19. Az apoptózis szabályozása: a IAP-ok, a hősokk fehérjék és a p53

A IAP fehérjecsalád

Szerkezeti jellemzők

A IAP (inhibitors of apoptotic proteins) fehérje család első tagját (OpIAP, Orgyia pseudotsugata nuclear polyhydrosis virus) bakulovírusból izolálták, mint olyan fehérjét, amelynek az a szerepe, hogy meggátolja a gazdasejt önpusztító védelmi reakcióját, s minél hosszabb ideig biztosítsa a vírus teljes replikációját. A későbbiekben a gerinctelenektől (élesztő, C. elegans, ecetmuslica) a halakon át az emlősökig számos olyan molekulát fedeztek fel, amelyek funkció és szerkezeti hasonlóság alapján is egy csoportba sorolhatók az OpIAP molekulával.

Valamennyiük szerkezetében közös, hogy rendelkeznek legalább egy, úgynevezett BIR (baculovirus IAP-repeat) régióval, és a többségük egy RING (really interesting new gene)-finger doménnel vagy egy UBC (ubiquitin conjugating) régióval (19.1. és 19.2. ábra).

A BIR domének zöldek, a RING domének narancssárgák, az UBC domén piros.

19.1. ábra A bakulovírus és a Drosophila IAP fehérjéi. A család tagjainak szerkezetére a BIR, a RING és az esetleges UBC domének jellemzőek. (A rövidítések jelentését l. a szövegben.)

A BIR domének zöldek, a CARD domének lilák, a RING domének narancssárgák, az UBC domén piros.

19.2. ábra Az emlősök IAP fehérjéi. A család különc tagja a NAIP (neuronal apoptosis-inhibitory protein/BIRC1), aminek a BIRC doméneken kívül nukleotid-kötő oligomerizáló (NOD, nucleotid-binding oligomerization domain) és leucin-gazdag ismétlődést tartalmazó (LRR, leucine rich repeate) doménjei vannak. A NAIP kaszpáz-9 enzimet köt.

A BIR domének fehérje-fehérje interakciós domének, amik ismétlődése növeli a kötőpartner iránti affinitást, valamint a lehetséges kötőpartnerek számát. Az emlősöknél a BIR2 és a BIR3 vesz részt az apoptotikus fehérjék működésének szabályozásában, míg a BIR1 szignalizációs útvonalak szereplőivel teremt kapcsolatot. A BIR2 és a BIR3 domén képes kapcsolódni egy evolúciósan konzervatív, úgynevezett IAP-kötő, IBM (IAP binding motif) szekvenciához, amit számos fehérje visel. Az IBM szekvenciát megtalálták többek között a kaszpáz-9, a kaszpáz-3 és a kaszpáz-7 enzimeken, a mitokondriumból kiinduló belső sejthalál útvonalon aktiválódó Smac és az Omi proteineken (19.3. ábra). Ennek a szekvenciának a jellegzetessége az, hogy a natív fehérjékben rejtett, csak azok proteolítikus hasításával tárul fel. A Smac és az Omi esetében ez a mitokondriumba irányító szignálszekvencia lehasításakor történik meg, ami azt jelenti, hogy e fehérjék IAP-kötő motívuma a citoplazmában nem jelenik meg, csak akkor, amikor a Smac és az Omi a mitokondrium membrán sérülése során kijutnak a citoszolba (18.15. ábra). A BIR-IBM interakció természetesen megszünteti mindkét kötőpartner más irányú aktivitását, így ennek alapján a Smac és az Omi IAP-inaktiváló, azaz proapoptotikus hatású (18.20. ábra).

A zöld és sárga színnű négyzettel jelölt aminosavak konzervativitást mutatnak. Az ecetmuslicában lévő további kötőhely kékkel jelzett.

19.3. ábra Különböző, főként apoptózist stimuláló fehérjék IBM (IAP-kötő) régiójának evolúciós konzervativizmusa: a nyolc tagból álló tetrapeptid motívumban (A-(V/T/I)-(P/A)-(F/Y/I/V)) zöld és sárga színnel a konzervatív aminosavakat jelöltük. Az ecetmuslicában egy további kötőhely is van, amely kékkel jelzett.

A BIR-IBM kötődés alapján egyes IAP-ok közvetlenül képesek kaszpázok aktivitását gátolni. Ezt az is lehetővé teszi, hogy a cIAP1/2 emlős IAP-okon zimogén kaszpáz rekrutáló (CARD) régió is található, amely révén a hasonló prodoménű iniciátor pro-kaszpázokhoz (kaszpáz-2, -9) kötve képesek meggátolni azok aktivációját (19.4. ábra).

A BIR domének zöldek, a CARD domének lilák, a RING domének narancssárgák. A kölcsönhatásokat piros nyíl és vonalak jelzik.

19.4. ábra A IAP család reprezentatív tagjai és azok funkcionális régiói. A BIR domének enzimgátlók, a CARD régiók iniciátor prokaszpáz toborzók (az ábra alján szereplő DIAP Drosophila IAP)

Az apoptózis-szabályozó hatások

A fenti két mechanizmus alapján a cIAP1, a cIAP2, valamint az XIAP a kaszpázok szintjén képesek apoptózist gátló hatást kifejteni. Kaszpázokhoz való kötődést mindhárom IAP esetében leírtak, azonban csak az XIAP képes az iniciátor kaszpáz-9 és az effektor kaszpáz–3/7 hatékony gátlására (19.5. ábra).

