18. A mitokondriumok, apoptózis belső stimulusra (II. típus)

A mitokondriumok morfológiája és hálózata

A mitokondriumok alakjáról és szerkezetéről korábban – elsősorban fixált szöveti- és sejtmintákon végzett morfológiai megfigyelések alapján – alkotott képünket jelentősen módosították az elmúlt évek korszerű elektronmikroszkópos, immuncitokémiai, membrán fiziológiai és biokémiai vizsgálatai, valamint az in vivo megfigyelések céljára kifejlesztett mitokondriális marker, vitális fluoreszcens festékek (mitotracker) és a fluoreszcens fúziós fehérje konstrukciók alkalmazása.

Már évekkel ezelőtt is használtuk a sejt „mitokondrium rendszere” (mitochondrial system) szókapcsolatot, de az új ismeretek birtokában egyre gyakrabban találkozunk a szakirodalomban a mitokondriális hálózat (mitochondrial network) kifejezéssel. Való igaz – különösen a nagy metabolikus aktivitású, vagy erősen differenciált és polarizált sejtekre, mint például az izom- és idegsejtek –, hogy aktív működésük során a mitokondriumaik egy kiterjedt, elektromos és energetikai „kábelrendszerből” álló hálózatot alkotnak, amely nagyon szépen kirajzolódik a sejtekben a vitális mitotracker festés után (18.1.–18.3. ábra).

A fotón fekete háttér előtt zöld vonalrendszer látszik: ez a mitokondriákis hálózat.

18.1. ábra Mitokondrium hálózat endotélium sejtekben mitotracker festéssel. A sejtmagok fekete foltok, amiket a mitokondrium hálózat „körülfon”.

A fotón fekete háttér előtt zöld vonalrendszer látszik: ez a mitokondriákis hálózat. A sejtmag a kép közepén található, fehér csillag jelzi.

18.2. ábra Kiterjedt mitokondrium hálózat. A mitokondriumokat mitotrackerrel jelöltük, ami egy vitális, mitokondrium-specifikus fluoreszcens festék. A csillag a sejtmagot jelzi.

A fotón fehér háttér előtt fekete vonalrendszer látszik: ez a mitokondriákis hálózat. A sejtmag a kép közepén található, fekete csillag jelzi.

18.3. ábra Az előző felvétel fekete-fehér változata. Itt élesebben körülrajzolódik a kiterjedtebb mitokondrium hálózat. A mitokondriumokat mitotrackerrel jelöltük, ami egy vitális, mitokondrium-specifikus fluoreszcens festék. A csillag a sejtmagot jelzi.

Bizonyos körülmények között a hálózat fragmentálódik, s a tankönyvekből jól ismert bab alakú szemcsékre esik szét (18.4. és 18.5. ábra). A mitokondriumok görög eredetű tudományos neve arra utal, hogy erre a morfológiai lehetőségre már a sejtszervecske leírói is felfigyeltek, hiszen a név a mitosz=fonál és a kondrosz=szemcse szavak összevonásából ered.

A fotón fekete háttér előtt zöld vonalrendszer látszik: ez a mitokondriákis hálózat. A sejtmagot fehér csillag jelzi.

18.4. ábra Szétesett hálózat egyedi mitokondriumokkal apoptotikus sejtben. A mitokondriumokat mitotrackerrel jelöltük, a csillag a zsugorodott sejtmagot jelzi, a nyíl egy rendkívül zsugorodott sejtre, vagy apoptotikus testre mutat.

A fotón fehér háttér előtt fekete vonalrendszer látszik: ez a mitokondriákis hálózat. A sejtmag a kép közepén található, fekete csillag jelzi.

18.5. ábra Az előző felvétel fekete-fehér változata. Szétesett hálózat egyedi mitokondriumokkal apoptotikus sejtben. A mitokondriumokat mitotrackerrel jelöltük, a csillag a zsugorodott sejtmagot jelzi, a nyíl egy rendkívül zsugorodott sejtre, vagy apoptotikus testre mutat.

A mitokondriumok fúziója

A hálózatos és a „szemcsés” formák fiziológiás körülmények között dinamikus egyensúlyban vannak egymással. A molekuláris sejtbiológiai kutatási módszerek fejlődésével fény derült a mitokondriumok fúziójáért és a fonalak fragmentálódásáért (lefűződéses szétválás, „osztódás”) felelős molekuláris szereplőkre is.

A fúzióban kulcsszerepet játszó fehérjék a mitofuzinok (mitofusin, Mfn1/2, 18.6. ábra). Transzmembrán (TM) régióik segítségével a mitokondrium külső membránjában rögzülnek, s alkothatnak homo- és heterodimereket egyaránt. A fúzió alkalmával a két egymáshoz megfelelő közelségbe került mitokondrium felszínén „egymással szemben állva” úgynevezett HR (heptad repeat) régióik révén kapcsolódnak össze (18.6 és 18.7. ábra). A HR domének helikális szerkezetűek, s egymás mellé rendeződve képesek arra, hogy a mitofuzin GTP-áz doménjének közreműködésével (GTP hidrolízis) felszabaduló energiát a membránok közelítésére fordítsák.

Bizonyosnak látszik, hogy léteznek olyan fehérjék, amelyek a két membrán közötti kapcsolat kialakításában vesznek részt. Ilyen a dynamin homológ Opa (optic atrophy), amelynek proteolítikus hasításával egy hosszabb, a belső membránhoz kötött, és egy rövidebb, az intermembrán térben mozgó, de membrán felszínnel kölcsönhatásba lépni képes formáját azonosították (18.6. ábra).

A GTP-áz domének pirosak, a HR régiók lilák, a TM régiók zöldek, a Hrk domének kékek.

