16. A sejthalál receptorok, apoptózis külső stimulusra (I. típus)

Indukció a halál receptorokon keresztül

A külső útvonalon keresztül aktivált apoptózis egészséges, de nem kívánatos, esetleg veszélyes sejtek eltávolítására szolgál. Ebben az esetben az iniciátor kaszpázok tandem DED doménnel rendelkező proenzimei (prokaszpáz -8 és -10) közvetlenül a célsejt membránjához kötődő sejthalál indukáló molekuláris komplexum (death inducing signaling complex, DISC) révén aktiválódnak (16.1. ábra).

A DISC fő komponensei a halál receptorok (death receptors, DR), amelyek valamennyien a tumor nekrózis faktor receptor (TNF-R) szupercsalád tagjai. Közös szerkezeti jellemzőjük, hogy a sejtközötti tér felé néző ligandum-kötő régiójuk mellett van egy hidrofób transzmembrán doménjük, valamint a C-terminálison egy fehérje-interakciós, úgynevezett halál doménjük (DD). Ilyen receptorok többek között a TNF-α receptor (tumor necrosis factor-α receptor, TNF-R1) a Fas (TNF receptor superfamily member 6, más neveken: CD95, Apo1, TNFRSF6) és a TRAIL-receptorok (TNF-alpha-related-apoptosis-inducing ligand receptor) is. Ma már a sejthalál receptorok esetében is törekszenek a nevezéktan egységesítésére, és számozással történő megkülönböztetésükre. Valamennyi sejthalál receptorra a DR rövidítést használják (DR1: TNF-R1, DR2: Fas/Apo1/CD95, DR3: Apo2, DR4: TRAIL-R1, DR5: TRAIL-R2).

A DISC komplex

A DISC összeszerelődése

A halál receptor citoplazmatikus vége köré szerveződő sejthalál indukáló molekuláris komplexum, röviden DISC összetétele a legegyszerűbb a Fas esetében. Ez a receptor (Fas), a FADD (Fas associated death domain) és a pro-kaszpáz-8 molekulákból szerelődik össze. A jelfelfogó receptor és a jelátvitelt megvalósító kaszpáz között a FADD hídként szolgál, mivel a pro-kaszpázok nem képesek közvetlenül a Fas molekulához kötődni. Körülményektől függően a pro-kaszpáz-8 helyett a komplex része lehet a pro-kaszpáz-10 vagy a kaszpáz-8 homológ FLIP is.

A DISC összeszerelődése (kölcsönhatások kialakulása a receptorok és a FADD molekulák között) ligandum jelenléte nélkül nem következik be. Mivel a komplex összeállása szó szerint végzetes következményekkel jár, a folyamatnak rendkívül szigorúan szabályozottnak kell lennie. Ugyanakkor az önszerveződés gyorsasága szükséges akkor, amikor a külvilágból érkező jelzés (ligandum) valóban jelen van.

A DISC összeállásának alapfeltétele a receptor trimerizációja. Ez általában egy speciális membrán környezetben (lipid tutaj, raft) történik, s akár véletlenszerű esemény is lehet. A Fas trimerizációjával annak intracelluláris végén lévő halál doménje (Fas-DD) olyan konformáció változáson megy át (2 hélixének átrendeződésével), amelynek következtében felszínén kialakul a más molekulák DD doménjével kötést kialakítani képes felszín. Ez a receptor (DD domén) úgynevezett nyitott formája, ami azonban csak ligandum kötése, a receptor csoportosulása (klaszterizációja) nyomán stabilizálódik megfelelő mértékben ahhoz, hogy FADD adapter fehérjék DD doménjeit kösse, azaz FADD molekulákat toborozzon. A ligandum jelenléte már nem véletlenszerű, így a FADD-nak a DISC komplexbe vonása már szintén nem történhet meg véletlenszerűen. A megkötött FADD fehérjék ezután a másik fehérje-interakciós doménjükkel, a halál effektor doménnel (DED) kaszpáz-8 proenzimek DED régiójával képesek kölcsönhatásba lépni: a pro-kaszpázok komplexbe épülése ekkor már elkerülhetetlen. Ezt a folyamatot vázlatosan, a valós sztöchiometriai és szimmetriaviszonyokat nem tükrözve az 16.1. ábra mutatja be.

A Fas molekulák szürkék, a membrán sötétkék, a lipid tutaj zöld, a FADD adapter fehérje fekete és bordó, a pro-kaszpáz DED doménjei pirosak, a p20 doménje barna, a p10 doménje pedig világoskék.

16.1. ábra A Fas DISC összeszerelődésének lépései. A Fas lipid tutajban (zöld plazmamembrán szakasz) történő oligomerizációja során a monomer Fas DD doménje globuláris, zárt konformációjú állapotból (A) instabil, nyitott formájúvá alakul (B). A nyitott formát a Fas-ligandum (be)kötése által indukált receptor csoportosulás (klaszterizáció) stabilizálja. A stabil Fas-DD doménhez a FADD adapter fehérje DD doménje képes kötődni, s ezzel lehetővé válik a pro-kaszpáz-8 DED doménen keresztüli toborzása is.

