15. A kaszpázok szerepe az apoptózisban

Az aktív sejthalál apoptotikus formájának molekuláris mechanizmusa kivétel nélkül minden esetben bizonyos proteolitikus enzimek működésének beindulásával és/vagy aktivitásának fokozódásával kezdődik. A folyamat teljes kivitelezésében, sőt, a „sejthullák” végső eltakarításában is dominálnak a sejten belüli fehérjebontó enzimek.

Az apoptózis jelensége

A tipikus apoptózis folyamán megjelenő morfológiai jellemzőket a 15.1.–15.3. ábrán látható három elektronmikroszkópos felvétel szemlélteti. A folyamat elején a sejtek zsugorodása indul meg. A szöveti környezetben lévő sejtnél ennek legelső jele bizonyos sejt-sejt kapcsolatok gyengülése, felszakadása (l. 15.9. ábra és „A kaszpázok szubsztrátjai” c. fejezet), amit az adott sejt zsugorodása követ. Ultrastrukturális, sejtmagi szinten már a korai stádiumban lehet látni a maghártya mellett egy nagyon határozott kromatin kondenzációt, ami általában periférikus, félhold alakú. Emellett megkezdődik az úgynevezett apoptotikus testek vagy blebek képződése és lefűződése; e folyamat neve: zeiozis. A sejtmembrán teljesen intakt, a környezettől elhatároló, de azzal szabályozott anyag- és energiakicserélő kapcsolatot biztosító szerepét be tudja tölteni. A sejtorganellumok épek, működőképesek; a citoplazma elektrondenzitása azonban a transzglutaminázok aktivitásának fokozódása, a fehérjék keresztkötése miatt változik. A lefűződött sejtrészek is ép membránnal határoltak, a bennük lévő struktúrákkal együtt (többnyire) működőképesek. A folyamatot a sejtmag feldarabolódása, fragmentációja kíséri, így a citoplazma lefűződésekbe sejtmag részletek is bekerülnek. Az apoptózis „hulló levelet vagy virágszirmot” jelent, ami a zeiozis folyamatára utal.

A felvétel fekete-fehér, a befűződött sejtmag tömör, fekete részei a kép közepén feltűnőek. A fellazuló sejtkapcsolatokra a sejt jobb oldalán mutatnak nyilak.

15.1. ábra Az apoptózis korai szakaszának morfológiai jellemzőit mutató transzmissziós elektronmikroszkópos felvétel. A sejtkapcsolatok felszámolódnak, a sejt elválik a szomszédaitól (fekete nyilak). Már megfigyelhető a sejtmag kromatin állományának perifériális kondenzációja (fehér csillagok), a citoplazma denzitásának fokozódása és a sejtfelszín „hólyagosodása”.

A felvétel fekete-fehér.

15.2. ábra Előrehaladott apoptózis ultrastrukturális szintű morfológiai sajátosságai. A sejtmag fragmentálódott (egyik részletét fehér csillag jelöli), a sejtfelszínen virágszirmok elrendeződésére emlékeztető apoptotikus testek képződnek és fűződnek le (fekete nyilak).

A felvétel fekete-fehér.

15.3. ábra Az apoptózis késői szakaszának morfológiai jellemzői. Az erőteljesen zsugorodott és szinte teljesen fragmentálódott sejt felszínéről még ekkor is fűződnek le apoptotikus testek. A citoplazma fokozott denzitása miatt a sejtalkotók alig felismerhetők.

Az apoptózis szöveti protektív szerepű, mivel a sejt végig intakt membránnal határolt részekre esik szét, majd ezeket az apoptotikus testeket a környező szövet ép sejtjei, vagy erre specializált sejtek kebelezik be és bontják le. Sejten belüli Ca2+-ion koncentráció kimutatás alapján megállapítható, hogy az intracelluláris kalcium-koncentráció az apoptotikusan pusztuló sejt esetében lassan növekszik és „csak” szubnekrotikus szintet ér el.

Arról, hogy az integritás megőrzésének és a sejthalál folyamatát kísérő energiaigényes folyamatok energetikai „finanszírozásának” hátterében mi áll, a „Kaszpázok szubsztrátjai” c. fejezetben adunk bővebb tájékoztatást.

A fent bemutatott morfológiai jellemzői alapján az apoptotikus és a nekrotikus sejthalál között éles különbségek mutatkoznak. A nekrózis esetében a sejt intenzíven duzzad, a sejtmembrán elveszti épségét (intaktságát), ezzel együtt barrier szerepét is. A beltartalom a környezetbe áramlik, miközben a sejtorganellumok (így a sejtmag) is sérülnek. A lízis következtében a környezetbe antigének kerülnek, amelyek gyulladásos folyamatot indukálnak (15.4. ábra).

A nekrózis eseményei bal oldalon piros, az apoptózis történései jobb oldalon kék félkört formáló nyíl mentén láthatók.

15.4. ábra A nekrózis és az apoptózis morfológiai vonásainak összehasonlítása.

A kaszpáz molekulacsalád

A kaszpázok szerkezeti jellemzői

A kaszpázok olyan cisztein proteázok, amelyek egy 4 aminosavból álló úgynevezett konszenzus szekvencia mellett hasítják el a peptidkötést. Ennek az aminosav-motívumnak az utolsó tagja minden esetben egy aszparaginsav (15.5. ábra). A kaszpázok ezen tulajdonsága eredményezi azt, hogy szubsztrátumaikat rendkívül pontosan, csak meghatározott helyeken és csak részlegesen bontják (limitált proteolízis).