A kaszpáz-9 kék, a kaszpáz-3/7 lila. A kölcsönhatásokat piros és fekete vonalak és nyilak mutatják. A IAP-ok piros téglalapban láthatók.

19.5. ábra A IAP-ok anti-apoptotikus funkciói. Egyes IAP fehérjék képesek a pro-kaszpáz-9 aktiválását megakadályozni, illetve a már aktív kaszpázokat gátolni.

A fehérje családban ugyancsak jellemző domén a RING-finger (C-terminal RING[8] zink finger)régió, melynek révén a IAP-ok ubiquitin-ligázként (E3, az ubiquitin konjugáló enzimsor utolsó tagja) működnek. A RING domén teszi lehetővé az ubiquitin szubsztrátra való átvitelét, mivel biztosítja az E2 enzimmel való kapcsolatot. A RING domént hordozó IAP-ok tehát képesek poli-ubiquitin lánccal specifikusan megjelölni az általuk felismert fehérjéket, pl. a fent említett kaszpázokat (19.6. ábra), a Smac, Omi és TRAF fehérjéket, és így azokat proteaszómális lebontásra ítélik. A BRUCE (BIRC6) esetében egy UBC (ubiquitin conjugating) domént is találunk a molekulában, ami alapján ez a IAP E2 ubiquitin konjugáló enzimként működik. Megjegyezzük, hogy míg az előbb említett BIR-IBM interakción alapuló kötődés reverzibilis, addig a poli-ubiquitiniláció visszafordíthatatlan. A IAP-ok ubiquitin-ligáz aktivitása alapján az is lehetséges, hogy egymást és magukat poli-ubiquitinilálják (az utóbbi auto-ubiquitiniláció), és így az ubiquitin-proteaszóma rendszer révén szabályozzák saját koncentrációjukat, szabad utat adva ezzel az apoptózis folyamatának (19.7. ábra).

A kaszpáz-3/7 lila, az ubiquitin molekulák zöld színűek. Az E1 enzimet zöld, az E2 enzimet kék négyzet jelképezi. A kölcsönhatásokat fekete vonalak és nyilak mutatják. A IAP-ok piros téglalapban láthatók.

19.6. ábra A IAP-ok poli-ubiquitiniláció révén kifejtett anti-apoptotikus hatása. A RING domént hordozó IAP-ok ubiquitin ligázként képesek kölcsönhatásba lépni az ubiquitin-konjugáló enzimmel (E2, kék), illetve egy UBC domén segítségével az ubiquitin aktiváló enzimmel (E1, zöld). A poliubukvitin láncot effektor kaszpázokra „építik”, ami azokat proteolítikus degradációra ítéli.

A kaszpáz-3/7 lila, az ubiquitin molekulák zöld színűek. Az E1 enzimet zöld, az E2 enzimet kék négyzet jelképezi. A kölcsönhatásokat fekete vonalak és nyilak mutatják. A IAP-ok piros téglalapban láthatók.

19.7. ábra A IAP-ok apoptózisnak utat nyitó ubiquitiniláló működése. A IAP-ok mennyiségét poli-ubiquitinilációval maguk a IAP fehérjék (is) szabályozzák. (E1: ubiquitin aktiváló enzim, E2: ubiquitin konjugáló enzim).

Az XIAP aktivitásai és a IAP-ok kooperációja

Egy sejt nyugalmi, „építkező” állapotára – többek között – az jellemző, hogy a citoplazmában a IAP család tagjai „féken tartják” a kaszpázokat. Amíg a sejtet csak szub-apoptotikus stressz-hatások érik, ez az egyensúly fenn is marad. Amint azonban olyan mértékű stressz éri a sejtet, ami aktiválni képes a mitokondriális sejthalál útvonalat (l. 18. fejezet), a sérült mitokondriumokból kiáramló Smacés Omi az evolúciósan konzervatív IBM régióik révén (19.3. ábra) gátolni tudják a IAP-ok működését. Ez a kaszpázok „gátlástalan” tobzódásához vezet, s a sejt, mint egy fékevesztett jármű a lejtőn, egyre gyorsuló sebességgel rohan a végzete felé.

A IAP fehérjék egy többszintű, egymást támogató hálózat kialakításával valamennyi (külső, belső) kaszpáz-függő sejthalál útvonalat képesek gátolni. E téren a XIAP (X-linked IAP) rendelkezik a legszélesebb repertoárral. Kétféle mechanizmus útján is gátolja az iniciátor kaszpáz-9, valamint az effektor kaszpáz-3/7 működését: egyrészt BIR-IBM interakción alapuló kötéssel, másrészt a kaszpázok szubsztrátkötő zsebének „lefedésével”. Ezen felül megakadályozza a pro-kaszpáz-9 dimerizációját (allosztérikus gátlás), ezzel aktiválódását. Más IAP-ok ubiquitiniláció révén proteaszómális degradációra ítélhetnek pro-apototikus fehérjéket. A Smac például gátolja az XIAP-ot (IBM-BIRC kölcsönhatás révén), ám ez a gátlás feloldható a Smac ubiquitinilálásával, amit a RING doménnel rendelkező cIAP-ok képesek elvégezni (19.8. ábra). Vannak adatok arra is, hogy a IAP-ok heterodimerek képzésével képesek egymás aktív állapotát stabilizálni.