A Fas DD doménjének nyitott formában történő stabilizálása feltehetően nemcsak a FADD kötőhelyet alakítja ki, hanem abban is szerepe van, hogy két-két, nem ugyanabba a trimerbe tartozó Fas molekula között híd képződjön. Ennek következtében a kialakuló DISC nem más, mint egy több egységből álló molekuláris hálózat, amelyben egymást segítő (stabilizáló) hálószemek vannak. Ebben a rendszerben megállapíthatók ugyan „alapegységek” (sztöchiometriai arány az egyes komponensek között), arról azonban, hogy ezekben a ligandumok, a halál receptorok és a FADD molekulák milyen arányban vesznek részt, nincs egységes vélemény az irodalomban.

A TNF-α receptorhoz a FADD adapter fehérje nem képes közvetlenül hozzákapcsolódni, ezért a DISC-be egy másik közvetítő fehérje is beépül. Ez a TRADD (TNF receptor-associated via death domain), aminek DD doménje van, de DED doménnel nem rendelkezik (16.2. ábra).

A TNF receptorok rózsaszínűek, a sötétkék membránban ülnek. A TRADD adapter fehérjék kékek, a FADD fehérjék barnák, a kaszpázok DED doménjei pirosak, p20 doménjei barnák, p10 doménjei pedig világoskékek.

16.2. ábra A TNF-R1 köré szerveződő apoptózist indukáló DISC. Ebben a receptorhoz két adapter fehérje kapcsolódik: az első a receptor DD doménjéhez kapcsolódó TRADD, a második az ehhez kötődő FADD. A FADD DED doménje révén pro-kaszpázokat toboroz a DISC-be.

A sztöchiometriai arány és a komponensek geometriai elrendeződésének fontosságára utal az, hogy az említett halál receptoron keresztül apoptózis és nem-apoptotikus válasz egyaránt kiváltható. A Fas esetében az elsőt membránkötött, a másodikat pedig szolubilis ligandum kötése indítja be. Membránkötött ligandum esetében a ligandumok térbeli eloszlását, mintázatát a sejthalált indukáló sejt (pl. T-sejt) plazmamembránjának doménszerkezete határozza meg.

Megjegyezzük, hogy a sejthalál beindításához szükséges, megfelelő mennyiségű pro-kaszpáz aktiválását elvégezni képes méretű és kiterjedésű DISC összeszerelődése nem feltétlen (csak) a sejtfelszínen történik, mivel a sejthalál receptorok internalizálódnak, így az endoszómális rendszerben gyűlnek fel. Kísérleti adatok szerint a FADD molekulák jelentős része is az endoszóma membrán külső (citoplazmatikus) felszínéhez toborzódik, s itt jön létre az úgynevezett receptoszóma (16.3. ábra).

A sötétkék membránban ülő Fas molekulák szürkék, a FADD adapter fehérjék barnák, a kaszpázok egyes doménjei a szokásos színezetűek (piros, barna, világoskék). A folyamat a rajz bal oldalán kezdődik, az internalizáció a kép közpén látható.

16.3. ábra A receptoszóma felépítése. A receptoszóma úgy alakul ki, hogy az internalizálódott, endoszómális halál receptorok köré kiterjedt DISC szerveződik.

A DISC működésének szabályozása: választás élet és halál között

Ahogy azt az előző fejezetben említettük, a Fas (DR2) esetében az összeszerelődő DISC (Fas DISC) FADD adapter fehérjéinek DED doménjeihez kétféle DED domént hordozó protein kötődhet: az egyik a pro-kaszpáz-8/10, a másik a c-FLIP (cellular FLICE-inhibitory proteins).

A DISC-ben az aktív kaszpáz létrehozásához a pro-kaszpáz molekulák megfelelő közelsége (oligomerizációja) kell, valószínűleg azért, mert a két molekula egymást hasítja. A kaszpáz-8 létrehozása két egymást követő proteolítikus lépést igényel. A zimogén és az aktív, iniciátor szerepet betöltő enzim szubsztrát specifitása eltérő: míg a pro-kaszpáz-8 specifitása nagyon szűk határok között mozog, addig a kaszpáz-8 jóval több szubsztrátot képes elhasítani. A DISC-ben mindkét aktivitás mérhető, tehát a pro-kaszpáz és a kaszpáz is aktív.