18.6. ábra Mitokondrium fúzió folyamatában résztvevő molekulák szerkezete. Mindegyik fehérje rendelkezik zöld színnel jelzett transz-membrán (TM), lilával jelölt HR, valamint piros színnel kiemelt GTP-áz aktivitású doménnel. Az Opa1 hasításával két rövidebb fehérje keletkezik, ezek egyike membránhoz kötött (L-Opa1), a másik szolubilis (S-Opa1). (Pro: prolin gazdag domén, MTS: mitokondriális transzport szekvencia, Spl: alternatív mRNS-illesztésű domén, GED: GTP-áz effektor domén)

Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a kettős membránnal határolt mitokondriumok fúziója szükségképpen kétlépéses folyamat, hiszen a külső membránok után a belsőknek is egyesülniük kell. Nullmutáns embrionális fibroblasztokon végzett kísérletek szerint a külső membránok fúziójához a mitofuzinok, a belsőéhez pedig az Opa1 fehérje elengedhetetlenül szükséges (18.7. ábra).

A rajzon bal oldalon és középen kis kék mitokondrium-párok, jobb oldalon egy nagyobb mitokondrium látható.

18.7. ábra A mitokondrium fúzió szakaszai. Az első lépésben a külső membránok egyesülnek: ehhez nélkülözhetetlenek a mitofuzin (Mfn1/2) fehérjék. A második szakaszban a belső membránok fúzionálnak, amihez az Opa1 fehérje szükséges.

A mitokondrium fúzió bonyolult folyamatának ma még csak egyes mozzanatait ismerjük. A fúzióhoz szükséges lépések megindítására a mitofuzinok homo- és heterodimerjei (Mfn1-Mfn1, Mfn2-Mfn2, Mfn1-Mfn2) egyaránt alkalmasak. Az egymás mellé rendeződő, antiparalell helyzetű C-terminálisok HR régiói játszanak szerepet abban, hogy a mitofuzin molekulák oligomerizálódnak, s megfelelő közelségbe hozzák, illetve tartják a két szomszédos külső membránt. Az oligomerizációt követően még egy konformációváltozás is szükséges, amit valószínűleg GTP hasításból származó energia fedez (18.8. ábra).

Stresszmentes körülmények között a belső membránok egyesülésében az Opa1 fehérjének mind a hosszú, mind pedig a rövid formája részt vesz.

Az bizonyosnak tűnik, hogy a két membrán egyesülését biztosító lépések mechanikai összekapcsolását a mitofuzinok és az Opa fehérjék közötti fizikai kapcsolat létrejötte biztosítja. Hogy ez mikor és milyen módon történik, az ma még nem kellőképpen tisztázott.

A mitokondriumok szerkezetének és működésének minél alaposabb felderítését célzó finom ultrastrukturális és membránpotenciál vizsgálatok egy másik érdekes (mint kiderült, funkcionálisan is fontos) morfológiai tényre hívták fel a figyelmet.

A mitokondrium külső membránja és a belső membrán közötti intermembrán tér, valamint a belső membrán által határolt mátrix téren kívül, a krisztáknak az intermembrán tértől való reverzibilis lehatárolódásával kialakulhat egy harmadik, úgynevezett interkrisztális tér is. A kriszták lemezeinek a külső membrán felöli szélét kriszta-kapcsoló struktúrák (crista junction) kötik össze egymással, amelyeknek a pontos szerkezete még nem ismert. Az egyik molekuláris komponensét azonban egyértelműen azonosították, s ez érdekes módon a mitokondrium hálózat dinamikus átrendeződésének egyik ismert szereplője, az Opa1 (18.8. ábra).

Számos olyan fehérjét azonosítottak, amelyik képes kötődni a mitofuzinokhoz. Ilyen a mitofuzin kötő fehérje (mitofusin-binding protein, MIB), valamint a pro-apoptotikus Bcl-2 családtag Bak és Bax (l. 18.8. ábra). Az utóbbiak szerepéről a későbbiekben lesz szó.

A két egymáshoz közeli mitokondrium külső membránja sötétkék, a belső membrán világoskék. A külső membránban elhelyezkedő mitofuzinok GTP-áz doménje piros, a Hrk régió kék, a Bax fehérje barna. A belső membránban található Opa sötét és világosbarna.

18.8. ábra A mitokondriális külső membránok fúziójának kezdeti lépése. Az ábrán jeleztük, hogy a belső membrán krisztáinak terét kriszta-kapcsoló struktúrák zárják le, amelyeknek egyik tagja az Opa1 fehérje hosszú és rövid formája által alkotott komplex (Mfn, OPA, HR, TM jelentését l. a szövegben, Pro: prolin gazdag domén, MTS: mitokondriális transzport szekvencia, Spl: alternatív mRNS-illesztésű domén, GED: GTP-áz effektor domén).

A mitokondriumok „osztódása”

Az egyedi mitokondriumok olyan fonalas hálózatot hoznak létre, amelyben „individualitásuk” megszűnik. A hálózathoz folyamatosan csatlakoznak új tagok, s arról szintén folyamatosan le is válnak ismét egyedivé váló mitokondriumok. A fúzió mellett a dinamikus átépülést a rendszer fragmentálódása, régebbi felfogásban a mitokondriumok osztódása biztosítja, amely lényegében lefűződés, feldarabolódás (18.9. ábra).

Az elektronmikroszkópos felvétel fekete-fehér, a mitokondrium hálózat a fotó bal felső sarkától a jobb alsó sarok felé átlósan húzódik.

18.9. ábra Fragmentálódó mitokondriális hálózat neuron axonjában, transzmissziós elektronmikroszkópos felvételen. (A nyilak szinapszisokra, a nyílhegyek a neurit membránjára mutatnak.)

