban a pusztuló sejtek Nomarski optikával lekerekedett, kiemelkedőnek mutatkozó képleteknek látszanak (nyilak)

A folyamat reprodukálhatósága azt sugallta, hogy a pusztulás sorsára jutó sejtek kiválasztása és a pusztulás mechanizmusa egyaránt genetikai szabályozás alatt áll. A továbblépéshez tehát a sejthalált befolyásoló géneket kellett találni. Sulston megfigyelte, hogy egyes állatokban ott ahol normális esetben sejtpusztulás történik, Feulgen festéssel jól kimutatható sejtmagok maradnak. Ez azt jelenti, hogy nem történik meg a DNS-nek a sejthalállal normálisan együtt járó lebomlása. Az így felismert mutáns amelyben az endonukleáz abnormálisan működött, a nuc-1 (nuclease abnormal) elnevezést kapta (Conradt és D., 2005).

Ezt követően két újabb mutánst találtak (ced-1, ced-2; cell death abnormal), amelyekben a legömbölyödött halott sejtek (ezeket az angol kifejezés nyomán sejthulláknak (cell corpse) nevezhetjük) megmaradtak, tehát a sejthulláknak nem történt meg a bekebelezésük. Horvitz laboratóriumában további mutánsok felismeréséhez vezettek azok a kutatások, amelyekben ced-1 állatokat mutagenizáltak. A mutagenizálás után olyan egyedeket kerestek amelyekben a normális pusztulási folyamathoz képest eltérés látszott (Horvitz, 2002).

Ilyen módon sikerült egy olyan mutánst azonosítani, amelyben nem mutatkoztak sejthullák. Ebben a ced-3-nak elnevezett mutánsban mind a 131 sejt megmaradt, amelyeknek el kellett volna pusztulniuk. A ced-3 tehát nélkülözhetetlen a sejthalál megindulásához, azaz un. pro-apototikus gén.

A ced-3 felfedezése nyomán fel lehetett állítani az addig leírt sejthalál gének működési sorrendjének első, legegyszerűbb genetikai sémáját. Eszerint a ced-3 a pusztulás megindításában szerepel, ezt a bekebelezést szabályozó a ced-1 és a ced-2 követi; a folyamat sémáját a 14.15. ábra mutatja.

balról jobbra nyilak mutatják a sejtpusztulási gének egymás utáni sorrendjét

14.15. ábra A programozott sejthalál génsorrendjének első, legegyszerűbb sémája

A Horvitz labor egy másik projektjében a tojásrakásban hibás (egg-laying defective) mutánsokat kerestek. A megtalált 145 mutáció közül az egyikben hiányoztak az un. HSN motoros neuronok, amelyek a tojásrakásban szereplő vulvális izmokat idegzik be. Ennek magyarázatára az egyik elvi lehetőség az volt, hogy a HSN neuronok létre sem jönnek, a másik pedig az, hogy létrejönnek ugyan, de ezt követően programozott módon elpusztulnak. Az utóbbi lehetőséget az egl-1/ced-3 kettős mutáns vizsgálatával igazolták. Ebben megmaradtak a HSN neuronok, a ced-3 tehát szupresszálta az egl-1 hatását. Ez az eredmény gyorsította a munkát azzal, hogy a további ced-3-hoz hasonló mutánsokat lehetett keresni az egl-1 szupresszálása révén. Így fedezték fel a ced-4-et (Ellis és Horvitz, 1986).

Ezután mozaik analízissel tisztázták, hogy a ced-3 és a ced-4 a sejteken belül hat, ami azt igazolta, hogy a programozott sejthalálnak ez a formája celluláris öngyilkosság (Yuan és Horvitz, 1990).

Elvégezték a ced-4 klónozását és szekvencia analízisét, ami szerint teljesen új proteinről volt szó. Csaknem két évet kellett arra várni, hogy 1992-ben a szekvencia adatbázisban a ced-4-hez hasonló, emberből izolált fehérje szekvenciája megjelenjen. Ez az ICE (interleukin- 1-beta converting enzyme) volt, az első tagja azoknak a cisztein proteázoknak, amelyeket mai néven kaszpázoknak nevezünk.

Ennek alapján az a következtetés adódott, hogy ha a CED-3 cisztein proteinázként nélkülözhetetlen szerepet játszik a C. elegans apoptózisában, akkor az ICE hasonló szerepet játszhat emlős sejtekben (Miura és mtsai., 1993).

A C. elegansban folyó apoptózis további génjeinek azonosítására az állat garatjában lévő egy bizonyos, normális esetben apoptózissal elpusztuló, neurális sejt túlélését okozó mutánst kerestek. Hat mutációt találtak, ezek közül ötben defektív volt a ced-3 vagy a ced-4, a hatodik azonban új génnek bizonyult, amit elneveztek ced-9-nek. Erről további vizsgálatok alapján kiderült, hogy nem funkcióvesztéses (loss of function), hanem funkciónyeréses (gain of function) mutáció. Ez azt jelenti, hogy a ced-9 funkciónyeréses mutációja esetén megmaradnak azok a sejtek amelyeknek programozott sejthalállal meg kellene halniuk, addig a ced-9 funkcióvesztéses mutációja következtében elpusztulnak azok a sejtek amelyeknek élniük kellene. Eszerint a ced-9 az a gén amely eldönti, hogy egy sejt életben marad-e, vagy programozottan elpusztul (14.16. ábra).

balról jobbra nyilak mutatják, a baloldalon lévő ced-9 géntől egy felső és egy alsó nyíl mutatja túlélés és a pusztulás alternatíváját

14.16. ábra A ced-9 bekapcsolt (on) állapotban túléléshez, kikapcsolt (off) állapotban pedig pusztuláshoz vezet

A ced-9 klónozása után kiderült, hogy hozzá hasonló gén az emberben is megtalálható, és mutációja follikuláris limfómát okoz. Emiatt a Bcl-2 (Bcell lymphoma) nevet kapta.