Említettük, hogy a Fas receptorhoz apoptotikus és nem-apoptotikus jelátviteli útvonal is kapcsolódik. Az aktív kaszpáz-8 enzimet eredményező második hasítási hely tönkretétele meggátolja az apoptózist, ugyanakkor a nem-apoptotikus jelátvitelt nem érinti. A két jelátviteli útvonal tehát „szétkapcsolható”. Tudjuk azt is, hogy pro-kaszpáz-8 katalitikus alegységének foszforilációja szintén megszünteti a pro-apoptotikus funkciót, ugyanakkor a pro-enzim DISC-en belüli ubiquitinilációja pro-apoptotikus hatású.

A Fas DISC-en belül a pro-kaszpáz-8 inhibítora a c-FLIP fehérje, melynek három izoformája ismert. Ezek a hosszú c-FLIPL (long), és a két rövid c-FLIPS (short) és c-FLIPR (raji) forma. Mindegyiknek két DED doménje van, így képesek kötődni a FADD adapter molekulákhoz. A két rövid változat anti-apoptotikus, míg a hosszú a körülményektől (receptor stimuláció erőssége, más c-FLIP formák koncentrációja) függően lehet pro- és anti-apoptotikus hatású is. A c-FLIP proteolízisét, azaz további két hasított, rövid forma létrehozását a DISC-ben a pro-kaszpáz-8 végzi. A két c-FLIP hasítási terméke is anti-apoptotikus hatású (16.4. ábra).

A DED domének pirosak, a p20 domének világoszöldek, a p12 domének sötétzöldek. A hasított formák alul találhatók.

16.4. ábra A kaszpáz-8 inhibítor c-FLIP fehérjék. A három teljes hosszúságú izoforma, valamint a hasított, rövid c-FLIP fehérjék is rendelkeznek tandem DED doménnel. Mindegyik protein anti-apoptotikus hatású, a c-FLIPL azonban lehet pro-apoptotikus is.

A cFLIP fehérjék tandem DED doménjük révén versenyeznek a pro-kaszpáz molekulákkal a DISC-beli FADD kötőhelyekért (16.5. ábra), s a verseny eredményeként kaszpáz-kaszpáz homo- és kaszpáz-c-FLIP heterodimerek is keletkezhetnek. A receptorból kiinduló szignalizáció jellegét ennek alapján a bekötődő komponensek aránya fogja meghatározni. Régóta ismert, hogy a Fas jelátvitel nem csak apoptózist eredményezhet, hanem segítheti a sejt túlélését is. Ez utóbbi esetben a szignalizáció az NF-κB (nuclear factor-kappa B) aktivitásának emelkedését eredményezi. Ehhez mind a pro-kaszpáz-8, mind pedig a c-FLIP aktivitása szükséges, hiszen ebben a szignalizációs útvonalban a c-FLIP hasított formái vesznek részt. Az útvonal beindításához az kell, hogy a pro-kaszpáz-8 aktív legyen, de ugyanakkor ne keletkezzen belőle az apoptózist beindító, aktív kaszpáz8.

A Fas molekulák szürkék, a hozzájuk kapcsolódó FADD adapter fehérjék barnák, a kaszpázok piros-barna-világoskék (balra lent), a c-FLIP fehérjék pedig piros-világoszöld-sötétzöld (jobbra lent) színezetűek. A membrán sötétkék.

16.5. ábra Tandem DED doménnel rendelkező fehérjék versengenek a DISC-beli kötőhelyekért. A receptorból kiinduló jelátviteli útvonalat a bekötődő komponensek aránya határozza meg.

A Fas receptor köré szerveződő DISC tehát két szignalizációs útvonal kiindulópontja: az egyik a sejthalált, a másik a túlélést jelenti (16.6. ábra). Azt, hogy a receptor stimulációját követően melyik útvonal aktiválódik, a pro-kaszpáz-8 és a c-FLIPL citoplazmatikus, következésképpen DISC-beli arányától függ. A DISC-beli FADD protein DED kötőhelyeiért két citoplazmatikus DED domént hordozó fehérje verseng: a c-FLIPL és a pro-kaszpáz-8. Ha alacsony a c-FLIP mennyisége, akkor a DISC komplexben pro-kaszpáz túlsúly alakul ki, aktív kaszpázok keletkeznek, ami apoptózishoz vezet. Növekvő c-FLIPL szint viszont az NF-κB útvonalat aktiváló hasított c-FLIP termékek mennyiségének emelkedését eredményezi. Magas c-FLIPL koncentrációnál a pro-kaszpáz-8 teljesen kiszorul a DISC-ből, így nem képződik sem aktív kaszpáz, sem pedig hasított c-FLIP molekula, tehát egyik jelátviteli útvonal sem aktiválódik.

A Fas molekulák szürkék, ligandumaik barnák, a Fas-hoz kapcsolódó FADD adapter fehérjék barnák, a kaszpázok piros-barna-világoskék (balra lent), a c-FLIP fehérjék pedig piros-világoszöld-sötétzöld (jobbra lent) színezetűek.