Mitokondriumok hálózatról való lefűződése megfigyelhető sejtosztódáskor, amikor az ATP-forrást az energiafelhasználás helyére kell irányítani és koncentrálni (a lefűződött mitokondrium szállítható). Tény azonban, hogy egy egyedi mitokondrium sebezhetőbb, mint a hálózat, s az önálló sejtszervecske autofágia áldozatává is válhat. A hálózat fragmentálódása az apoptotikus sejthalál egyik bevezető jelensége.

A lefűződésben központi szerepet játszó molekula a Drp1 (dynamin related protein 1) fehérje. A Drp olyan citoszolikus, TM régióval nem rendelkező, nagyméretű GTP-áz, amely a dynaminhoz hasonló szerkezettel és funkcióval rendelkezik (18.10. ábra). (A dynamin endoszómális vezikulák sejtmembránról történő lefűzésében játszik szerepet.)

Az „osztódás” bevezető lépéseként a citoszolikus Drp1 a mitokondriális membránhoz kötődik. A membrán-asszociált Drp1 frakció arányát egyes poszt-transzlációs módosítások (PTM) növelik, míg mások csökkentik. Az első esetben az „osztódás” intenzitása nő, a második esetben az gátlódik. A PTM típusa lehet foszforiláció, sumoiláció, ubiquitiniláció, nitroziláció: a többségük az „osztódást” serkenti. A PTM-eken keresztül a Drp1 aktivitása kapcsolatban van a sejtosztódási ciklussal és a tápanyag ellátottsággal is.

A mitokondrium felszínén több olyan molekulát is azonosítottak, ami biztosíthatja a Drp1 membránhoz kötését. A Fis1 (fission 1) transzmembrán (TM) doménje révén a mitokondrium felszínén rögzül. N-terminálisán két TPR (tetratricopeptide repeate) régiót hordoz (18.10. ábra), ezzel köti magához a Drp1-t. A Drp mitokondriumhoz szállításában a sejtváz játszik szerepet (18.11. ábra). A Fish1-hez hasonló fukciójú adapter fehérjék az Mff (mitochondrial fission factor) és a MiD49/51 (mitochondrial dynamics proteins 49 and 51).

A Drp1 GTP-áz doménje piros, a központi régiója szürke, a GED doménje zöld. Az alatta látható Fis1 bal oldala narancssárga és függőlegesen csíkozott: ez a TPR ismétlődés, jobb vége zöld: ez a transzmembrán régió.

18.10. ábra A mitokondriumok hálózatról való lefűződésében („osztódásában”) főszerepet játszó fehérjék. A Drp1 N-terminálisán egy GTP-áz domén van, ezt egy centrális (C), egy variábilis (V) és egy GTP-áz effektor (GED) domén követi. A mitokondrium külső membránjában található Fis1 N-terminálisa TPR ismétlődéseket tartalmaz: ez teszi lehetővé a Drp1 megkötését. A membránlokalizációt transz-membrán régió biztosítja.

A mitokondriumok kékek, a Drp1 molekulák piros oválisok, a mitokondrium külső felszínéhez kötött Fis1 fehérjék narancssárga hasábok. sejtváz zöld vonalakkal jelzett.

18.11. ábra Mitokondrium lefűződésének (osztódásának) kezdeti lépései. A Drp1 a sejtváz közvetítésével a mitokondrium felszínéhez jut (A), majd megjelenik a kezdeti befűződés és a Drp1 molekulák hozzákötődnek a Fis1-hez (B). (A rajzon az egyszerűség kedvéért a folyamatot egy mitokondrium kettéosztódásaként ábrázoltuk.)

A Fis1-Drp1 komplexek a mitokondriumon megjelenő kezdeti befűződés mentén sorakoznak fel úgy, hogy egy, a mitokondriumot átölelő gyűrűt képeznek, amely egyre szorosabbra húzódik, míg végül lefűz egy mitokondriumot a hálózatról (18.12. ábra). Ebben a dynamin homológ Drp1 szerepét hasonlónak képzelhetjük, mint amilyet a dynamin az endoszómális vezikulák plazmamembránról való leválasztásában betölt (a dynamin a formálódó vezikula „nyaka” körül képez gyűrűt, s azt egyre szorosabbra vonva választja azt le a sejtmembránról). Annak mechanizmusa, hogy a belső membrán hogyan követi a külső membránban zajló eseményeket, s hogy az emlős sejtekben mi biztosítja a lefűződését, kevés ismeretünk van. A folyamat egyik lehetséges résztvevője a fent említett Opa1, amely mint írtuk, szintén dynamin homológ.

A mitokondriumok kékek, a Drp1 molekulák piros oválisok, a Fis1 fehréjék narancssárga rudak.

18.12. ábra A mitokondrium „osztódásának” befejező lépései. A Fis1 segítségével a membránhoz kötött Drp1molekulákból szerveződő lánc kettéfűzi a mitokondriumot. Végezetül a Drp1–Fis1 komplexek szétesnek, a Drp1 visszakerül a citoszolba. (A rajzon azt nem jeleztük, hogy itt nem egy mitokondrium kettéfűződéséről, hanem egy mitokondrium hálózatról történő lefűződéséről van szó.)

A mitokondriális hálózat átszervezésének jelentősége

A mitokondriális hálózat átszerveződésének a sejtre jellemző morfológia fenntartásán kívül fiziológiai jelentősége is van. Lehetőséget ad arra, hogy a mitokondriumok membránjainak és tereinek tartalma keveredjen, ezzel fenntartja azok genetikai és biokémiai egyformaságát. Segít megőrizni a mitokondriális DNS stabilitást és számos recesszív mutáció fenotípusos megjelenését kiküszöböli. Számos kísérleti eredmény utal arra, hogy a hálózatról való lefűződésben központi szerepet játszó Drp1 szerepet játszik az apoptózisban, mivel serkentheti a Bax oligomerizációját, ezzel elősegítve azon transzmembrán pórusok (MAC) képződését, amelyeken keresztül apoptogén faktorok jutnak ki a mitokondriumból a citoszolba.