A fentiek alapján a IAP fehérjék a mitokondriális útvonal aktiválását képesek gátolni. Az ebben az útvonalban (is) effektor kaszpázként szereplő enzimeket (kaszpáz-3, -7) azonban a külső, sejthalál receptorok DISC-jéből kiinduló útvonal is eléri (19.8. ábra).

A mitokondrium kék, benne a pro-apoptotikus faktorok piros (citokróm-c) sárga, zöld és kék színű korongok. Az XIAP az ábra középpontjában zöld négyzettel jelölt. A kölcsönhatásokat fekete nyilak és vonalak jelzik, rajtuk a piros feliratok a kölcsönhatásban résztvevő fehérje interakciós doméneket jelölik. A belső útvonal elemei a kép felső és középső részén, a külső útvonal által aktivált elemek a kép alsó sávjában szerepelnek.

19.8. ábra Az XIAP aktivitását meghatározó kölcsönhatások. A BIR-IBM interakció alapján az XIAP képes gátolni a kaszpáz-9/3/7 aktivitását, de ugyanez a kölcsönhatás azt is lehetővé teszi, hogy a Smac és az Omi felfüggessze ezt az inhibíciót. Más, RING doménnel rendelkező IAP fehérjék a Smac és az Omi ubiquitinilálásával támogathatják az XIAP anti-apoptotikus tevékenységét. A IAP-ok a belső (mitokondrium-mediált) útvonalon mind az indukciót, mind pedig a végrehajtást képesek gátolni, de a külső jellel induló útvonalon csak az effektor kaszpázokra vannak hatással.

A mitokondriális eredetű Smac igen kiterjedt hatásokkal rendelkezik. Korábban szó volt arról, hogy a TNF receptorból kiinduló, NF-κB aktiváló jelátviteli útvonalban cIAP-ok is szerepelnek (16.13. és 16.14. ábra). Annak, hogy a Smac (az XIAP mellett) képes hozzákötődni a cIAP fehérjékhez is, végzetes szerepe vant abban, hogy a sejt sorsa a sejthalál felé terelődik. A sejthalál típusa, a TNF receptor DISC-jének és az abból származó II. komplexnek az összetételétől függően, lehet apoptózis vagy nekroptózis. A Smac-cIAP kötődés hatására a cIAP auto-ubiquitinilálódik (19.7. ábra), ezzel proteaszómális lebontásra irányítódik. Hiányában a DISC-ből származó II. komplex vagy effektor kaszpázokat aktivál, vagy RIP3 jelenlétében oxidatív szabad gyököket képez (l. „Útvonal a nekroptózis felé” c. fejezet). Az előbbi apoptózishoz, az utóbbi nekroptózishoz vezet (16.14. és 19.9. ábra).

A membrán sötétkék, a benne ülő receptorok rózsaszínek, a ligandumok fölöttük sötétebbek. Az I. komplexekben a cIAP sárga, a TRADD szürke, a TRAF zöld, a RIP lila. A II. komplexekben ehhez képest plusz szereplő a kaszpáz-8, ami piros és a c-FLIP, ami szürke. Az ábra bal alsó részén a proteaszóma szürke, a cIAP-ra ható Smac felirata piros.

19.9. ábra A cIAP Smac általi megkötésének hatása a TNF receptoron keresztüli sejthalál kiváltásában. A cIAP fehérje a sejt túlélését segíti oly módon, hogy a TNF receptor DISC-jébe épül be, s olyan II. komplex kialakulását segíti, ami az NF-κB útvonalat aktiválja (A). A mitokondriális eredetű Smac a cIAP auto-ubiquitinilációját, ezzel proteaszómális lebomlását okozza (B), cIAP hiányában pedig a II. komplex összetétele vagy az apoptózis, vagy a nekroptózis felé tereli a sejtet (C).

Az XIAP hátba támadása: a tBid szerepe

Korábban szót ejtettünk azokról a sejtekről, amelyek az apoptózis indukciója szempontjából az úgynevezett II. típusba sorolhatók. Ezekben a sejtekben a sejthalál receptorok DISC-je által aktivált iniciátor kaszpáz-8 enzimek a Bid „BH3-only” fehérjét is hasítják. A csonkolt Bid (t-Bid) aktiválja a pro-apototikus Bax fehérjét, ami ekkor a mitokondrium külső membránjába integrálódva (a Bak fehérjékkel együttműködésben) transzmembrán pórusok (MAC) képzésével beindítja a belső, mitokondriális sejthalál indukciós útvonalat (18.15. és 19.10. ábra). Ez a mozzanat a IAP-ok szempontjából egy hátba támadással ér fel, hiszen a citoplazmába nagy mennyiségben kiáramló Smac és Omi (pro-apoptotikus faktorok aktiválása mellett) gátolják az XIAP-ot, így szabad utat nyitnak a külső útvonalon is megindított effektor kaszpáz aktivációnak (19.10. ábra).