16.6. ábra A Fas DISC-be bekötődő DED proteinek versengése élet-halál kérdése fölött dönt. Koncentrációfüggő módon a Fas receptor trimer köré szerveződő DISC alkotója lehet a c-FLIP molekula is, amely gátolja a kaszpáz-8 aktivitás megjelenését a DISC-en belül. Alacsony cFLIP mennyiségnél a DISC-be csak pro-kaszpáz-8 épül be, ami aktív kaszpáz-8 enzimek keletkezéséhez, majd sejthalálhoz vezet. Magasabb c-FLIP koncentrációnál a c-FLIP verseng a FADD DED kötőhelyeiért, s részben elfoglalja azokat a pro-kaszpáz-8 molekula elől. Mivel a c-FLIP a pro-kaszpáz aktivitást nem gátolja, a bekötődött c-FLIP fehérjét a szomszédos pro-enzim elhasítja. Ezzel két anti-apoptotikus, NF-κB útvonalat serkentő, rövid c-FLIP termék keletkezik.

Úgy tűnik, hogy általánosítható az a megfigyelés, hogy a TNF receptorok jelátviteli útvonalában a DISC (másnéven I. komplex) mellett egy másik, a DISC-ből származó, úgynevezett II. komplex (complex II.) is részt vesz. Ezt a DR1 (TNF-α receptor-1) esetében írták le először. Összetevői a halál receptor nélküli DISC komponensek, esetleg jelátviteli útvonalanként (receptor típusonként) további molekulákkal kiegészítve. A Fas (DR2) halál receptor esetében a DISC kompnensei a Fas, a FADD molekulák, valamint a pro-kaszpáz8/10 és/vagy a c-FLIP fehérjék. A citoplazmában található II. komlex részei a Fas kivételével ugyanezek (16.7. ábra).

A Fas molekulák szürkék, ligandumaik barnák, a Fas-hoz kapcsolódó FADD adapter fehérjék barnák, a kaszpázok piros-barna-világoskék, a c-FLIP fehérjék pedig piros-világoszöld-sötétzöld színezetűek.

16.7. ábra A Fas jelátviteli útvonalon kialakuló DISC és a II. komplex komponensei. Az itt bemutatott esetben a DISC kialakításában a pro-kaszpáz-8 mellett c-FLIP molekulák is részt vesznek. A citoplazmában aktív II. komplex a receptor kivételével a DISC minden komponensét tartalmazza.

A FADD lokalizációjának szabályozó szerepe

A Fas DISC adapter fehérjéje a FADD, amelyről leírták, hogy foszforilációja sejtmagi transzportot tesz lehetővé. A sejtmagi felhalmozódásnak az adapter fehérje nem-apoptotikus (pl. a sejtciklus szabályozásában, proliferációban betöltött) funkciója során van szerepe. Újabban egyre több adat gyűlik össze arra vonatkozóan, hogy a FADD fehérjéknek a programozott nekrózis, azaz a nekroptózis beindításában, az apoptózis és a nekroptózis sejthalál típus közötti választásban milyen szabályozó szerepe lehet.

Annak, hogy a sejt „nyugalmi” állapotában a FADD nem a citoszolban található, biztonsági funkciója is lehet, hiszen megakadályozza azt, hogy véletlenszerűen összeálljon a DISC más komponenseivel, s így „akaratlanul” a sejt pusztulását okozza. Nukleáris lokalizációt korábban a tumor nekrózis faktor receptor-1 (DR1) adapter fehérje (TRADD) esetében is megfigyeltek.

A DISC összeszerelődéséhez a sejtmagban tartózkodó FADD vagy TRADD molekulákat a citoplazmába kell átirányítani. Arról, hogy ez kapcsolatban van-e a halál receptor ligandum kötésével, s ha igen, milyen mértékben függ magától a receptortól, s hogy a jelátvitelben milyen faktorok vesznek részt, igen keveset tudunk. Ismét utalunk azonban arra, hogy a sejthalál kiváltásához szükséges méretű DISC összeszerelődése egyes adatok szerint az endoszómális membrán mentén (is) történhet, így az adapter fehérjéket is ide kell toborozni.

A poszt-transzlációs módosítások szabályozó szerepe

Az apoptózis indukciójában fehérjék vesznek részt, így várható, hogy számos olyan poszt-transzlációs módosítás (PTM) érheti őket, ami befolyásolja a sejthalál kiváltásában betöltött funkciójukat. A részletek ismertetése nélkül ezek között van foszforiláció, glikoziláció, ubiquitiniláció és palmitoiláció is. Az átalakítások érintik a halál receptorokat, a DISC komponenseket, valamint a későbbiekben tárgyalt apoptózist szabályozó fehérjéket (Bcl2 család, IAP) is. A PTM szerepének tisztázását egyes esetekben nehezíti az, hogy az adott proteinnek nem csak apoptotikus szerepe van, így elképzelhető, hogy a szerkezeti módosítás éppen más irányú funkcióját befolyásolja (l. pl. a FADD foszforilációja nem befolyásolja a DISC-beli működését, de hatással van a sejtciklus szabályozásban betöltött szerepére).