A mitokondrium és az apoptotikus szignálok

Az apoptózis morfológiájával alaposabban foglalkozó kutatók érdekes megfigyelése volt az, hogy azokban a sejtekben, amelyekről kiderült, hogy később apoptózissal pusztulnak el, a tipikus apoptotikus morfológiai bélyegek megjelenése előtt jelentősen megnő a mitokondriumok száma. Ezt a jelenséget azzal próbálták magyarázni, hogy a sejt a fokozódó stresszre erőteljes és valódi mitokondrium osztódással reagál, megnövelve ezzel a védekezéshez szükséges energiatermelő kapacitását. Ma már tudjuk, hogy a számbeli növekedés valójában inkább a mitokondriális hálózatot alkotó fonalas mitokondriumok kicsi „szemcsékké” történő fragmentálódásának a következménye.

Az apoptotikus pusztulás sorsára jutott sejt mitokondriális állományának relatív citoplazmatikus térfogataránya azonban nem növekszik; sőt, a folyamat előre haladtával – a mitokondriumok zsugorodása és a sérült, „védtelen”, kisméretű mitokondriumok szelektív autofágiája (mitofágia) miatt – jelentősen csökken. (Többek között ez a magyarázata az apoptózis során fellépő és növekvő energiahiánynak.)

Ma már azt is tudjuk, hogy egy kedvező fiziológiás körülmények között működő sejt esetében az ép mitokondriumokban a kriszta-kapcsoló struktúrák zártak és a belső membrán külső felszínéhez kötődő citokróm-c molekulák nagy része az interkrisztális térben található. A kriszta-kapcsoló struktúrák zárt és nyitott állapota is dinamikusan változhat, és ez szoros összefüggésben áll a mitokondriális hálózat fragmentációjával.

Már a fenti, elsősorban morfológiai vizsgálatokból származó megfigyelések alapján egyre izgalmasabbá vált az a tudományos felvetés, hogy a mitokondriumok nem csak a földi élet oxidatív környezetéhez alkalmazkodott eukarióta sejtek életjelenségeihez szükséges energia előállításáért felelősek, hanem kulcsszerepet játszanak „befogadó gazdájuk” kivégzésében is.

A legújabb kísérletes kutatások egyre meggyőzőbb molekuláris sejtbiológiai bizonyítékokat szolgáltatnak arra, hogy az aktív sejthalál apoptotikus típusában, annak kaszpáz-függő és kaszpáz-független útvonalaiban egyaránt, a mitokondriumok szerepe szó szerint (sejt)sorsdöntő!

Az intracelluláris (intrinsic) sejthalál stimulusok nagy része a kiterjedt mitokondriális hálózat membránján gyűlik össze. A hosszú, fonalas és a kicsi, lefűződött mitokondriumok dinamikus egyensúlya megbomlik és eltolódik a fragmentáció irányába (18.4. ábra). Ezzel egyrészt megnő a károsító hatásnak kitett membrán felület, másrészt a kicsi, egyedi mitokondriumok sokkal kiszolgáltatottabbak és védtelenebbek a károsító stimulusokkal szemben, mint maga a hálózat (l. előző fejezet).

Ahogy azt korábban írtuk, a mitokondriális külső membrán mindenkori állapotáért, intaktságáért, áteresztőképességének változásáért a már korábban megismert Bcl-2 molekula család transzmembrán régióval is rendelkező anti- és pro-apoptotikus tagjai a felelősek (6. fejezet). Nem lehet véletlen tehát az, hogy a mitokondrium fúzióban és lefűződéses szétválásban kulcsszerepet játszó molekulákon (Mfn1/2, Opa1, Fis1, Drp1) kívül a hálózat stabilitásában, illetve annak felbomlásában e fehérjecsalád tagjait is megtaláljuk.

A „BH-3 only” fehérjék aktiváló szerepe

A mitokondriális hálózat viszonylag gyors és irreverzibilis szétesése azonban „csak” szükséges, de nem elégséges feltétele a mitokondriális sejthalál útvonalak felpörgésének. Apoptotikus szignálok hatására a Bcl-2 fehérjecsalád „BH3-only” tagjai (17.1. ábra) aktiválódnak, s a mitokondrium felszínére kerülve (18.13. ábra) hozzákötődnek az ott lévő anti- és pro-apoptotikus családtagokhoz.

A kép közepén lávő mitokondrium zöld. Tőle balra a Bad fehérje piros, a fölötte lévő Bim narancssárga kör, ettől jobbra a Bid szintén narancssárga, de ovális. A jobb felső sarokban a Noxa és a Puma barna négyzettel keretezettek, a jobb alsó sarokban a Hrk kék.

18.13. ábra Az apoptózis mitokondriális útvonalát beindító „csak BH3” fehérjék aktiválásának módjai a transzlokáció, a foszforiláció, a limitált proteolízis és az expresszió fokozása

A Bid egy olyan „csak BH3” doménnel rendelkező Bcl családtag, aminek csonkolt formája (tBid) egyrészt képes a Bcl-2 megkötésére (ezzel elvonja azt a Bcl-2–Bak heterodimerből, l. 17.8. ábra), másrészt pedig a Bax konformációjának oly módon történő átrendezésére, hogy az képes legyen a mitokondrium membránba inzertálódni (17.6. ábra). Hasonlóan kettős hatású a Bim és a Puma. A Bid hasítására a halál receptorok DISC-jében létrejövő kaszpáz-8 (l. I. típusú sejt) és a későbbiekben bemutatott granzim-B útvonalban központi szerepet játszó enzim, a granzim-B is képes.