A mitokondrium kék, a belőle kiáramló apoptogén faktorok közül a citokróm-c piros, a Smac és az Omi kék és zöld. A kép IAP-okat zöld négyzetben tüntettük fel. A Bid közvetítésével zajló útvonalat vastag piros nyilakkal jelöltük.

19.10. ábra A tBid a Bax fehérje aktiválásán keresztül gondoskodik az XIAP gátlásáról, így aktiválva és védve a belső útvonalat, hatékonyabbá teszi a halál-receptorról induló jelátvitelt is (a rövidítések jelentését l. a szövegben).

A IAP-ok nem apoptotikus funkciói

A IAP fehérjék elsősorban az apoptózis gátlásában betöltött szerepükről ismertek, e mellett azonban nem apoptotikus funkciókkal is rendelkeznek. Ezek közül néhányat a 19.I. táblázatban foglalunk össze. Közülük csak egyet emelünk ki: a cIAP1/2 és az XIAP – valószínűleg több szinten is – részt vesz a TNF receptorokból kiinduló NF-κB aktiváló jelátvitelben (16.13. és 16.14. ábra).

19.I. táblázat. A IAP fehérjék néhány azonosított funkciója.

IAP

Funkció

BIRC1

kaszpáz-1 aktiváció, neurit növekedés

BIRC2/cIAP1

NF-κB aktiváció, proliferáció, differenciáció

BIRC3/cIAP2

NF-κB aktiváció

BIRC4/XIAP

NF-κB aktiváció, Bmp szignalizáció, proliferáció, neuronok túlélésének elősegítése

BIRC5/Survivin

kromoszóma szegregáció sejtosztódásban, citokinezis

BIRC6/Apllon

placenta fejlődés, proliferáció

DIAP1

pro- és antiapoptotikus hatás az embrionális fejlődésben

A hősokk fehérjék

Rövid bemutatás

Az eukarióta sejtek legősibb, evolúciósan rendkívül konzervatív, intracelluláris védelmi rendszerét a hősokk fehérjék (heat shock protein, Hsp) alkotják. Ezek a fehérjék, mint molekuláris chaperonok (dajkafehérjék) fejtik ki hatásukat. Alapvető funkcióik: 1) elősegítik a frissen szintetizálódott fehérjék feltekeredését (felgombolyítását), a fiziológiás (natív) konformációjuk kialakulását; részt vesznek 2) a hibás konformációjú fehérjék szerkezetének helyreállításában; 3) az irreverzibilisen károsodott fehérjék lebontásának szabályozásában; 4) bizonyos fehérjéknek különböző, membránhatárolt sejtorganellumokba (sejtmag, mitokondrium) történő transzlokációjában és 5) a mitokondrium-mediált apoptotikus útvonalon a citoszolba kiáramlott apoptogén faktorok lekötésében, inaktiválásában (19.11. ábra). Ezeket a funkciókat a dajkafehérjék csak úgy tudják ellátni, hogy közvetlen molekuláris kontaktusba lépnek a kezelendő fehérjékkel, a „kliensekkel”.

Az ábrán fekete, zöls és piros feliratok szerepelnek. A jobb oldalon található mitokondrium kék.

19.11. ábra A dajkafehérjék legfontosabb funkcióinak összefoglalása (egyszerűsített vázlat). Hsp-k részt vesznek a szintetizálódó fehérjék helyes konformációjának kialakításában, a hibás konformáció helyreállításában, vagy a rossz térszerkezetű fehérjék eltávolításában, illetve fehérjék sejtorganellumokba irányuló transzportjának lebonyolításában és szabályozásában, valamint apoptózist indukáló stresszhatásra a citoszolba jutó apoptogén faktorok lekötésében (inaktiválásában).

A dajkafehérjék feladatairól, működéséről, a sejt életében betöltött szerepéről hatalmas irodalom áll rendelkezésre. A könyv tematikájához kapcsolódva itt csak néhány példát hozunk fel annak bemutatására, hogy a dajkafehérjék nagy családján belül a három legfontosabb és legtöbbet tanulmányozott alcsalád (Hsp90, Hsp70, kis molekulatömegű chaperonok) tagjai milyen szerepet töltenek be az apoptózis különböző folyamatainak szabályozásában. Az alcsaládok itt említett elnevezése a dajkafehérjék legáltalánosabban elfogadott csoportosítását tükrözi, ami a családtagokat a molekulatömegük alapján sorolja alcsoportokba.

A dajkafehérjéknek az apoptózis szabályozásában betöltött funkciói

A Hsp90

A Hsp90 kétféle útvonalon szabályozza az apoptotikus sejthalált. Az egyikben a RIP és a túlélési faktorok (pl. IGF) jelenlétében aktiválódó Akt (másnéven: protein kináz B) protein kinázokkal lép köcsönhatásba (stabilizálja azokat). Az inhibítor IκB foszforilációjával elősegíti az NF-κB disszociációját az inhibítorról és ezzel az NF-κB túlélési útvonalat támogatja (19.12. ábra). Emellett a Hsp90 által stabilizált Akt, mint Ser/Thr-kináz képes a „BH3-only” Bad fehérje foszforilációja révén annak pro-apoptotikus hatását kivédeni/csökkenteni. A másik útvonalban a Bax transzlokáció gátlása révén akadályozza a mitokondriumok külső membránjában a transz-membrán pórusok (MAC) kialakulását és így apoptogén faktorok kiáramlását a mitokondriumokból (19.13. ábra).