Receptor-függő sejthalál útvonalak

Az apoptotikus útvonal

A halál receptoroktól kiinduló apoptotikus szignalizációs útvonalat, azaz a kaszpázokból álló kaszkád sor aktivációját és szerveződését a Fas DISC–iniciátor prokaszpáz-8 példájával mutatjuk be.

Ahogy erről korábban szó volt, a sejthalált indukáló molekuláris komplexumban az adapter fehérjék több pro-kaszpáz-8 molekulát gyűjtenek és rendeznek maguk mellé, amelyek így megfelelő közelségbe kerülnek egymáshoz ahhoz, hogy egymást aktiválják. Két iniciátor prokaszpáz-8 molekulából egymást követő hasításokkal lesz egy aktív, heterodimer (tetramer) szerkezetű enzim. A DISC-ben megtörténik a két pro-enzim molekula belső, konformációs átrendeződése és autokatalitikus aktiválódása. A DISC-ből kiváló aktív kaszpáz-8 a továbbiakban effektor pro-kaszpáz (pl. pro-kaszpáz-3) proteolitikus aktivációjára képes (16.8. ábra).

A Fas molekulák szürkék, ligandumaik barnák, a Fas-hoz kapcsolódó FADD adapter fehérjék bordók és pirosak, a kaszpázok piros-barna-világoskék (balra lent), szinezetűek.

16.8. ábra A pro-kaszpáz-8/10 Fas DISC általi aktiválása. A trimerizálódott Fas magához gyűjti a FADD adapter fehérjéket, azok pedig a pro-kaszpáz-8 molekulákat. Az így összeállt DISC-ből aktív kaszpáz-8 molekulák szabadulnak fel, amelyek effektor kaszpázt aktiválnak (a DISC szerkezetét itt leegyszerűsítve ábrázoltuk).

A halál receptorok által beindított jelátvitel kétféle utat járhat be. Az úgynevezett I. típusú sejtekben a kaszpáz-8 közvetlenül aktiválja a végrehajtó kaszpázokat. A II. típusú sejtekben nem termelődik elegendő aktív kaszpáz-8 az apoptózis hatékony beindításához. Ennek oka az, hogy az ilyen sejtek citoplazmája nagy mennyiségben tartalmazza a végrehajtó kaszpázokat gátló IAP (inhibitors of apoptotic proteins) fehérjéket, amik hatékonyan blokkolják a kaszpáz-8 által elindított folyamatot. A II. típusú sejtekben ezért a DISC-ben aktiválódó kaszpáz-8 a Bid hasításával a belső sejthalál útvonalat aktiválja (l. 18. fejezet). Mivel a IAP-ok gátló hatása ezen az útvonalon nem érvényesül, a sejthalál folyamata e kerülő út használatával inndítható be.

A külső sejthalál stimulusok által beindított kaszpáz-kaszkád felpörgése, valamint az aktív effektor kaszpázok koncentrációjának ugrásszerű megemelkedése a sejt normális működéséhez nélkülözhetetlen szerkezeti és szabályozó fehérjék (l. 15.9. ábra) tömeges lebontásához vezet (16.9. ábra). Ennek következményeként a citoplazmatikus és a sejtmagi vázrendszer dezorganizálódik, az intracelluláris transzport folyamatok súlyosan károsodnak, alapvető sejtélettani folyamatok leállnak.

Az enzimek egy részének proteolitikus aktiválása mellett, az aktív effektor kaszpázok (pl. a kaszpáz-3) bizonyos enzimek inhibítorainak hasításával enzimeket „szabadítanak fel” a gátlás alól. Ez történik a már említett ICAD esetében, amelyből az inhibítor lehasítása után szabaddá válik az aktív CAD, s a sejtmagba bejutva megkezdi a DNS internukleoszómális feldarabolását (16.9. és 16.10. ábra).

A Fas molekulák szürkék, ligandumaik barnák, a Fas-hoz kapcsolódó FADD adapter fehérjék barnák, a kaszpázok piros-barna-világoskék színezetűek. A sejtváz fehérjék zöldek, a PARP barna, a CAD piros, az inhibítora pedig narancssárga. A kép alján a sejtmagban lévő kettősen csavart vonallal rajzolt DNS molekula sötétkék.

16.9. ábra A kaszpáz-8 által aktivált útvonal hatásai: a DISC-ből felszabaduló iniciátor kaszpáz-8 effektor pro-kaszpáz-3 molekulákat aktivál. Ezek számos olyan fehérje részleges proteolízisét végzik, amelyek funkciójának kiesése a sejtváz és a kromatin állomány feldarabolódásához, széteséséhez vezet. (A DISC szerkezetét leegyszerűsítve ábrázoltuk.)