A fenti tulajdonságokkal rendelkező, elsőként leírt enzimet a korábbi szakirodalomban még ICE (Interleukin Converting Enzyme) néven találjuk meg. Az elmúlt 20 év kutatásai során azonban több mint 10 tagra bővült a hasonló szerkezetű és aktivitású, bár különböző névvel illetett enzimek száma. Ezért logikus és szükséges lépés volt a közös tulajdonságon alapuló, egységes nevezéktan bevezetése és az enzimek egy közös családba való besorolása (caspases: cisteinyl aspartate-specific proteases). Itt az egyes „családtagokat” számozással különböztetjük meg egymástól. Az emlős kaszpázok családja jelenleg 13 tagból áll (15.6. ábra).

Valamennyi kaszpáz közös tulajdonsága, hogy szintézise során inaktív, proenzim (prokaszpáz) formában jelenik meg (zimogén forma). Az aktiváláshoz az N-terminálison lévő úgynevezett prodomén lehasítása szükséges. Az ezután megmaradó, az enzimatikus működéshez szükséges fehérje minden kaszpáz esetében két részből áll. Ezek közül a nagyobb (large, l) egy úgynevezett p20, a rövidebb (small, s) egy p10 domént képez (15.5. ábra).

Az N-terminális prodoménje mögött a már ismert konszenzus szekvencia található csakúgy, mint a p20 és p10 domének között (15.5. ábra). A kaszpázok aktiválásához szükséges szerkezeti átalakítások érdekében tehát olyan hasításokra van szükség, amelyeket egy másik, ugyanolyan vagy más számmal jelzett kaszpáz képes végrehajtani.

Az ábrán a pro-domén lila, a p20 domén barna, a p10 domén pedig világoskék.

15.5. ábra A zimogén prokaszpázok kaszpáz-specifikus hasítási helyei (D: aszparagin sav).

A kaszpázok csoportosítása

Az egy családba tartozó kaszpázokat funkciójuk és szerkezetük alapján is alcsaládokba sorolhatjuk. Az egyes családtagokat számozással különítjük el egymástól. 13 féle humán kaszpázt különböztetünk meg, amelyek nevei kaszpáz-1–kaszpáz-14. Arról a molekuláról, amelyet korábban kaszpáz-13-ként tartottak számon kiderült, hogy nem létezik (kísérlet következtében keletkezett műtermék).

Csoportosítás prodomén szerkezet alapján

A prodomén lehet rövid vagy hosszú. A rövid prodoménű enzimek a kaszpáz-3, -6, -7 és 14 (15.6. ábra). Az utóbbi (kaszpáz-14) kivételével valamennyien az apoptózis „végjátékában” szerepelnek, mint végrehajtó, effektor, vagy exekutor[5] kaszpázok (III. típus). Prodoménjük 30-nál kevesebb aminosavból áll, s azon kívül, hogy biztosítja inaktív állapotukat, semmilyen más funkcióval nem rendelkezik.

Az ábrán szereplő molekulákban a CARD pro-domének lilák, a DED mikrodomének pirosak, a p20 domén barna, a p10 domén világoskék.

15.6. ábra Az emlős kaszpázok szerkezeti felépítése és az ennek alapján megállapítható csoportjai. Alul a Ced-3, a C. elegans kaszpáz homológjának a szerkezete látható. (CARD: caspase activating recruiting domain; DED: death effector domain, Ced-3: cell death abnormality-3).

A hosszú prodoménű kaszpázok esetében a pro-régió összetettebb és a sejt további élete szempontjából sorsdöntő funkcióval is bír(hat).

Ide tartoznak az aktív sejthalál apoptotikus formájának beindításában kulcsszerepű, úgynevezett iniciátor kaszpázok (kaszpáz-2, -8, -9, -10), amelyeknek olyan prodoménjei vannak, amelyekben fehérje-interakciós mikrodomének találhatók. Utóbbiak a halál domén (death domain) fehérje szupercsaládba tartoznak.

A halál domén szupercsalád

A halál domén szupercsalád az egyik legintenzívebben kutatott domén család. Tagjai a halál domén[6] (death domain, DD), a halál effektor domén (death effector domain, DED), a kaszpáz aktiváló és toborzó (caspase activating recruiting domain, CARD), valamint a pirin domén (pyrine domain, PYD) alcsalád. Szerkezetükben közös, hogy olyan globuláris molekularészek, amelyek egymás mellett felhajtogatott 6 hélixet tartalmaznak. Fő funkciójuk közös: az apoptotikus, illetve a gyulladásos szignalizációs útvonalban homotipikus kölcsönhatások kialakítása révén több alegységes (oligomer) jeladó komplex kialakítása.

Halál domén tartalmuk alapján a kaszpázok körében két alcsoportot különítünk el. A kaszpáz-8 és -10 szerkezetében két-két egymást követő (tandem) DED régió, míg a kaszpáz-9 és -2 molekulában egy-egy aktiváló és toborzó, úgynevezett CARD régió található (15.6 és 15.7. ábra). A DED és CARD mikrodomének révén az ezekkel rendelkező kaszpázok hasonló doménekkel rendelkező molekulákhoz tudnak kapcsolódni, ami alapvetően meghatározza azt, hogy a sejtben milyen molekuláris komplexum részeként és hogyan aktiválódnak (l. 15.7. ábra és „A kaszpázok aktivációja” c. fejezetet).