A membrán sötétkék, a TNF receptor rózsaszín, a ligandum lila. Az I. komplexben a cIAP sárga, a TRAF zöld, a TRADD szürke, a RIP1 lila. Az Akt enzimet narancssárga fekvő hatszög jelképezi. A Hsp90 zöld, az NF-κB szintén zöld, az inhibítora szürke. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19. 12. ábra A Hsp90 NF-κB aktiválást támogató hatása. A Hsp90 stabilizálja a RIP fehérjét a TNF receptor DISC-jében, ami feltétele az NF-κB aktiválását eredményező jelátviteli útvonal beindításának. A hősokk fehérje hozzákötődik a túlélési faktorok hatására foszforilálódó Akt kinázhoz, védi annak foszforilált formáját. A foszforilált Akt foszfát csoportot kapcsol az IκB fehérjére, ami így elengedi az NF-κB-t.

A membrán sötétkék, a Hsp90 zöld, a mitokondrium kék. A Bad és Bax fehérjék sára és barna színűek, az Akt enzimet narancssárga fekvő hatszög jelképezi. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19.13. ábra A Hsp90 pro-apoptotikus Bcl-2 fehérjékre irányuló citoprotektív hatása. A Hsp90 kétféle módon is gátolja a mitokondrium külső membránjában történő pórusképzést: egyrészt az Akt kináz stabilizálásával hozzájárul a Bad fehérje foszforilálásához, másrészt gátolja a Bax fehérje mitokondrium felszínére történő transzlokációját.

A Hsp70

A Hsp70 család tagjai rendkívül szerteágazó és sokoldalú feladatot látnak el az eukarióta sejtek működésének, ezzel együtt az apoptózis folyamatának szabályozásában. Sejthalált kiváltó hatásokra a Hsp70 család stressz-indukálható tagjainak fokozott expressziója figyelhető meg az érintett sejtekben. Az aktiválódott Hsp70 molekulák az apoptózis sejthalál receptorból kiinduló (külső) és a mitokondrium-mediált (belső) útvonalait több ponton is képesek gátolni (19.14. és 19.15. ábra).

Elsőként említjük, hogy a Hsp70 az iniciátor kaszpáz-8 aktív, tetramer formájának kialakulását gátolja, illetve az effektor kaszpáz-3 aktivitását is jelentős mértékben képes csökkenteni (19.14. ábra).

A membrán sötétkék, a Fas szürke, a liganduma barna. A FADD sötétbarna, a Hsp70 zöld négyzettel jelölt a kép alján. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19.14. ábra A Hsp70 aktív kaszpázok megjelenését akadályozza a Fas jelátviteli útvonalban. A hősokk fehérje gátolja az aktív kaszpáz-8 tetramerizációját és az effektor kaszpáz-3 aktivitását is csökkenti.

Fontos szerepe továbbá, hogy a mitokondrium-mediált útvonalon egyrészt „lekötőként” (scavenger) akadályozza a Bcl-2 család pro-apoptotikus tagjainak stressz hatásokra történő aktiválását, másrészt közvetlenül gátolja az aktivált Bax citoplazmából mitokondrium külső membránjához történő áthelyeződését. Amennyiben mégis bekövetkezik a membránpórusok (MAC) kialakulása, a Hsp70 a citoplazmába kiáramló apoptogén faktorok (AIF, citokróm-c) megkötésével és az aktív apoptoszóma összeszerelődésének megakadályozásával (Apaf-1 kötése, pro-kaszpáz-9 apoptoszómába épülésének gátlása) gátolja az effektor kaszpázok megjelenését (19.15. ábra).

Kiemelendő, hogy a Hsp70 képes megakadályozni a különböző apoptotikus útvonalak összekapcsolásában kulcsszerepet játszó „BH3-only” Bid fehérjének a hasítását, így elejét veszi a csonkolt Bid (t-Bid) pro-apoptotikus hatásainak. Egyes kísérleti eredmények szerint a Hsp90-hez hasonlóan a Hsp70 is képes az NF-κB útvonal serkentésére (19.15. ábra). A Hsp72 védi a lizoszóma membrán integritását is, ezáltal gátolja a katepszinek citoszolba történő kiáramlását és megelőzi az általuk okozott sejtkárosító folyamatokat.

A képen középtájon egy kék mitokondrium található, balra, kicsit lejjebb a Hsp70-et jelző zöld négyzet. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19.15. ábra A Hsp70 mitokondriális sejthalál útvonalat gátló hatásai. A hősokk fehérje több ponton is gátolja a belső útvonal aktiválását és felerősödését: gátolja a Bid hasítását (1), a Bax fehérje mitokondriumhoz történő szállítását (2), megköti a mitokondriumból kiszabaduló apoptogén faktorokat (3), megakadályozza az Apaf-1 oligomerizációját (4) és a pro-kaszpáz-9 apoptoszómába kötését (5).