A CAD a DNS szálból kivágja az internukleoszomális szakaszokat, ami előbb-utóbb a kromatin állomány nukleoszomális méretű feldarabolódásához vezet (16.10. ábra). Az ily módon történő fragmentáció során csak meghatározott méretű (kb. 180 nukleotid és annak többszörösei) DNS darabok keletkeznek, amelyek agaróz gélen diszkrét, elkülönülő csíkokból álló sorozatot, úgynevezett apoptotikus létrát alkotnak (16.11. ábra). A DNS fragmentáció metszeteken az ún. tunel (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) reakcióval mutatható ki (16.12. ábra).

A kaszpáz aktiváció következtében a DNS sérülések helyreállításában (DNS repaire) nélkülözhetetlen folyamatok is károsodnak (l. PARP inaktiválása kaszpáz-3 által, 16.9. ábra), s ez tovább fokozza a CAD DNS károsító hatását. A keletkező kis DNS szakaszok a p53 aktivitásának fokozásához vezetnek (16.10. és 19.22. ábra).

A kép tetején a kaszpáz a szokások színezetű, a CAD piros, ai ICAD narancssárga, a DNS sötétkék, a nukleoszóma hisztonjai világosabb kékek. A kép bal alsó részén található zöld kör a p53 fehérjét jelöli.

16.10. ábra A kaszpáz-3 és a CAD szerepe a DNS fragmentációban. Az ICAD hasításával felszabaduló CAD a magban oligonukleoszómális darabokra szabdalja szét a kromatin állományt, miközben a DNS-szál helyreállítását végző PARP kaszpáz-3 általi inaktivációja miatt nem tudja annak szerkezetét helyreállítani. A DNS fragmentációja – a funkcióvesztés mellett – a p53 fehérje aktvitásának fokozódásához vezet (l. 19.22. ábra).

A fényképen sötét háttér előtt fehér vízszintes csíkok láthatók, utóbbiak a különböző méretű DNS fragmentumok.

16.11. ábra Az apoptotikus létra agaróz gélen. Az 1. minta olyan sejtekből származik, amiket előzőleg apoptózist indukáló szerrel kezeltek, a 3. minta kezeletlen kontroll. A kezelt sejt esetében a DNS állomány diszkrét, jól láthatóan elkülönőlő méretű darabokra esik szét, míg a kezeletlen sejtekben megmarad nagyméretű, a gél tetején látható molekula (etidium-bromid festés).

16.12. ábra Az apoptózis során feldarabolódó DNS kimutatása tunel reakcióval. A pusztuló sejt magja azért azonosítható, mert az eljárás során a fragmentált DNS helyén barna színű (DAB) csapadék képződik.

Szintén apoptózishoz vezető, külső stimulusra aktiválódó jelátviteli folyamat a granzimeB útvonal, amelynek ismertetésére az immunrendszerrel kapcsolatban a 20. fejezetben térünk ki.

Útvonal a nekroptózis felé

Nekrotikus sejthalált kiválthat virális fertőzés (dupla szálú RNS), mitokondrium sérülés (mitokondriális DNS és reaktív oxigén szabadgyökök), DNS károsodás, valamint bakteriális LPS extracelluláris megjelenése és megfelelő receptorhoz (TLR4) kötése. Eleinte a nekrózis minden formáját szabályozatlan sejthalál típusnak tekintették, függetlenül attól, hogy milyen stresszhatás váltja ki. Mintegy két évtizede azonban változni kezdett a kép, mivel ezen sejthalál típus egyre több részfolyamatáról derült ki az, hogy szigorúan szabályozott keretek között zajlik. Arra, hogy a kiindulási pontjai részben ugyanazok a receptorok, amelyek az apoptózis indukciójában is részt vesznek, akkor derült fény, amikor számos sejttípuson kaszpáz gátlás mellett serkentették a halál receptorokat, s ez nekrotikus fenotípust mutató sejthalálhoz vezetett (16.13. ábra).

Nekroptózis kiváltható a TNF-R1 (DR1), a Fas (DR2), és a TRAIL-R1/2 (DR4/5) receptorokon keresztül, s az indukciójában nélkülözhetetlenek a Ser-Thr-kináz aktivitású RIP (receptor interacting protein) enzimek[7]. A receptor-ligandum kötésnek három féle kimenete lehet, amit a TNFα receptor esetén mutatunk be.

1. A receptorok ligandum kötését követően az aktivált receptor az I. komplex komponenseit toborozza össze. A komlex alkotásában olyan adapter fehérjék vesznek részt, mint a TRADD, a TRAF2/5 és RIP1. A TRAF2/5 (TNF receptor associated factor) a TRADD úgynevezett TRAF doménjéhez kötődik. Mivel a TRADD egy RING doménnel is rendelkezik, ennek alapján apoptózist gátló IAP (cIAP) kötésére is képes. Ennek hatására az NF-κB útvonal aktiválódik, ami anti-apoptotikus fehérjék (c-FLIP, cIAP) expresszióját eredményezi (16.13. és 16.14. ábra).