Az ábrán szereplő molekulákban a CARD pro-domének lilák, a DED mikrodomének pirosak, a p20 domén barna, a p10 domén világoskék.

15.7. ábra Az iniciátor kaszpázok mikrodoménjei. A mikrodomének típusa meghatározza azt, hogy a proenzim melyik aktivációs útvonalon és melyik komplexben aktiválódik.

Csoportosítás funkció alapján

A kaszpázok három csoportba sorolhatók aszerint, hogy milyen folyamatok aktiválásában vesznek részt (15.6. és 15.8. ábra). Az I. csoportba azok tartoznak, amelyek citokineket aktiválnak, így gyulladásos folyamatok előidézésében vesznek részt. CARD halál doménnel rendelkeznek.

A II. csoportba az apoptózis beindításában szerepet játszó, iniciátor kaszpázok tartoznak. Mind hosszú prodoménnel rendelkeznek, amelyben tandem DED vagy egy CARD mikrodomén található (15.6. ábra).

A III. csoportot az apoptózis végrehajtásában szerepet kapó effektor kaszpázok képezik. Kivétel nélkül rövid prodoménű kaszpázok (15.6. ábra).

Mai ismereteink szerint egyetlen kaszpáz nem sorolható be a fenti csoportokba. Ez a kaszpáz-14, amely rövid prodoménű. Korábban citokin-aktiválónak tartották, de ma már bizonyos, hogy egy harmadik aktív sejthalál típusban, a keratinizációban játszik szerepet (l. 15.13. ábra). Csak az epidermiszben expresszálódik, s egy eddig még azonosítatlan proteáz aktiválja.

A fenti alapokon képzett csoportokat az 15.8. ábra mutatja be.

A citokin aktiváló kaszpázok halmaza piros, a CARD doménnel rendelkezőké lila, a DED tandem doménnel rendelkezőké sárga, az apoptotikus funkciójúaké kék, a rövid pro-doménűeké pedig szürke. A római számok és a kaszpázokat jelző arab számok fekete színnel láthatók.

15.8. ábra A kaszpázok besorolása a szerkezeti és funkcionális alapon képzett csoportokba: a funkcionális csoportokat római számok jelzik

A kaszpázok szerepe az eukarióta sejtek működésében sokkal kiterjedtebb, mint azt korábban gondolták. Az irreverzibilis apoptózis mellett számos sejtszintű átrendeződési folyamatban (remodeling) nélkülözhetetlenek (bővebben l. „A kaszpázok élettani funkciói” c. fejezetet.). Nem meglepő tehát, hogy mai ismereteink szerint az emberi fehérjekészlet (proteom) mintegy 1000 féle fehérjéről tudjuk már azt, hogy limitált hasításukat kaszpázok végzik (l. „A kaszpázok szubsztrátjai” c. fejezetet).

A kaszpázok aktivációja

Amint azt már korábban említettük, a prokaszpázok aktiválása limitált proteolízissel, azaz a prodomének lehasításával és a nagy (p20) és kis (p10) alegységek közötti, kaszpáz specifikus konszenzus szekvencia melletti peptidkötések elbontásával történik (15.5. ábra). Mivel a hasító-helyet kijelölő (konszenzus) szekvencia egyben kaszpáz-specifikus is, ennek alapján a kaszpázokra jellemző az autokatalízis (amikor ugyanazon típus molekulái kölcsönösen hasítják egymást). Többféle kaszpázról lévén szó, ez egyben azt is lehetővé teszi, hogy a kaszpázok több tagból álló reakció sorokba rendeződjenek (úgynevezett kaszpáz-kaszkádok). Nyilvánvaló, hogy a sor elején olyan molekulák állnak, amelyek autokatalízissel aktiválódnak – ezek lesznek az iniciátor kaszpázok, míg a kaszkád sort a végrehajtó kaszpázok zárják (15.6. ábra).

A 15.5. ábrán egyértelműen látható, hogy az aktív enzimet két-két p20 és p10 domén alkotja, ami csak két prokaszpáz molekulából származhat. Az aktivációnak tehát van még egy feltétele, s ez a proenzimek összegyűjtése, toborzása (recruiting), hiszen az aktív enzim kialakításához a hasítás és a dimerizáció egyaránt fontos lépés.

Az iniciátor kaszpázok esetében az aktiváció nagy, többkomponensű molekuláris komplexumokban történik (DISC vagy apoptoszóma, illetve PIDDoszóma, l. később), míg az effektor kaszpázokat vagy aktív iniciátor kaszpázok, vagy a citotoxikus T-sejtek által a célsejtbe juttatott granzim-B (granzyme-B) enzimek, vagy Ca2+-aktivált proteolitikus enzimek, az úgynevezett kalpainok aktiválják.

A kaszpázok szubsztrátjai

A kaszpázok szubsztrátjai között szerepelnek a sejthalál folyamatában meghatározott szereppel rendelkező, strukturális vagy szabályozó szerepet betöltő fehérjék, amelyek a sejt szinte minden kompertimentumában és működésének minden szintjén megtalálhatók. Hasításuk következtében a sejt vázrendszere összeesik és a fehérje szintézis minden szinten ellehetetlenedik. Felszámolódnak a fokális kapcsolatok, amelyek a sejtet a szomszédokhoz, illetve az extracelluláris mátrixhoz kötik: ez lehetővé teszi a sejt zsugorodását és környezetből való kiválását.