A Hsp27

A kis molekulatömegű chaperonokhoz tartozó Hsp27 mindkét sejthalál útvonalon hat. A külső útvonal beindítását a pro-kaszpáz-8 aktiválásának megakadályozásával éri el. A belső útvonal iniciálását a mitokondriumból kiáramló citokróm-c megkötésével és a pro-kaszpáz-3 aktiválásának gátlásával akadályozza. Őrködik a mikrotubuláris hálózat felett, így megelőzi azt, hogy annak szétszerelődésével a pro-apoptotikus „BH3-only” Bim fehérjék felszabaduljanak (17.7. ábra) és a mitokondrium felszínéhez kötődjenek. Ugyanígy megakadályozza, hogy a külső és a belső sejthalál útvonal összekapcsolásában szerepet játszó t-Bid a mitokondrium külső membránjához, illetve a Bax pórusképző fehérjéhez kapcsolódjon (19.16. ábra). Apoptózist gátló hatásai mellett a Hsp27 a Hsp90-hez hasonlóan a sejt túlélését is segíti azzal, hogy stabilizálja az Akt kinázt, így segíti az IκB lebontását, amivel lehetővé teszi az NFκB sejtmagba jutását (19.17. ábra).

A képen középtájon egy kék mitokondrium található, amiből piros korongokkal jelölt citokróm-c molekulák távoznak lefelé. Ettől balra, kicsit lejjebb a Hsp70-et jelző zöld négyzet. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19.16. ábra A Hsp27-nek a belső sejthalál útvonalat blokkoló anti-apoptotikus hatásai. A kis molekulatömegű hősokk fehérje a mitokondriumból kijutott citokróm-c-t megköti (1), illetve akadályozza a kaszpáz-3 aktiválását (2). Gátolja a pro-apoptotikus Bcl-2 fehérjék (Bim, Bax, Bid) mitokondrium felszínéhez kötődését (3–5), így transz-membrán pórusok kialakulását.

A membrán sötétkék, a TNF receptor rózsaszín, a liganduma lila. Az I. komplexben a cIAP sárga, a TRAF zöld, a TRADD szürke, a RIP1 lila. Az Akt enzimet narancssárga fekvő hatszög jelképezi. A Hsp27 zöld, az NF-κB szintén zöld, az inhibítora szürke. A kölcsönhatásokat fekete és zöld szaggatott vonalak jelzik.

19.17. ábra A Hsp27 NF-κB útvonalat támogató hatása. A hősokk fehérje stabilizálja az Akt kinázt, ami foszforilálja az IkB-t, így szabaddá teszi az NF-κB-t.

A hősokk fehérjék fent felsorolt funkcióit a 19.18. ábra összegzi.

A fenti ábrákon szereplő molekulák itt szürkék, csak a Hsp-k szinesek. A Hsp90 zöld, a Hsp70 kék, a Hsp27 világoszöld. Hatásaikat velük azonos színű nyilak mutatják. A kép közepén szereplő, piros betűkkel írt effektor kaszpáz-3 aktiválását és hatását mutattó nyilak vastag piros nyilak.

19.18. ábra A hősokk fehérjéknek az apoptózis jelátviteli folyamatait szabályozó legfontosabb beavatkozási pontjai. A Hsp-k az ábra bal oldalán szereplő folyamatokat az Akt kináz Bad fehérjérere gyakorolt hatásának kivételével gátolják, a jobb oldalon láthatókat segítik. (A halál receptorok DISC-jéből származtatott II. komplexeket, valamint a receptor internalizáció hatását nem tüntettük fel. A magyarázatot l. a szövegben.)

A p53 szerepe az apoptózis szabályozásában

A sejt genetikai állományát alkotó DNS molekulák a transzkripciós és a transzlációs útvonal révén központi szerepet töltenek be a sejt élettani folyamatainak irányításában, valamint az információk utódsejtekbe történő átadásában. A DNS károsodás tehát súlyos zavart okozhat a sejt egyedi működésében, ami végső esetben a sejt pusztulásához vezet. Ugyanakkor a sejt szabályozatlan és korlátlan osztódásához vezető úgynevezett malignus (rosszindulatú) transzformáció az egész szervezetet veszélyezteti.

Ezért nélkülözhetetlen a sejt DNS állományának szigorú védelme, szükség esetén károsodásainak helyreállítása (reparációja), végszükségben (a DNS visszafordíthatatlan károsodásakor) pedig a sejt „öngyilkossága”, azaz a halálba menekülés, az apoptózis. Érdekes módon a DNS károsodás olyan jelátviteli módokat aktivál, amelyeknek fő komponensei kinázok. A biztonsági őr szerepét betöltő p53 fehérje az a transzkripciós faktor, amelynek aktivációja ezen kinázok által közvetített foszforiláció révén zajlik (19.19. ábra, 19.II. táblázat). Az aktivált p53 számtalan, az apoptózisban kulcsszerepet játszó fehérje génjének átíródását szabályozza. Azon aminosavak (Ser), amelyeknek foszforilációja az aktív önmegsemmisítés stimulálását eredményezi, jellemzően a p53 molekula N-terminálisán helyezkednek el.

A különböző domének más-más színűek, a foszforilációs helyek a molekula bal végén találhatók, azokat piros nyilak jelzik.