A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció pro-apoptotikus szintre emelkedése olyan Ca2+-függő molekulákat aktiválhat, amelyeknek fontos szerepe lehet az apoptózisban. Az intracelluláris Ca2+-szint emelkedés elsősorban az endoplazmatikus retikulumot (ER) ért stressz következménye. Ezek a folyamatok ugyan az apoptotikus sejthalál II. típusának (úgynevezett belső útvonal) indukciójában szerepelnek, nem tekinthetők azonban egyértelműen kaszpáz függetlennek. A szerin proteáz Ca2+-függő kalpainok ugyanis közvetlenül aktiválhatnak effektor kaszpázokat, míg a kalcineurin foszfatázként a pro-apoptotikus Bad fehérjét (Bcl család, „csak BH3) defoszforilálja és aktiválja. Ez utóbbi viszont mitokondriális közvetítéssel zajló kaszpáz aktivációhoz vezet (18.14. ábra).

A kép bal oldalán a mitokondrium kék, a citokróm c piros, a mátrix pro-apoptotikus fehérjéi sárgák, kékek és zöldek.

18.14. ábra A Bid és a Bad „BH3-only” fehérjéket aktiváló tényezők. A Bid csonkolását, ezzel aktiválását a halál receptorok DISC-jéből származó kaszpáz-8 végzi, a Bad fehérje foszforilációját pedig az endoplazmatikus retikulumból (ER) stressz hatására felszabaduló Ca2+ közvetítéssel aktiválódó kalretikulin. A mitokondrium sérülése következtében felszabaduló reaktív oxidatív gyökök (ROS) a mitokondriális membrán további károsodáshoz vezetnek. A membránkárosodás következtében a citoszolba pro-apototikus faktorok, többek között citokróm-c (cit-c) áramlik ki, utóbbi közvetett módon (két nyíl) hozzájárul további pro-kaszpázok aktiválásához.

Az aktivált „BH3-only” fehérjék a membránban homo- és heterodimereket alkotó anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék működését gátolják, miközben a pro-apoptotikus dimer-alkotókat aktiválják (17.6. és 17.8. ábra), s ezzel utat nyitnak a pro-apoptotikus folyamatoknak, azaz az effektor multidomén szerkezetű Bcl-2Bak és Bax fehérjék homodimer, majd oligomer képződésének. A proapototikus homodimerek nagyszámú megjelenése a mitokondrium membránjának permeabilitását drasztikusan megváltoztatja: a membránon apoptózis indukált csatornák (MAC) nyílnak, amelyeken keresztül mitokondriális eredetű, sejthalál szignált közvetítő faktorok jutnak ki a citoplazmába (17.8. és 18.15. ábra).

A mitokondrium külső membránja kék felszín, amelyre rálátunk, az alatta lévő belső membrán szürke. Az anti-apoptotikus fehérjék zöld, a „csak BH3” fehérjék sötétbarna, a Bak és Bax fehérjék pedig narancsszínűek. A nyitott MAC jobb oldalon található, rajta keresztül vastag piros nyíl mutat felfelé. Az ábra alján látható balról jobbra mutató, egyre pirosabbá váló nyíl az egyre nagyobb mennyiségben kiáramló apoptogén faktorokra utal.

18.15. ábra Az anti- és a pro-apoptotikus Bcl-2 fehérjék egyensúlyának felborulása apoptózis indukált csatornák (MAC) nyílását eredményezi. Az aktiválódó Bak és Bax hatására az anti- és pro-apototkius multidoménű fehérjék közötti egyensúly eltolódik a heterodimerek, illetve a pro-apoptotikus homodimerek irányába. Ez az utóbbiak oligomerizációjához, végső soron pórusok (MAC) nyílásához vezet. Az oligomerizációval párhuzamosan egyre több mitokondriális eredetű sejthalál szignál (citokróm-c) jut ki a citoplazmába.

A mitokondriális eredetű apoptogén faktorok hatása

Ahogy említettük, a mitokondriumok számos olyan fehérjét „őriznek” intramembrán terükben, amelyek az egészséges sejtben hasznos funkciót töltenek be, a citoplazmába kijutva azonban apoptogén (apoptózist indukáló) hatásúak. Ilyen az intermembrán térben felhalmozódó citokróm-c, valamint a mátrixban található AIF(apoptotosis inducing factor), endonukleáz G, Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) és Omi/HtrA2 (high temperature-requirement protein A2), amelyek – a fiziológiás rendeltetési helyükként szolgáló mitokondrium „fogságából” kijutva – képesek az apoptotikus sejthalál kaszpáz-függő vagy kaszpáz-független belső útvonalának beindítására. A mátrix eredetű faktorok citoszolba jutásához a belső membránban helyet foglaló permeabilitási tranzíciós pórusok (permeability transition pore, PTP) nyílására van szükség. A citokróm-c kiáramlásához elegendő a MAC kialakulása (17.3. ábra).

A mitokondriális fragmentáció és a külső membránban zajló események hatással vannak a belső membrán stabilitására is. A kriszta-kapcsoló struktúrák felbomlanak, ezért az interkrisztális térből nagy mennyiségű citokróm-c áramlik az intermembrán térbe, ami onnan a megnyílt pórusokon keresztül kijut a citoplazmába (18.16. ábra). A megnyíló PTP-ken keresztül történhet az AIF, az endonukleáz G, a IAP-gátló Smac (l. „A IAP fehérjecsalád” c. fejezet) és HtrA2 kijutása is.