A kaszpáz szubsztrátok között megtaláljuk magukat a pro-kaszpázokat, valamint a pro- és antiapoptotikus fehérjéket (l. később). Ezen kívül vannak citoplazma (β-aktin, fodrin, gelsolin, vimentin, citokeratinok) és magváz (laminok, nukleoporinok), valamint ER→Golgi transzportot, Golgi szerkezetet biztosító fehérjék, vezikuláris transzportban (clathrin-burok összeállítása), sejtadhézióban (desmosoma és nexus /gap junction/ felépítésében) résztvevő proteinek, az ECM kapcsolatot biztosító fehérjék (integrinek), jelátviteli útvonalakban (β-catenin, integrin útvonal) szereplők és egyben transzkripciót szabályozók (CREB, HSF, NF-κB), transzlációt (eukarióta transzlációs iniciátor faktor fehérjék), fehérje körforgalmat, RNS szintézist és illesztést, valamint sejtciklust (ciklin A, ciklin E, Cdk aktivitás) regulálók, végül pedig a DNS replikációban és hibáinak kijavításában (ICAD, acinus, helicard, PARP) résztvevő proteinek. A proteolízis hatására egyesek inaktiválódnak, mások pedig aktiválódnak: az anti-apoptotikus fehérjék (pl. Bcl-2)– az elvárásnak megfelelően – az első csoportba, míg a pro-apoptotikus faktorok (l. Bcl-2 fehérjecsalád) és a kaszpáz inhibítorok a másodikba tartoznak (15.9. ábra).

A piros keretbe foglaltak aktiválódnak, a zöld keretben szereplők inaktiválódnak.

15.9. ábra Néhány fontos kaszpáz szubsztrát az eddig azonosított több száz közül. A fehérjéket funkcionálisan csoportosítottuk. A piros keretbe foglaltak aktiválódnak, a zöld keretben szereplők inaktiválódnak. A XIAP és Apaf-1 neve mögött zárójelben szereplő kérdőjel arra utal, hogy az inaktiváció csak feltételes.

A kaszpázok szubsztrátjainak azonosítására többféle molekuláris biológiai megközelítést alkalmaztak; ezek közül az apoptotikus sejtek szisztematikus proteomikai analízisével ma már közel 1000 szubsztrátot azonosítottak. Ezek listája sejtenként részben változó, aminek hátterében az áll, hogy egy adott kaszpáz sejttípus-függő mértékben aktiválódhat (egyes fehérjék csak masszív kaszpáz aktiváció alkalmával hasítódnak), illetve az, hogy egyes szubsztrátok szekvenciája organizmusonként kissé eltérő lehet, s a kaszpáz hasítási hely nem feltétlen őrződik meg (a ciklin A afrikai karmosbéka oocita apoptózisa során hasítódik, míg emlős sejtben nem). Az apoptózis jelenségének konzervatív voltából kiindulva azonban feltételezhetjük, hogy létezik a szubsztrátoknak egy jól körülhatárolható, a sejthalál folyamatának levezényléséhez, a környezeti reakciók beindításához és szabályozott lebonyolításához döntően szükséges köre. Ez a többszintű rendszer magába foglalja a 1) sejtciklus befagyasztását, 2) a DNS hibajavító (repair) mechanizmusok ellehetetlenítését, ezzel párhuzamosan a kromatin állomány kondenzációját, 3) a molekuláris szintű mechanizmusok szétszerelését, 4) a sejt környezetből való kiválását, elkülönülését, valamint 5) citokin prekurzorok előállítását.

A fenti, 15.9. ábra által közölt táblázatból csak néhány fehérjét emelünk ki részletesebb bemutatásra. Az apoptózis morfológiai jellegzetessége a kromatin állomány kondenzációja (l. 15.1. és 15.2. ábra) és a DNS feldarabolódása. A kondenzációban vesz részt az acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus) és a CARD mikrodomént hordozó DNS helikáz, a helicard (CARD-containing DNA helicase). Az apoptotikus sejt DNS állományának internukleoszómális (oligonukleoszómális) fragmentálásában kiemelkedő szerepet játszik a kaszpáz aktivált DN-áz, a CAD (caspase activated DNA-se). Az ép sejtben ezt egy inhibítor, az ICAD (inhibitor of CAD) kötött, inaktív állapotban tartja. A kaszpáz kaszkád aktiválódásakor a végrehajtó kaszpáz-3 elhasítja az ICAD fehérjét, amely ezt követően leválik a CAD molekuláról, így az utóbbi aktiválódik, bejut a magba és ott elhasítja a nukleoszómák közötti DNS szálat (16.10. ábra).

A PARP-1 ADP-ribóz polimereket köt bizonyos magfehérjékhez, ezzel a sérült DNS hibáit kijavító mechanizmus beindítója. Korábban úgy gondolták, hogy a kaszpáz-3 általi inaktiválása letális DNS elváltozásokhoz vezetve járul hozzá a sejt halálához. Azt figyelembe véve azonban, hogy a PARP tevékenysége, így a DNS hibáinak kijavítása igen nagy energiát emészt fel, ennek a folyamatnak kaszpáz-3 általi kikapcsolása a sejt ATP szintjének megőrzésében játszik szerepet. Míg az apoptózis energiaigényes folyamat, addig az energia hiány a sejt nekrózissal történő gyors halálához vezet. (Kaszpáz rezisztens PARP jelenléte, illetve ATP elvonás az apoptózist kiváltó stimulusok mellett is nekrotikus sejthalált eredményez.) A PARP tehát inkább az apoptotikus és a nekrotikus sejthalál típus közötti egyensúly felbillentésére szolgáló molekuláris kapcsolóként fogható fel, inaktivációja az energiaszint megőrzésén keresztül biztosítja az apoptózis energetikai hátterét.