19.19. ábra A p53 molekula szerkezete. Az apoptózisban szerepet játszó foszforilációs helyek jellemzően az N-terminálison elhelyezkedő szerinek (ATM: ataxia talengiectasia mutated, ATR: ataxia talengiectasia and Rad3 related protein, JNK: c-JUN N-terminális kináz, MAPKAPK2: mitogén aktivált protein kináz-aktivált protein kináz 2, TAD: transactivation domain, SH3: Src homology 3-like domain, NLS: magi lokalizációs szignál, NES: magi export szignál, TET: tetramerizációs domén, REG: C-terminális regulátor domén)

19.II. táblázat. A p53 apoptotikus kimenettel járó foszforilációi (az enzimnevek rövidítéseinek jelentését l. a fenti, 8.16. ábra aláírásában)

Foszforilációs hely

Kinázok

Aktiváló tényezők

Ser15

ATM

DNS sérülés

Ser15, Ser37

ATR

γ-sugárzás, UV

Ser15

ERKs

UV

Ser20

JNK

UV

Ser20

MAPKAPK2

UV

Ser15

p38 kináz

UV

A p53 elsősorban az apoptózis mitokondrium-függő útvonalának serkentésén keresztül fejti ki hatását. Egyrészt a Bcl-2 molekula család anti-apoptotikus tagjainak (Bcl-2, Bcl-XL) az expresszióját gátolja, ezáltal a mitokondriumokat kiszolgáltatottá teszi az apoptotikus hatásoknak. Másrészt az aktív (programozott) sejthalál kivitelezésében (Apaf1, Fas, Bax) vagy annak ösztönzésében (Bid, Noxa, Puma) résztvevő molekulák expresszióját stimulálja (19.22. ábra).

A PIDDoszóma

Az aktív p53 képes beindítani - egy, az apoptoszómához hasonló alapon szerveződő citoplazmatikus komplex, az úgynevezett PIDDoszóma összeszerelődésén keresztül - egy kaszpáz aktivációs sejthalál útvonalat is. Ennek a komplexnek a centrális molekulája a PIDD (p53-induced protein with death domain), amelynek expresszióját a p53 fokozza. A PIDD (a halál receptorokhoz hasonlóan, l. Fas) C-terminálisán (PIDD-CC) egy DD (death domén) szekvenciát hordoz, amely fehérje-fehérje kölcsönhatást alakíthat ki más, DD részletet tartalmazó molekulával (19.21. ábra).

Az aktivált PIDD a citoplazmában lévő RAIDD (RIP-associated ICH-1/CAD-3 homologous protein with a death domain) adapter fehérjét köti, mégpedig annak halál doménjén (DD) keresztül (19.20. ábra). Mivel a RAID N-terminálisa egy CARD domént hordoz, az adapter fehérje pro-kaszpáz molekulákat képes toborozni a komplexbe.

A PIDDoszómába beépülő zimogén kaszpáz a pro-kaszpáz-9-hez hasonló szerkezetű pro-kaszpáz-2, amely szintén iniciátor kaszpáz (19.21. ábra).

Az LRR régió zöld, a fehérje interakciós domén szürke, a DD domén a PIDD molekulában sötétbarna, a RAIDD fehérjében piros. A CARD domének lilák, a kaszpáz p20 doménje barna, p10 doménje pedig kék.

19.20. ábra A PIDDoszóma kialakításában résztvevő fehérjék szerkezete. A PIDD proteolitikus hasítással egy N- és egy C-terminálist tartalmazó részre (PIDD-N és PIDD-C) bontható. A PIDD-CC az utóbbi további emésztésével kapható végdarabja, amely a halál domént tartalmazza (LRR: hét tandem leucin gazdag ismétlődés, Zu5: fehérje interakciós domén, CARD: caspase recruitment domain, p20: az aktív kaszpáz nagy alegysége, p10: az aktív kaszpáz kis alegysége, PIDD, RAIDD: l. szövegben)

A PIDDoszóma sugaras szimmetriájú, virágra emlékeztető komplex. Középpontjában a PIDD fehérje C terminálisa barna, a hozzá kapcsolódó RAID DD doménje piros, a CARD doménje lila. A „virágszirmokat” képező pro-kaszpázok CARD doménje szintén lila, a p20 barna, a p10 kék. A jelmagyarázat a jobb alsó sarokban sárga négyzetben látható.

19.21. ábra A PIDDoszóma szerkezete: a komplex hét kaszpáz-2 molekulát tartalmaz (a rövidítések jelentését l. a szövegben)

Az aktív kaszpáz-2 közvetlenül részt vesz effektor pro-kaszpázok (prokaszpáz-3, -6, -7) proteolitikus aktiválásában és/vagy – a kaszpáz-8-hoz hasonlóan – csonkolja a Bid-et, és „felerősíti” a mitokondriális (belső) sejthalál útvonalat (19.22. ábra).

Öszefoglalva: a p53 aktivációja esetében nagyon igaz az a mondás, miszerint „minden út Rómába” – azaz a sejt aktív önpusztításához – „vezet” (19.22. ábra).

A leírtak alapján nem véletlen, hogy az immortalizált sejtek létrehozásának egy közkedvelt eszköze a p53 gén kiütése (p53 knockout).