Apoptotikus szignál hatására a Drp1 a mitokondrium felszínére toborzódik, ahol az aktivált Bax kölcsönhatásba lép vele. A Drp1 kimutatható hatással van a mitokondriumokból felszabaduló citokróm-c mennyiségére, valószínűleg növeli a Bax proteinnek a membránhoz való affinitását, így segítheti annak pórusképzését. (Megjegyezzük, hogy a citokróm-c kijutásában játszott szerepe nem feltétlen érinti más apoptotikus faktorok kiáramlását.) A Bax és a Bak a mitofuzinokkal (Mfn) egészséges sejtben is kapcsolatba lép, apoptotikus sejtben pedig úgy tűnik, hogy gátolja a fúziót, segíti az „osztódást” (18.16. ábra). Hogy a Bcl-2 család e tagjai milyen szerepet töltenek be az egészséges sejt mitokondrium hálózatának dinamikájában, s hogy a sejtpusztulás alatt milyen mechanizmuson keresztül fejtik ki a hálózat feldarabolódását eredményező hatásukat, az ma még nem ismert.

Az ábra bal oldalán és jobb alsó részén azonos jellegű rajzok láthatók. Ezeken a mitokondrium külső membránja sötétkék, a belső világoskék. A mitofuzinok piros és kék doménekkel rendelkeznek, az anti-apoptotikus Bcl-2 fehérje zöld, a Bax barna, a Fis narancssárga, a Drp1 piros. A MAC ismeretlen komponense lila, az Opa sötét és világosbarna színű. A citokróm molekulák piros kis korongok. A jobb felső sarokban rózsaszín háttér előtt kék mitokondriumok; az alsót piros Drp1 fehérjékből álló gyűrű fűzi ketté.

18.16. ábra A Bax mitokondriális hálózat dinamikát befolyásoló hatásai. Nyugalmi állapotban a Bax anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjékkel (pl. Bcl-XL) heterodimereket képez. (A). Apoptotikus szignálok hatására a Drp1 a külső membránhoz toborzódik, s kölcsönhatásba lép a heterodimerből kilépő Bax fehérjével (B). A Bax közreműködésével kialakuló mitokondriális apoptózis indukált csatornák (MAC) nyílásával párhuzamosan a kriszta-kapcsoló struktúrák felbomlanak és a citokróm-c (cit-c) kiáramlik a citoszolba. (A rövidítéseket l. korábbi fejezetekben.)

Az apoptoszóma

Az apoptotikus kaszpáz-kaszkád belső útvonalán a legfontosabb iniciátor kaszpáz a kaszpáz-9. Ennek aktiválása egy nagy, több komponensű molekuláris komplexum, az úgynevezett apoptoszóma révén zajlik. Ez a komplexum a citoplazmában szerelődik össze, mégpedig egyrészt az apoptotikus stimulusok (oxidatív stressz, megnövekedett szubnekrotikus Ca2+ szint) hatására a mitokondriumokból felszabaduló citokróm-c, és a citoplazmában prekurzor formában jelenlévő Apaf-1 (apoptotic-enzyme activating factor), valamint pro-kaszpáz-9 molekulákból. A komplexum kialakulásához ATP hidrolízisre és nukleotid cserére (ADP/ATP) is szükség van.

Az Apaf-1 molekula több fontos funkcionális régióval is rendelkezik. Az N-terminálisán található egy CARD interakciós domén, ahová (megfelelő körülmények között) a hasonló régióval rendelkező iniciátor pro-kaszpáz (pro-kaszpáz-9) tud kötődni. A középső régióban egy oligomerizációt is lehetővé tevő nukleotid-kötő domén (NBD: nucleotide binding domain) helyezkedik el, ami ADP/ATP kötésre alkalmas, míg a C-terminális régiót egy hosszú, WD-40 repetitív szekvencia (WDR) alkotja (18.17. ábra)

A CARD régió lila, az NBD zöld, a WD ismétlődések egymást követő narancssárga négyzetek a molekula jobb felében.

18.17. ábra Az Apaf-1 doménjei. A molekula N terminálisán egy kaszpáz toborzó CARD domén található, amit egy nukleotid-, majd egy citokróm-c kötő régió követ.

Az inaktív Apaf-1 igen zárt térszerkezete legjobban egy saját farkába harapó kígyóhoz hasonlít, amiben a C-terminális WD-40 repetitív régió által alkotott „állkapocs” fogva tartja az N-terminális CARD régióját, lehetetlenné téve ezzel a pro-kaszpáz-9 bekötését (autoinhibíció, 18.18. ábra).

Ebből az inaktív állapotból csak apoptotikus stimulus hatására léphet ki az Apaf-1, mégpedig akkor, amikor az NBD régióhoz kötődő ATP-t elhidrolizálja. Ennek hatására az „állkapocs” szorítása lazul, s a mitokondriumokból kiszabaduló citokróm-c (ez egyben az apoptotikus jel) „felpeckeli” az „állkapcsot”. A folyamat során az Apaf-1 zárt konformációja teljesen átalakul, és egy ADP/ATP nukleotid-cserét követően 7 darab Apaf-1–citokróm-c–ATP egységből álló, sugaras szimmetriájú komplex alakul ki. Amennyiben nukleotid csere nem történik, a sugaras szimmetria nem alakul ki – ez esetben pro-kaszpáz molekulák bekötődésére sincsen lehetőség (18.18. ábra).

Az Apaf-1 fehérje lila, az ATP zöld, az ADP kék, a citokróm-c piros.

18.18. ábra Az Apaf-1 aktiválódása és apoptoszómává szerveződése. Nyugalmi állapotban az Apaf-1 egy saját farkába harapó kígyóra emlékeztet: a kaszpáz toborzó CARD régióját a WDR ismétléseket hordozó C terminális inaktiválja (zárt forma). A konformáció megváltozásához ATP hidrolízis és citokróm-c kötésre van szükség. Az így „kiegyenesedő” molekula egy nukleotid csere után már képes pro-kaszpázokat toborozni. A sárgával keretezett részen látható molekulamodellek a 7.13. ábrának megfelelően mutatják a tőlük balra látható konformációt.