A hagyományos felfogás szerint az apoptózis és a gyulladás folyamata egymástól elhatárolt események, az apoptózist nem kíséri gyulladás. Mai ismereteink szerint azonban a két folyamat több szinten is kapcsolatban van egymással. Tudjuk, hogy a kaszpáz 1 olyan citokin prekurzorok érésében is főszerepet játszik, amelyek gyulladáskeltők (l. piroptózis).

Felhívjuk a figyelmet arra, hogy ahhoz, hogy egy szubsztrátként azonosított molekula hasítása az adott körülmények között az élő sejtben megtörténjen, az szükséges, hogy az aktivált enzim és a szubsztrát ugyanazon kompartmentumban legyen. Erre a proteomikai eredmények nem adnak információt, így a reakció végbemenetelének bizonyítására az ultrastrukturális szintű morfológiai vizsgálat elengedhetetlen.

A kaszpázok élettani funkciói

A kaszpázok fiziológiai funkcióinak áttekintésekor két alapvetően eltérő helyzetet érdemes elkülönítenünk. Az egyikben a kaszpázok sora aktiválódik, azaz apoptotikus sejthalál következik be, ami az adott sejt célzott eliminációját szolgálja. A másik esetben egy-egy kaszpáz olyan folyamatban vesz részt, amelynek nem a sejt elpusztítása, hanem valamilyen végdifferenciációs folyamat lebonyolítása a célja.

Az apoptózis és a szöveti átszerveződés

Az apoptózisnak az alaki fejlődésben (morfogenezisben) betöltött szerepe mindenki előtt ismert. Gondoljunk csak a lárvális szövetek eliminációjára a metamorfózis (15.10. ábra), vagy a nagyszámú felesleges idegsejt eltávolítására az idegrendszer fejlődése során. A sejthalál e típusa újraformálhatja a test alakját szöveti reorganizáció nélkül (l. az interdigitális szövetrészek eltávolítása a végtagfejlődés során), vagy a környezetben indukált szöveti (extracelluláris mátrix) átszerveződéssel is. Az önálló ujjak kialakításának folyamata egy kőszobrász munkájához hasonló, ahol a művész a felesleges részek eltávolításával, a környezet meghagyásával formálja meg a végleges alakot (15.11. ábra).

A rajz szürke árnyalatos, a figurák kör mentén rendezettek. A fejlődés 2 óra irányában a zigótával kezdődik, a kifejlett béka pedig 12 óra táján található.

15.10. ábra Az afrikai karmosbéka (Xenopus laevis) metamorfózisa. Az átalakulás során az egyik legfeltűnőbb változás az ebihal farkának regressziója: a „felesleges” szövetrészek apotózissal pusztulnak el.

Bal oldalon egy színes fotó, közepén a jobbra néző az embrióval. Jobb oldalon egymás alatt két rajz: a felsőn pirossal kitöltött az ujjak közötti terület, ami eliminálódik.

15.11. ábra Az apoptózis szerepe szövetrészek eltávolításában. A) Emberi magzat végtagbimbói. B) Az ujjak közti területek (piros) felszámolása a környezet érintetlenül hagyásával történik.

Amikor az apoptózisnak aktív szerepe van a környezet átalakításában, az inkább egy fém megmunkálásához hasonlít, ahol lényeges méretű szövetrészek kiemelése nélkül, inkább a felszín átalakításával formálódik meg az új alakzat. Régóta ismert, hogy az apoptotikus sejtek képesek üzeneteket küldeni nagyobb távolságokra. Ilyen üzenetek a makrofágokat csalogató „találj meg” („find me”) és a bekebelezést serkentő „egyél meg” („eat me”) szignálok (l. később). Csak az utóbbi időben figyeltek fel arra, hogy a pusztuló sejtek a közvetlen környezetükkel is kommunikálnak. Az például, hogy az apoptotikus hámsejtek kilökődnek a hámrétegből, annak is köszönhető, hogy hatással vannak a szomszédos sejtek vázára, s abban a sejtek alakját megváltoztató folyamatokat indukálnak. Ez a folyamat működhet biológiai „ollóként” is, melynek eredményeképpen szomszédos szövetrészek elszigetelődnek egymástól (a jelenség megfigyelhető az ecetmuslica embrionális fejlődésében szelvényhatárok kijelölése és megtartása során).

A sérülés által kiváltott apoptózis esetében több modell szervezetben (hidra, planária, ecetmuslica, gőte, afrikai karmos béka, egér) megfigyelték, hogy a pusztuló sejtek mitogén szignálokat bocsátanak a környezetükbe. Ha a sejt életben marad (pl. kaszpáz inhibítorok hatására), akkor ez a szövet túlburjánzásához (hiperplázia), a szerv normálisnál nagyobb méretűvé válásához vezet. Ha elpusztul, akkor helyét a sejtosztódással létrejött új sejtek foglalják el. A mitogén szignálok kibocsátásának a zavartalan egyedfejlődés során is szerepe lehet, erre utal az, hogy a jelenséget a Drosophila ivarsejtképző sejtvonalának sejtszám szabályozása során is megfigyelték. (A „zavartalan” jelző itt „szokásost” jelent, hiszen a sejtek számára az egyedfejlődés számtalan stresszhelyzetet teremt, ami lényegében nem különbözik a sebzés okozta „megrázkódtatástól”.)