Megjegyezzük, hogy a TNFα receptor esetében feltehetően a sejtfelszíni receptorhoz kapcsolódó DISC (TRADD, TRAF2/5, RIP1) anti-apoptotikus, míg az internalizációval az endoszómális rendszerbe kerülő receptor köré szerveződő DISC pro-apoptotikus (TRADD, FADD, kaszpáz) jelátviteli útvonalat aktivál.

A TNF receptor rózsaszín, a liganduma sötét rózsaszín, a TRADD fehérje kék, A FADD barna (csak jobb oldalon), a TRAF (csak bal oldalon) szürke-fekete, a kaszpázok a szokásos mintázatúak (jobb oldalon), a cIAP sárga. A kis zöld korongok ubiquitin molekulák az ubiquitin láncban (bal oldalon).

16.13. ábra A TNF receptor DISC-je kétféle jelátvitali útvonal kiindulópontja. Az egyik esetben a DISC-be TRADD, TRAF2/5, RIP1 és cIAP fehérjék épülnek be. Ez a komplex az NF-κB indukcióját célzó útvonal aktivációját eredményezi. A másik lehetőség az, hogy a DISC-be a TRADD, FADD és pro-kaszpáz-8 molekulák épülnek be. Ez apoptotikus sejthalált indít be.

2. A receptor internalizációjának hatására a DISC komponensei poszt-transzlációs módosításokat szenvednek. Ennek hatására a RIP1 bekerül a citoplazmába, s ott a II. komplex kialakítását kezdeményezi. Ebben a RIP1 mellett a RIP3 és (esetlegesen) a DISC-ből származó FADD-kaszpáz-8 vesz (vehet) részt. Az apoptotikus jelátviteli útvonallal ellentétben itt a FADD már nem közvetlen adapter, nem kapcsolja össze a TNF receptort és a végrehajtó RIP és kaszpáz8 fehérjéket (16.14. ábra).

3. Az aktív nekro(pto)szóma kialakulásához a RIP1 és a RIP3 foszforilációja szükséges (mindkettő képes autofoszforilációra). Az aktiválódott komplex közvetlenül hozzájárul a reaktív oxigén-gyökök (reactive oxygen species, ROS) szintjének emeléséhez, ezen keresztül membránok (pl. mitokondrium, lizoszóma) sérüléséhez, valamint az ATP-szint gyors lecsökkentéséhez (a sérült mitokondriális membránok miatt leáll az oxidatív foszforiláció, de az apoptózissal ellentétben itt még a nagy „energiafogyasztó” PARP is aktiválódik).

Sejttenyészeteken végzett in vitro kísérletsorozatok eredményei alapján lehet összegezni azt, hogy a II. komplex összetétele hogyan határozza meg a sejthalál típusát, azaz hogy az egyes faktorok hogyan befolyásolják az apoptózis és a nekroptózis közötti választást (16.14. ábra).

Bal oldalon felül: a TRAIL receptor barna, a FADD zöld, a kaszpáz piros. Felül a kép közepén: a TNF receptor lila, a komplexében a TRAF világoszöld, a cIAP sárga, a RIP1lila, a TRADD szürke. A kép közepén látható II. komplexben a zöld FADD, lila RIP1, piros kaszpáz mellett kékeszöld a RIP3.

16.14. ábra In vitro kísérletek eredményeinek összegzése. A nekroptoszóma összetétele dönti el azt, hogy a sejt az apoptózis vagy a nekroptózis útján pusztul-e el. A) A TNF receptor köré szerveződő I. komplex az NF-κB útvonalat aktiválja, ami a sejt túlélését jelenti. B) A RIP1 deubiquitinilálódás után kiválik az I. komplexből és a citoszolban magához toborozza a II. komplex tagjait (RIP3, valamint szintén TNF (TRAIL) receptor köré szerveződő DISC-ből származó FADD-kaszpáz-8). Az aktiválódó nekroptoszóma a komponenseinek arányától függően apoptózist vagy nekroptózist indukál. C) A FADD asszociált kaszpáz-8 elhasítja a RIP fehérjéket és végrehajtó kaszpázok proteolízisével apoptózist indukál. D) Kaszpáz-8 hiányában vagy kaszpáz inhibítor (piros kis háromszög) jelenlétében a FADD-RIP1-RIP3 által formált nekroptoszóma nekroptózist indukál. FADD hiányában a nekroptoszóma vagy nem áll össze, ezzel gátlódik a nekroptózis (E) vagy csökkent kaszpáz-8 aktivitás mérhető, ami kedvez a nekroptózis indukciójának (F). G) Kaszpáz inhibítor (kis piros háromszög) jelenléte és a FADD hiánya eredményezi a leghatékonyabb nekroptoszóma formálódást.