Az aktív apoptoszómában a kaszpáz-toborzó CARD régió hozzáférhető, így lehetőség van a prokaszpáz-9 molekulák bekötésére és aktiválódására. Ezzel kialakul a proteolitikusan aktív apoptoszóma (18.19. ábra). Az aktivált kaszpáz-9 molekulák (hasonlóan a kaszpáz-8-hoz) limitált hasítással effektor pro-kaszpázokat aktiválnak.

Az Apaf-1 molekulák lilák, a citokróm-c piros, a pro-kaszpázok kékek.

18.19. ábra A prokaszpáz-9 apoptoszómába épülése és a proteolitikusan aktív komplex kialakulása. Az aktiválódott és sugaras komplexet kialakító Apaf-1 molekulák pro-kaszpáz-9 fehérjéket toboroznak, aminek az eredménye végül aktív effektor kaszpázok citoplazmatikus megjelenése lesz.

A mitokondriális sejthalál kaszpáz-függő és kaszpáz-független útvonala

A mitokondriális sejthalál kaszpáz függő mechanizmusa a mitokondriumokból nagymennyiségben kiszabaduló citokróm-c közvetítésével aktiválódik. A citokróm-c a citoplazmában inaktív formában lévő Apaf-1 fehérjéhez kötődve iniciálja az apoptoszóma összeszerelődését (l. 18.18. és 18.19. ábra), ezen keresztül a pro-kaszpáz-9 iniciátor kaszpáz és effektor kaszpázok aktiválódását.

Az apoptózist kiváltó stimulusok a főcsapást jelentő kaszpáz-kaszkádokon kívül más molekuláris komponensek révén is hozzájárulhatnak azonban a sejt aktív elhalásához.

A mitokondriális membrán permeabilizálódása következményeként a mitokondriumokból nem csak a kaszpáz aktivációban szerepet játszó citokróm-c jut ki a citoplazmába, hanem a belső membrán PTP csatornáinak megnyílásával más fehérjék is, mint például az AIF és az endonukleáz G (18.20. ábra). Az AIF (apoptosis-inducing factor) egy oxido-reduktáz funkciójú flavoprotein, amely normális körülmények között a mitokondriális intermembrán térben található. Miután azonban a mitokondriális lokalizációs szignálon (MLS) kívül magi (nukleáris) lokalizációs szekvenciája (NLS) is van, nem meglepő, hogy a citoplazmába kerülve onnan a sejtmagba transzlokákódik.

Az AIF a sejtmagban a ciklofilin-A-val molekuláris komplexeket, úgynevezett degradoszómákat képezve részt vesz a DNS fragmentálásában. Az endonukleáz G a sejtmagba jutva hasonló szerepet játszik (18.20. ábra).

A mitokondriumokból kijutó Omi/HtrA2 (high temperature-requirement protein A2) nem csak a IAP-ok gátlását végzi, hanem szerin proteáz aktivitása révén maga is képes pro-apoptotikus fehérjék limitált proteolízissel történő aktiválására. A Smac (second mitochondria-derived activator of caspases) az apoptózisgátló XIAP inhibítora (18.20. ábra).

Mitokondrium hálózattól független esemény az endoplazmatikus retikulumot érő stressz. Ez utóbbi sejtfelszíni (nem halál) receptorokon keresztül is kiváltható (pl. túlzott aktiválással), s lehet kapcsolatos a fehérje szintézist befolyásoló hatásokkal. Az utóbbi esetben jelentős mértékűvé akkor válik, amikor a sejt egy olyan fehérjét termel, ami mutáció következtében hibás konformációjú (l. 13. fejezet). A rossz térszerkezetű fehérje helyreállítására aktiválódnak az ER hibajavító mechanizmusai (pl. az ER chaperonok), de ha a natív konformáció nem állítható helyre, akkor gondoskodnak a fehérje eltávolításáról, azaz annak citoplazmába juttatásáról (l. ERAD mechanizmus). Az endoplazmatikus retikulumot ért folyamatos megterhelés, vagy a receptorok felől érkező szignalizáció hatására az ER ciszternákból Ca2+ionok áramlanak ki, s a citoplazmatikus Ca2+ koncentráció pro-apoptotikus szintre emelkedik. Ez egyrészt a Bad „BH3-only”, másrészt a végrehajtó kaszpázok aktiválását eredményezi (18.14. ábra). A mitokondriumból, valamint az ER-ből kiinduló útvonalakat a 18.20. ábra foglalja össze.

A kép bal oldalán a mitokondrium kék, a citokróm c piros, a mátrix pro-apoptotikus fehérjéi sárgák, kékek és zöldek.

18.20. ábra A mitokondriális sejthalál kaszpáz-függő és kaszpáz-független útvonalainak összefonódása: az előbbit fekete, az utóbbit szürke nyilak és feliratok jelzik (a magyarázatot l. a szövegben) (cit-c: citokróm-c, ER: endoplazmatikus retikulum, ROS: reaktív oxidatív szabadgyök , a többi rövidítést a szöveg tartalmazza).

A külső és a belső halálszignál útvonal összekapcsolása

Amint látjuk, a sejt többnyire a külső és belső kényszerítő körülményeknek – a továbbiakban már elviselhetetlen és a környező sejteket is veszélyeztető – hatására szánja rá magát az önpusztító lépésre. A „visszavonhatatlan döntés” meghozatala után az egész folyamat óramű pontossággal, a fogaskerekek tökéletes illeszkedésével zajlik. A rendszerbe a „véletlen menekvés” esélyének minimalizálása érdekében számos kapcsoló és jelerősítő (amplifikáló) útvonal van beépítve. Ennek egyik szép példája a külső (extrinsic), halál receptorról induló apoptotikus útvonal és a belső (intrinsic), mitokondriális útvonal összekapcsolása az exekuciót végző effektor kaszpázok megfelelő mértékű aktiválása érdekében.