Néhány éve ismert, hogy az apoptózissal elpusztuló sejtek egy sejtrétegben olyan húzóerőt generálhatnak, ami befolyásolja a morfogenetikus sejtvándorlások sebességét. A Drosophila embrió egyedfejlődésének késői lépése az, amely során a háti oldalt borító átmeneti amnioserosa szövete felszívódik, s helyét epidemisz foglalja el. A folyamat során az amnioserosa területe zsugorodik, a lateralis felhám rétege pedig dorsalis irányba terjeszkedik mindaddig, amíg a háti középsíkban a jobb és bal oldali szélei összeérnek (dorsal closure). A folyamat valószínűleg az amnioserosa sejtjeinek mintegy 10%-ától indul: ezek a sejtek apoptózissal pusztulnak el, s közben a sejtváz átszerveződését, így alakváltozást indukálnak a szomszédaikban. Az apoptotikus sejtek száma aktívan hat a környezetre: a sejtpusztulás intenztitásának növelése (ektopikus expresszió) a folyamat gyorsulását, míg a pusztuló sejtek számának csökkentése (apoptózis gátlás) a dorzális záródás késleltetését eredményezi (15.12. ábra).

A rajzok vonalasak, a piros területek apoptotikus sejtek, a zöldek pedig az őket körülvevő amnioserosa sejtjei.

15.12. ábra Az apoptózis morofgenetikus szerepe az ecetmuslica epidermiszének záródásában. A) A felső ábrasor a Drosophila lárva dorsalis felszínét ábrázolja az amnioserosa területével. Ebben a piros pöttyök az apoptotikus sejtek jelenlétére utalnak. A középső rajzon a kék nyilak azt a húzóerőt jelzik, amit a pusztuló sejtek a környezetükben keltenek, s amelynek hatására az epidermisz réteg szélei a dorsalis középsík felé húzódnak. A jobb oldali ábrán a záródás már csaknem teljes. Az alsó képsor az amnioserosa kinagyított területén egy apoptotikus sejtet és ennek szomszédait mutatja nagy nagyítással. A szomszédokban kialakított, fokozatosan növekvő megnyúlás lehet a forrása annak a húzóerőnek, amit a pusztuló sejtek a környezetükben keltenek. (A szomszédos sejtek helyzete a határoló négyzethez képest az ábrasor mentén változatlan!) B) Az apoptotikus mintázat változásának hatása a dorsalis záródás sebességére: az apoptotikus sejtek számának emelése a záródás sebességét növeli, míg a sejthalál gátlása a záródást lassítja.

A kaszpázok nem-apoptoptikus funkciói

Az előző példákkal ellentétben egyes morfogenetikus lépésekben nem a teljes kaszpáz hálózat aktiválódik, azaz az aktiválódás nem vezet apoptotikus sejthalálhoz. Ezekben a folyamatokban az enzimek nem–apoptotikus funkciói kerülnek előtérbe. Ahhoz, hogy ez a folyamat ne vezessen sejthalálhoz, az aktivációnak térben és időben nagyon szabályozottnak, átmenetinek és limitáltnak kell lennie. Arról kevés ismeretünk van, hogy milyen tényezők biztosítják azt, hogy a folyamat során csak bizonyos szubsztrátok hasítása történjen, mások pedig érintetlenek maradjanak. A háttérben állhat a kaszpázok kompartmentumokhoz kötése, anti-apoptotikus faktorok koordinált expressziója, illetve a kaszpáz aktivitás inhibítorok segítségével történő féken tartása.

Az in vitro és in vivo (kaszpáz hiányos transzgenikus egértörzseken végzett) kísérletek eredményeit a 15.I. táblázat foglalja össze. Ebből csak néhány példát emelünk ki. Az iniciátor kaszpázok közül egérben a kaszpáz-8 hiánya rendellenes érfejlődéssel jár, ami más szervek morfogenezisére is végzetes hatással van: az embriók az intrauterin élet felének tájékán meghalnak. A kaszpáz-9 génjének kiütése nem jár 100%-os letalitással, s a túlélőkben késleltetett velőcső záródást, tágult agykamrákat, hibás axon növekedést és gyenge szinaptikus jelátvitelt eredményez. A végrehajtó kaszpázok közül a kaszpáz-3 esetében jegyezték fel, hogy – hasonlóan a kaszpáz-9-hez – hiánya az idegrendszer rendellenes fejlődéséhez vezet. Az enzimhiányos egerek nagy része a születés tájékán meghal.

15.I. táblázat. A kaszpázok nem-apoptotikus funkcióinak összefoglalása.