Ellenőrző kérdések

  1. Mik az úgynevezett sejthalál receptorok közös jellemzői? Nevezzen meg ilyen receptorokat!

  2. Mi a DISC, s milyen alapon szerveződik? Mutassa be a Fas és a TNF receptor köré szerveződő DISC komponenseit!

  3. Hogyan szerelődik össze a Fas DISC? Hol történik ez a folyamat? Mi a receptoszóma?

  4. Mik a c-FLIP fehérjék és milyen szerpük van a receptor szignaliozációban?

  5. Mi az I. és a II. komplex, hol találhatók? A FADD lokalizációja hogyan kapcsolódik a funkcióihoz?

  6. Egy folyamatábra segítségével mutassa be a Fas halál receptoron keresztüli jelátvitelt az iniciátor kaszpáz aktiválásáig!

  7. A Fas által közvetített útvonalon melyik effektor kaszpáz aktiválódik? Milyen következményei vannak ennek az aktivációnak a citoplazmában és a sejtmagban?

  8. Minek a hatására kondenzálódik az apoptotikus sejtek kromatin állománya, s mi darabolja fel a DNS szálakat? Milyen méretű fragmentumok keletkeznek, s ez hogyan mutatható ki?

  9. Mik a RIP fehérjék, s melyik halál receptor DISC-jéhet kapcsolódhatnak? Milyen útvonal aktiválásában vesznek részt? Mi a nekroszóma?

Felhasznált és ajánlott irodalom

Foger, N., Bulfone-Paus, S., Chan, A. C., Lee, K. H. (2009) Subcellular compartmentalization of FADD as a new level of regulation in death receptor signaling. FEBS J.276(15), 4256-65. doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.07134.x.

Lavrik, I. N., Krammer, P. H. (2012) Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death Differ.19(1), 36-41. doi: 10.1038/cdd.2011.155.

Lee, E. W., Seo, J., Jeong, M., Lee, S., Song, J. (2012) The roles of FADD in extrinsic apoptosis and necroptosis. BMB Rep.45(9), 496-508. http://dx.doi.org/10.5483/BMBRep.2012.45.9.186

Park, H. H. (2012) Structural Features of Caspase-Activating Complexes. Int. J. Mol. Sci. 13, 4807-4818; doi:10.3390/ijms13044807

Peter, M. E., Krammer, P. H. (2003) The CD95(APO-1/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ.10(1), 26-35.

Pobezinskaya, Y. L., Liu, Z. (2012) The role of TRADD in death receptor signaling. Cell Cycle. 11(5):871-6. doi: 10.4161/cc.11.5.19300.

Salvesen, G. S., Riedl, S. J. (2009) Structure of the Fas/FADD complex: a conditional death domain complex mediating signaling by receptor clustering. Cell Cycle. 8(17), 2723-7.

Schleich, K., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. (2013) The chains of death: a new view on caspase-8 activation at the DISC. Cell Cycle.12(2), 193-4. doi: 10.4161/cc.23464.

Scott, F. L., Stec, B., Pop, C., Dobaczewska, M. K., Lee, J. J., Monosov, E., Robinson, H., Salvesen, G. S., Schwarzenbacher, R., Riedl, S. J. (2009) The Fas-FADD death domain complex structure unravels signalling by receptor clustering. Nature457(7232),1019-22. doi: 10.1038/nature07606.

Tchikov, V., Bertsch, U., Fritsch, J., Edelmann, B., Schütze, S. (2011) Subcellular compartmentalization of TNF receptor-1 and CD95 signaling pathways. European Journal of Cell Biology90 (6-7), 467-475, http://dx.doi.org/10.1016/j.ejcb.2010.11.002

Vanlangenakker, N., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. (2012) Many stimuli pull the necrotic trigger, an overview. Cell Death Differ. 19(1), 75-86. doi: 10.1038/cdd.2011.164.

Wang, L., Yang, J. K., Kabaleeswaran, V., Rice, A. J., Cruz, A. C., Park, A. Y., Yin, Q., Damko, E., Jang, S. B., Raunser, S., Robinson, C. V., Siegel, R. M., Walz, T., Wu, H. (2010) The Fas-FADD death domain complex structure reveals the basis of DISC assembly and disease mutations. Nat Struct Mol Biol.17(11), 1324-9. doi: 10.1038/nsmb.1920.

Werner, M. H., Wu, C., Walsh, C. M. (2006) Emerging roles for the death adaptor FADD in death receptor avidity and cell cycle regulation. Cell Cycle. 5(20), 2332-8.



[7] RIP fehérjék az ún. ripoptoszóma alkotásában is részt vesznek, ami a DNS károsodások hatására a halál receptorok működésétől függetlenül összeálló citoszolikus komplex. Komponensei a RIP1, RIP3, FADD, kaszpáz-8, FLIP és IAP-ok.