A folyamatban a jelkapcsoló molekula szerepét egy „csak BH3” fehérje, a Bid tölti be, aminek a citoplazmában található inaktív formáját proteolítikus hasítással lehet aktiválni. A Bid csonkolására több olyan enzim is képes, amelyek fontos szerepet töltenek be az apoptózis mechanizmusában, így a Ca2+-függő kalpain (l. 18.20. ábra), a granzim-B és két iniciátor kaszpáz, a kaszpáz-2 és -8 (18.21. ábra).

Amennyiben a pro-kaszpáz-8 DISC-hez kötött aktiválása során nem keletkezik elegendő mennyiségű aktív kaszpáz-8 molekula az effektor kaszpázok közvetlen aktiválásához, a kaszpáz-8 a Bid-et is hasítja (l. II. sejttípus). A csonkolt Bid (tBid), mint aktív „BH3 only” protein az anti-apoptotikus Bcl-2-t és a Bcl-XL-t gátolva (17.I. táblázat), illetve a pro-apoptotikus Bax és Bak molekulák homodimerizációját ösztönözve (18.15. ábra), serkenti a citokróm-c molekulák mitokondriumból citoplazmába irányuló kiáramlását. Itt ennek hatására a már korábban leírt pro-kaszpáz-9 és Apaf-1 molekulákból aktív apoptoszómák szerveződnek (18.18. és 18.19. ábra), amelyek felsokszorozzák az aktív iniciátor és effektor kaszpázok mennyiségét, és a folyamat így tovább gördülhet egészen a sejt teljes megsemmisüléséig (18.21. ábra).

A membrán sötétkék, a Fas szürke, a liganduma barna. A FADD molekulák piros-feketék, a kaszpázok DED doménje piros, CARD doménje lila, p20 doménje barna, p10 doménje pedig világoskék. Az aktivált kaszpáz-3 barna és rózsaszín alegységekből áll. A mitokondrium kék, a Bid fehérje zöld.

18.21. ábra A Bid szerepe a külső és belső halálszignálok által aktivált útvonalak összekapcsolásában, a „jelerősítésben”. A halál receptorhoz adapter fehérjével kötődő pro-kaszpáz-8 aktiválódás után nem csak effektor pro-kaszpázt képes aktiválni, hanem elhasítja a Bid-et is. A csonkolt Bid (tBid) a mitokondrium membránjához kötődve hozzájárul a citokróm-c (cit-c) citoplazmába történő kiáramlásához, ezzel az apoptoszóma aktiválásához, végső soron a DISC-ből induló kaszpáz rendszer működésének felerősítéséhez.

Ellenőrző kérdések

  1. Mit tud a mitokondrium hálózatról? Milyen körülmények között alakul ki, s mikor fragmentálódik? Ennek a dinamizmusnak mi az élettani jelentősége?

  2. Mutassa be röviden a mitokondriumok fúziójának mechanizmusát a molekuláris szereplőkkel együtt!

  3. Mit jelent a mitokondriumok osztódása? Milyen molekuláris mechanizmus áll a hátterében?

  4. Milyen izolált terek alakulnak ki egy ép mitokondriumban? Mi az a kriszta-kapcsoló struktúra és miért fontos a megléte?

  5. Mi a szerepe a citoplazmatikus Ca2+ koncentrációnak az apoptózis mechanizmusában?

  6. Mik azok a mitokondriális apoptogén faktorok?

  7. Mi az apoptoszóma? Milyen komponensei vannak, s hogyan szerelődik össze?

  8. Milyen folyamatot takar a mitokondriális sejthalál útvonal kaszpáz független útvonala? Milyen sejtalkotókat érint, és milyen következményekkel jár?

  9. Egy vázlatrajz segítségével mutassa be, hogy hogyan és hol kapcsolódik össze az apoptózis kaszpáz és kaszpáz független útvonala!

  10. Milyen lehetőség van a külső és belső sejthalál szignálok által beindított útvonalak összekapcsolására? Az ebben szerepet játszó fehérje milyen molekula családba tartozik?

Felhasznált és ajánlott irodalom

Benard, G., Rossignol, R. (2008) Ultrastructure of the mitochondrion and its bearing on function and bioenergetics. Antioxid Redox Signal. 10(8), 1313-42. doi: 10.1089/ars.2007.2000.

Bossy-Wetzel, E., Barsoum, M. J., Godzik, A., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. (2003) Mitochondrial fission in apoptosis, neurodegeneration and aging. Curr Opin Cell Biol.15(6), 706-16. DOI 10.1016/j.ceb.2003.10.015

Chan, D. C. (2012) Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annu Rev Genet.46, 265-87. doi: 10.1146/annurev-genet-110410-132529.

Frohman, M. A. (2010) Mitochondria as integrators of signal transduction and energy production in cardiac physiology and disease. J Mol Med (Berl). 88(10), 967-70. doi: 10.1007/s00109-010-0662-x.

Landes, T., Martinou, J. C. (2011) Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the role of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta.1813(4), 540-5. doi: 10.1016/j.bbamcr.2011.01.021.

Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. (2008) Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev.22(12), 1577-90. doi: 10.1101/gad.1658508.

Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M.T., Palmer, C. S. (2013) Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochimica et Biophysica Acta 1833, 150–161.

Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. (2008) Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22(12), 1577-90. doi: 10.1101/gad.1658508.

Riedl, S. J. Salvesen, G. S. (2007) The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(5), 405-13.

Yuan, S., Akey, C. W. (2013) Apoptosome Structure, Assembly, and Procaspase Activation. Structure 21(4), 501–515. http://dx.doi.org/10.1016/j.str.2013.02.024

Zorzano, A., Liesa, M., Sebastian, D., Segales, J., Palacin, M. (2010) Mitochondrial fusion proteins: dual regulators of morphology and metabolism. Semin Cell Dev Biol.21(6), 566-74. doi: 10.1016/j.semcdb.2010.01.002.