Bevezetés a biokémiába gyakorlati jegyzet

dr Hegyi György

dr Kardos József

dr Kovács Mihály

dr Málnási-Czizmadia András

Micsonai András

dr Nyitray László

dr Pál Gábor

dr Radnai László

dr Reményi Attila

dr Venekei István

E könyv kutatási és oktatási célokra szabadon használható. Bármilyen formában való sokszorosítása a jogtulajdonos írásos engedélyéhez kötött.

Készült a TÁMOP-4.1.2.A/1-11/1-2011-0073 számú, „E-learning természettudományos tartalomfejlesztés az ELTE TTK-n” című projekt keretében. Konzorciumvezető: Eötvös Loránd Tudományegyetem, konzorciumi tagok: ELTE TTK Hallgatói Alapítvány, ITStudy Hungary Számítástechnikai Oktató- és Kutatóközpont Kft.


Tartalom

ELŐSZÓ
1. Biokémiai és molekuláris biológiai eszközök
1.1. Biológiai eredetű minták és vegyszerek a laboratóriumban
1.2. Folyadékok tárolására szolgáló műanyag és üvegcsövek
1.3. Főzőpoharak és lombikok
1.4. Folyadékok térfogatának mérése: mérőhengerek és automata pipetták
1.5. Folyadékok keverése
1.6. Tömegmérés
1.7. Víztisztítás; oldatok, eszközök sterilizálása
1.8. Sejttenyészetekkel végzett munka
1.9. Centrifugák
1.10. Egyéb, gyakori technikák: spektrofotométer, elektroforézis, kromatográfia
1.11. Biológiai minták tárolása
2. Mértékegységek és oldatok
2.1. A mértékegységekről
2.2. A mennyiségek számszerű kifejezési módjai
2.2.1. Az adatok pontossága – értékes (szignifikáns) számok
2.2.2. Nagy és kis mennyiségek kifejezési módjai: hatványkitevős és prefixum formák
2.3. Az oldatokról
2.3.1. Az oldatok meghatározása és főbb formái
2.3.2. Az oldatok mennyiségi leírása – koncentráció egységek
2.3.3. Oldatok készítése
2.4. Dialízis
2.4.1. A dialízis elve
2.4.2. A dialízis gyakorlati vonatkozásai és alkalmazása
3. Ionizációs egyensúlyok
3.1. Savak és bázisok ionizációs egyensúlya vizes oldatokban
3.2. A pH-t stabilizáló sav bázis rendszerek (pufferek) és a pH hatása az ionizációra
3.3. A pH mérése
3.4. Megértést tesztelő feladatok
3.5. pI és töltés számítási gyakorlatok
4. Spektrofotometria, fehérjekoncentráció mérése
4.1. Fotometria
4.2. Az UV-VIS fotométer
4.3. A fotometria egyéb alkalmazási lehetőségei
4.4. A fotometria során leggyakrabban felmerülő problémák
4.5. Fehérjekoncentráció meghatározása
4.6. A spektrofotometria gyakorlata
4.7. Fluorimetria
4.7.1. A fluoreszcencia fizikai alapja.
4.7.2. A fluorimetria biokémiai és molekuláris biológiai alkalmazásai.
5. Sejtek feltárása és fehérjék izolálása
5.1. A sejtek feltárása
5.2. Sejtfrakcionálás
5.3. A centrifugálás
5.3.1. Differenciál centrifugálás - sejtfrakcionálás döntően részecske méret alapján
5.3.2. Sűrűség-gradiens centrifugálás - sejtfrakcionálás részecske sűrűség alapján
5.4. Fehérjék durva frakcionálása
5.4.1. Oldhatóságon alapuló módszerek
5.4.2. Részecskeméreten alapuló módszerek
6. Kromatográfiás módszerek
6.1. Gélszűréses kromatográfia
6.2. Ioncserés kromatográfia
6.3. Hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia
6.4. Affinitás kromatográfia
6.5. Nagyhatékonyságú (nagynyomású) folyadékkromatográfia, HPLC
7. Elektroforézis technikák
7.1. Az elektroforézisről általában
7.2. A gélelektroforetikus technikákról általában
7.3. A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
7.3.1. A PAGE módszerről általában
7.3.2. Natív PAGE
7.3.3. SDS PAGE
7.3.4. Izoelektromos fókuszálás
7.3.5. Kétdimenziós (2D) elektroforézis
7.4. Az agaróz gélelektroforézis
7.5. Festési eljárások
7.5.1. Általános fehérjefestékek
7.5.2. Általános DNS-festékek
7.5.3. Specifikus fehérje-kimutatási eljárások
7.6. A fehérjeelválasztó gélelektroforézis technikák néhány jellegzetes példája
7.6.1 Natív PAGE - Tejsav-dehidrogenáz izoenzimek elválasztása és kimutatása
7.6.2. Miofibrilláris fehérjék molekulatömegének meghatározása SDS PAGE módszerrel
8. Fehérje-ligandum kölcsönhatások
8.1. Biomolekulák kölcsönhatásai
8.2. Reakciókinetika
8.3. A fehérje-ligandum kölcsönhatás
8.4. Összefüggés a szabadentalpia-változás és az egyensúlyi állandó között
8.5. A ligandumkötést stabilizáló erők
8.6. A kötési állandó meghatározása
8.7. Módszerek a kötési állandó kísérleti meghatározására
8.7.1. A felszíni plazmon rezonancia
8.7.2. Az izotermális titráló kalorimetria (ITC)
8.7.3. Fehérje-ligandum kötés mérése fluoreszcencia depolarizáció módszerével
8.8. Ellenőrző kérdések, feladatok
9. Enzimkinetika
9.1 Az enzimkatalízis termodinamikai értelmezése
9.2. A Michaelis-Menten kinetika
9.3. A kezdeti sebesség értékek és a fő kinetikai paraméterek meghatározása
9.4. Enzimgátlási típusok
9.4.1. Kompetitív gátlás
9.4.2. Unkompetitív gátlás
9.4.3. Vegyes típusú gátlás
10. Géntechnológia
10.1. Rekombináns DNS technikák (géntechnológia) és molekuláris klónozás
10.2. Plazmid vektorok
10.3. Rekombináns DNS-konstrukciók elkészítése
10.4. A rekombináns DNS sejtbe juttatása és a rekombináns kolóniák azonosítása
10.5. Plazmid DNS izolálása
10.6. Plazmid DNS analízise agaróz gélelektroforézissel
10.7. Polimeráz láncreakció (PCR)
10.8. Irányított in vitro mutagenezis
10.9. DNS-szekvenálás
11. Bioinformatika
11.1. Bevezetés
11.2. Szekvencia és térszerkezeti adatbázisok
11.2.1. Genbank
11.2.2. UniProt
11.2.3. Protein Data Bank (PDB)
11.3. Bevezetés a szekvenciák bioinformatikai analízisébe
11.3.1. Bioinformatikai feladatok a molekuláris klónozás során
11.3.2. Hasonlóságvizsgálat és szekvencia-illesztés
11.3.3. Fehérjeszekvenciák analízise
11.4. Fehérjék térszerkezetének molekuláris grafikai ábrázolása
11.4.1. RasMol
11.4.2. PyMOL
11.4.3. Jmol
12. Számolási és problémamegoldó feladatok
12.1. Megoldások
13. Utószó
Irodalomjegyzék