A sejtmembrán és a magmembrán sötétkék, a halál receptorok feketék. A p53 világoskék kör, a CAD piros, az ICAD narancssárga, a kép jobb oldalán szereplő mitokondrium kék, az alatta lévő apoptoszóma lila és kék, piros citokróm-c korongokkal, az aktív kaszpáz lila és barna. Az ábra közepén zöld négyzetben és háttérrel a Bcl-2 család anti-apoptotikus tagjainak nevei, felettük barna négyzetben és háttérrel a pro-apoptotikus tagjai olvashatók. Utóbbiak felett a PIDDoszóma háromszirmú virágra emlékeztető alakja látható. A szintén pro-apoptotikus Bid zöld, a mitokondrium fölött található.

19.22. ábra A p53 fehérje központi szerepe az apoptózisban (az ábra csak a legfontosabb útvonalakat mutatja; a részleteket l. a szövegben)

Ahogyan azt a 15. fejezetben írtuk, az apoptózis során a haldokló sejtről lefűződő apoptotikus testeket és az egyre zsugorodó sejtet is membrán határolja, ami megakadályozza, hogy gyulladást kiváltó faktorok kerüljenek ki a citoplazmából az extracelluláris térbe. Annak biztosításáról azonban, hogy ez a teljes elhalás után se következzen be, s ne maradjanak „temetetlen holtak a csatamezőn”, makrofág sejtek és a környező szövet fagocitózisra képes sejtjei gondoskodnak. Ennek a folyamatnak a részleteiről a következő fejezetben lesz szó.

Ellenőrző kérdések

  1. Mit jelent a IAP elnevezés? Jellemezze a IAP fehérjecsaládot! Milyen fehérje interakciós kölcsönhatásokra képesek?

  2. Hogyan szabályozzák a IAP fehérjék az apoptózis? Az ubiquitiniláció ebben milyen szerepet tölt be?

  3. Mutassa be egy vázlatrajzon azt, hogy hogyan játszik központi szerepet az XIAP az apotózis féken tartásában! Hogyan lehet az XIAP-ot megkerülni, illetve semlegesíteni?

  4. Mutassa be röviden a hősokk fehérjéket és a sejtben betöltött funkcióikat!

  5. Hogyan vesz részt a Hsp90 az apoptózis szabályozásában?

  6. Hogyan vesz részt a Hsp70 az apoptózis szabályozásában?

  7. Hogyan vesz részt a kis molekulasúlyú Hsp27 az apoptózis szabályozásában?

  8. Egy vázlatrajzon mutassa be azt, hogy a Hsp90, a Hsp70 és a Hsp27 mely pontokon avatkozik be az apoptózis folyamataiba!

  9. Mutassa be a p53 molekula szerkezetét, s apoptotikus kimenettel járó foszforilációit!

  10. Mit értünk az alatt, hogy a p53 elsősorban az apoptózis mitokondrium-függő útvonalának serkentésén keresztül fejti ki hatását? Milyen molekulák expresszióját serkenti?

  11. Mi az a PIDDoszóma, s melyik prokaszpázt aktiválja?

  12. Egy vázlatrajz segítségével mutassa be a p53 apoptózisban betöltött központi szerepét!

Felhasznált és ajánlott irodalom

Arya, R., Mallik, M., Lakhotia, S. C. (2007) Heat shock genes – integrating cell survival and death. J. Biosci. (32) 595–610.

Beug, S. T., Cheung, H. H., LaCasse, E. C., Korneluk, R. G. (2012) Modulation of immune signalling by inhibitors of apoptosis. Trends Immunol. 33(11), 535-45. doi: 10.1016/j.it.2012.06.004.

Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. (2012) Caspase-2: the orphan caspase. Cell Death and Differentiation (19), 51–57; doi:10.1038/cdd.2011.157

Darding, M., Meier, P. (2012) IAPs: Guardians of RIPK1. Cell Death and Differentiation(19), 58–66; doi:10.1038/cdd.2011.163

Dubrez-Daloz, L., Dupoux, A., Cartier, J. (2008) IAPs. Cell Cycle7(8), 1036-1046.

Kaufmann, T. Strasser, A. Jost, P.J. (2012) Fas death receptor signalling: roles of Bid and XIAP. Cell Death and Differentiation(19), 42–50; doi:10.1038/cdd.2011.121

Labbe, K., McIntire, C. R., Doiron, K., Leblanc, P. M., Saleh, M. (2011) Cellular inhibitors of apoptosis proteins cIAP1 and cIAP2 are required for efficient caspase-1 activation by the inflammasome. Immunity35(6), 897-907. doi: 10.1016/j.immuni.2011.10.016.

Sreedhar, A. S., Csermely, P. (2004) Heat shock proteins in the regulation of apoptosis: new strategies in tumor therapy. A comprehensive review. Pharmacology & Therapeutics (101), 227–257.

Srinivasula, S. M., Ashwell, J. D. (2008) IAPs: What’s in a name? Mol Cell. 30(2), 123–135. doi:10.1016/j.molcel.2008.03.008.

Stetler, R. A., Gan, Y., Zhang, W.,, Liou, A. K., Gao, Y., Cao, G., Chen, J. (2010) Heat Shock Proteins: Cellular and molecular mechanisms in the CNS. Prog Neurobiol. 92(2), 184–211. doi:10.1016/j.pneurobio.2010.05.002.



[8] RING: really interesting new gene