NÉV

FENOTÍPUS

FELTÉTELEZETT FUNKCIÓ

kaszpáz-1

normális fejlődés, egyes sejttípusokban csökkent apoptózis intenzitás

vírusfertőzések és tumor-képződés elleni védelem

kaszpáz-2

normális fejlődés, sterilitás, rendellenes apoptózis csak egyes sejtvonalakban

különböző pro-apoptotikus útvonalak tagja

kaszpáz-3

születés körüli, változó okokra visszavezethető letalitás; a túlélők agyi hiperplasiat mutatnak

nélkülözhetetlen a neuronális sejthalálban, s egyes sejttípusok differenciálódásában

kaszpáz-8

embrionális letalitás

halál receptor útvonal tagja, érrendszer fejlődése, immunsejtek differenciációja, epidermalis sebgyógyulás

kaszpáz-9

születéskori, nem 100%-os letalitás, a túlélők agyi hiperplasiat mutatnak

fontos a neuronális sejthalálban és a citotoxikus drogok és besugárzás elleni védelemben

kaszpáz-11

normális fejlődés, sterilitás

bakteriális fertőzések elleni védelem

kaszpáz-14

normális fejlődés, sterilitás

keratinizáció

A szervezet bizonyos sejtjei differenciálódásuk során „elveszítik” a sejtmagjukat. Ez a sejtmag degradáció vagy kilökődés olyan esetekben figyelhető meg, ahol az érett sejtek funkciója egy bizonyos fehérje nagymennyiségben való felhalmozásával kapcsolatos (pl. keratin, krisztallin, hemoglobin). A keratinizáció speciális, sejthalállal végződő differenciációs folyamat, melynek során a kaszpáz-14 a fillagrin aminosavakká történő lebontásában vesz részt: a keletkező aminosavaknak a felhám hidratálásában van szerepük (15.13. ábra). Kaszpáz aktiváció kimutatható a lencserostok magjának lebomlásakor is, az erythropoesis, a megakariociták fejlődésére, a vérlemezkék képződése, a makrofágok és a vázizomzat fejlődése, a spermatidák individualizálódása (a közöttük lévő citoplazma hidak felszakadása) során is. Természetesen nem feledkezhetünk meg a citokinek érésében, az örökletes (nem specifikus) immunrendszerben (innate immune system), valamint egyes betegségek kialakulásában betöltött szerepükről sem (l. következő fejezet).

A bal oldali fotó és a jobb oldali rajz is színes. A jobb oldalon az események lentről fölfelé követik egymást, a fillagrin sötétkékkel jelzett.

15.13. ábra A kaszpáz-14 szerepe a fillagrin lebontásában. Az oldhattalan, foszforilált fillagrin a szemcsesejtek rétegében (str. granulosum) a keratohialin granulumokban halmozódik fel. Defoszforiláció után a citoszolba kerül, ahol hidrolízissel funkcionális fillagrin képződik belőle. Ezt a transzglutamináz citokeratin fibrillumokhoz köti, ami erősíti a sejtvázrendszert és a sejtek ellapulását okozza. A fillagrin deiminációja érzékennyé teszi azt proteázokkal szemben. A természetes hidratáló anyagokat eredményező, lépcsőzetes lebontásban – több enzim mellett – a kaszpáz-14 is fontos szerepet játszik.

Az apoptózis és a kaszpáz aktivitás betegségekben betöltött szerepe

Mint láttuk, az apoptózis rendkívül összetett folyamat. Részfolyamatainak tér és időbeli rendezettsége hierarchikus és egymáshoz kapcsolódásuk szigorúan szervezett. Az összehangolásban fellépő bármilyen zavar, ami akár lassítja, akár „felpörgeti” az egyes részfolyamatok intenzitását, betegségek megjelenéséhez vezet. A jelenség kimutatható daganatok kialakulása és fennmaradása, tartós virális fertőzések, autoimmun folyamatok, neurodegeneratív betegségek esetében.

Megkérdőjelezhetetlen bizonyos kaszpázok és kaszpáz szubsztrátok szerepe az autoimmun betegségek kialakulásában. Az intenzív apoptózis során keletkező, kellő gyorsasággal el nem „takarított” sejttörmelék nagy mennyiségben tartalmaz ugyanis intracelluláris, proteolitikus hasításon átesett fehérjéket. Ezekben a hasítás következtében autoantitestek képződését kiváltó, a natív térszerkezetben (még) rejtett részletek kerülnek felszínre. Ilyen, autoimmun betegségekben azonosított kaszpáz szubsztrátok a laminok, a fodrin és a PARP is.

A neurodegeneratív betegségek közül a Huntington- és az Alzheimer-kór kialakulásában van szerepe kaszpáz hasításnak. A huntingtin gén 5’ végén egy CAG triplet megsokszorozódása eredményezi azt, hogy a fehérje N-terminálisán egy poli-glutamin szekvencia jelenik meg. A huntingtint a kaszpáz-3 hasítja, mégpedig a poli-glutamin szakasz hosszával korreláló intenzitással. A proteolízis eredményeként a fehérjének egy olyan N-terminálist tartalmazó része keletkezik, ami amiloidogén, azaz oligomerizációra, s ezen keresztül aggregátumok képződésére hajlamos.