A ced-9 és a szekvenciájában hasonló Bcl-2 tehát megvédi a sejteket az apoptotikus pusztulástól. Ezzel a felfedezéssel sikerült kapcsolatot találni a C.elegansban zajló programozott sejthalál és az emberben történő apoptózis között.

További vizsgálatok révén az emlősökben egy sor ced-9-hez hasonló fehérjét fedeztek fel, amelyek így együtt a CED-9/Bcl2 fehérje családot alkotják.

A programozott sejthalált a C. elegansban szabályozó gének és az emlősökben folyó apoptózisban szereplő gének hasonlósága ráirányította a kutatók figyelmét arra, hogy a C. elegansban működő programozott sejtpusztulás génjeinek sorrendjéhez hasonló lehet a humán apoptózisban szereplőké. Fontos megerősítést kapott a hasonlóság azzal, hogy a humán Bcl-2-vel sikerült helyettesíteni a ced-9-et transzgén C. elegans-ban.

Ennek a lehetőségnek a kiaknázásához pontosan meg kellett állapítani a gének működésének sorrendjét C. elegans-ban. A téma iránt ugrásszerűen megnőtt az érdeklődés és az újonnan bekapcsolódó laboratóriumok eredményeinek hozzájárulásával kialakult a C. elegans programozott sejtpusztulásának központi szakaszában résztvevő gének működési sorrendjének sémája (14.17. ábra).

balról jobbra nyilak mutatják a sejtpusztulási gének egymás utáni sorrendjét

14.17. ábra A programozott sejtpusztulás központi szakaszában résztvevő gének működési sorrendje C. elegans-ban

Ellenőrző kérdések

  1. Hogyan változik az apoptotikus sejtek elektronmikroszkópos morfológiája?

  2. Milyen tulajdonságai teszik az apoptózis tanulmányozására alkalmas modellállattá a C. elegans-t?

  3. Milyen apoptotikus géneket fedeztek fel a C. elegans-ban és mik ezeknek a feladatai?

Irodalom

Conradt, B., D., X., 2005. Programmed cell death. The C. elegans Research Community, WormBook,. http://www.wormbook.org.

Ellis, H. M., Horvitz, H. R., 1986. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44, 817-29.

Horvitz, R., 2002. Worms, life and death. Nobel Lecture. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2002/horvitz-lecture.pdf.

Kerr, J. F., 1971. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. J Pathol. 105, 13-20.

Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R., 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-57.

Lockshin, R. A., Williams, C. M., 1964. Programmed cell death-II. Endocrine potentiation of the breakdown of the intersegmental muscles of silkmoths

Journal of Insect Physiology 10,, 643-649.

Miura, M., Zhu, H., Rotello, R., Hartwieg, E. A., Yuan, J., 1993. Induction of apoptosis in fibroblasts by IL-1 beta-converting enzyme, a mammalian homolog of the C. elegans cell death gene ced-3. Cell. 75, 653-60.

Sulston, J. E., 2002. C. elegans: the cell lineage and beyond. Nobel Lecture. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2002/sulston-lecture.pdf.

Sulston, J. E., Horvitz, H. R., 1977. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56, 110-56.

Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N., 1983. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119.

Trump, B. F., Goldblatt, P. J., Stowell, R. E., 1965a. Studies of mouse liver necrosis in vitro. Ultrastructural and cytochemical alterations in hepatic parenchymal cell nuclei. Lab Invest. 14, 1969-99.

Trump, B. F., Goldblatt, P. J., Stowell, R. E., 1965b. Studies of necrosis in vitro of mouse hepatic parenchymal cells. Ultrastructural alterations in endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, plasma membrane, and lipid droplets. Lab Invest. 14, 2000-28.

Trump, B. F., Goldblatt, P. J., Stowell, R. E., 1965c. Studies of necrosis in vitro of mouse hepatic parenchymal cells. Ultrastructural and cytochemical alterations of cytosomes, cytosegresomes, multivesicular bodies, and microbodies and their relation to the lysosome concept. Lab Invest. 14, 1946-68.

Trump, B. F., Goldblatt, P. J., Stowell, R. E., 1965d. Studies on Necrosis of Mouse Liver in Vitro. Ultrastructural Alterations in the Mitochondria of Hepatic Parenchymal Cells. Lab Invest. 14, 343-71.

Yuan, J. Y., Horvitz, H. R., 1990. The Caenorhabditis elegans genes ced-3 and ced-4 act cell autonomously to cause programmed cell death. Dev Biol 138, 33- 41.