Az Alzheimer-kórban extracellulárisan felhalmozódó amiloid-beta40-42 (Aβ40-42) képződésében szintén felvetődött a kaszpáz-3 szerepe. Egyrészt az amiloid prekurzor fehérje (APP) olyan hasítási termékét állíthatja elő, amiből nagyobb valószínűséggel keletkezik patogén Aβ, másrészt képes az Aβ keletkezésében kulcsszerepet játszó γ-szekretáz egyik alegységének, a preszenilin 1-nek a hasítására is – ezzel a familiáris Alzheimer-kórban jellemző tüneteket okozza. A fokozott Aβ oligomer produkció apoptotikus neuron pusztuláshoz vezet, amely során a kaszpáz-3, mint effektor kaszpáz aktivitása nő. Transzgénikus egérben megfigyelték, hogy kaszpáz aktivitás előzi meg az AD kialakulásában szintén kulcsszerepet játszó tau páros helikális kötegek képződését is.

Az irodalomban arról is találunk adatot, hogy kaszpázoknak szerepe van a motoneuronok betegségeként számon tartott ALS (amyotrophic lateral sclerosis) és a fokozott asztrocita aktivációt jelentő asztrogliózis kialakulásában is.

Ellenőrző kérdések

  1. Sorolja fel az apoptotózis morfológiai jellemzőit!

  2. Mutassa be a kaszpázok közös tulajdonságait!

  3. Csoportosítsa a kaszpázokat azok prodomén szerkezete alapján!

  4. Csoportosítsa a kaszpázokat azok funkciói alapján!

  5. Milyen elemekből épül fel a kaszpáz-kaszkád?

  6. Milyen kaszpáz szubsztrátokat ismer? Csoportosítsa ezeket helyzetük és funkciójuk szerint! Legyen köztük struktúr és adhéziós fehérje, sejtciklus és transzkripció szabályozó, valamint a DNS állomány épségét fenntartó!

  7. Mi a kaszpázok élettani jelentősége? Milyen folyamatokban vesznek részt a fejlődés során? Említsen olyan eseményt, ami apoptózissal jár, s olyat, amiben nem következik be sejthalál!

Felhasznált és ajánlott irodalom

Crawford, E. D., Seaman, J. E., Barber, A. E., David, D. C., Babbitt, P. C., Burlingame, A. L., Wells, J. A. (2012) Conservation of caspase substrates across metazoans suggests hierarchical importance of signaling pathways over specific targets and cleavage site motifs in apoptosis. Cell Death Differ.19(12), 2040-2048. doi: 10.1038/cdd.2012.99

Crawford, E. D., Wells, J. A. (2011) Caspase Substrates and Cellular Remodeling. Annu. Rev. Biochem. 80, 1055-1087. doi:10.1146/annurev-biochem-061809-121639

Eimer, W. A., Vassar, R. (2013) Neuron loss in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease correlates with intraneuronal Abeta42 accumulation and Caspase-3 activation. Mol Neurodegener.8, 2-12. doi: 10.1186/1750-1326-8-2.

Fischer, U., Janicke, R. U., Schulze-Osthoff, K. (2003) Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ. 10(1), 76-100. doi: 10.1038/sj.cdd.4401160

Hart, M. P., Gitler, A. D. (2012) ALS-associated ataxin 2 polyQ expansions enhance stress-induced caspase 3 activation and increase TDP-43 pathological modifications. J Neurosci. 32(27), 9133-42. doi: 10.1523/jneurosci.0996-12.2012

Hoste, E., Kemperman, P., Devos, M., Denecker, G., Kezic, S., Yau, N., Gilbert, B., Lippens, S., De Groote, P., Roelandt, R., Van Damme, P., Gevaert, K., Presland, R. B., Takahara, H., Puppels, G., Caspers, P., Vandenabeele, P., Declercq, W. (2011) Caspase-14 is required for filaggrin degradation to natural moisturizing factors in the skin. J Invest Dermatol.131(11), 2233-41. doi: 10.1038/jid.2011.153.

McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. (2013) Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol.5(4), a008656. doi: 10.1101/cshperspect.a008656.

Metcalfe, M. J., Huang, Q., Figueiredo-Pereira, M. E. (2012) Coordination between proteasome impairment and caspase activation leading to TAU pathology: neuroprotection by cAMP. Cell Death Dis.3, e326, doi: 10.1038/cddis.2012.70

Miura, M. (2012) Apoptotic and nonapoptotic caspase functions in animal development. Cold Spring Harb Perspect Biol.4(10), pii: a008664. doi: 10.1101/cshperspect.a008664.

Park, H. H. (2012) Structural features of caspase-activating complexes. Int J Mol Sci.13(4), 4807-18. doi: 10.3390/ijms13044807.

Perry, J. A., Kornbluth, S. (2007) Cdc25 and Wee1: analogous opposites? Cell Div.2: 12. doi: 10.1186/1747-1028-2-12

Ryoo, H. D., Bergmann, A. (2012) The Role of Apoptosis-Induced Proliferation for Regeneration and Cancer. Cold Spring Harbor Perspect. Biol.4(8), a008797. doi: 10.1101/cshperspect.a008797

Suzanne, M., Steller, H. (2013) Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ.20(5), 669-75. doi: 10.1038/cdd.2013.11.

Young, M. M., Takahashi, Y., Khan, O., Park, S., Hori, T., Yun, J., Sharma, A. K., Amin, S., Hu, C. D., Zhang, J., Kester, M., Wang, H. G. (2012) Autophagosomal membrane serves as platform for intracellular death-inducing signaling complex (iDISC)-mediated caspase-8 activation and apoptosis. J Biol Chem.287(15), 12455-68. doi: 10.1074/jbc.M111.309104.



[5] execution: kivégzés

[6] Sajnos a szupercsalád és az egyik alcsalád neve ugyanaz.