1.3. A protiszták helye az élővilágban – Filogenetikai áttekintés

1.3.1. Az eukarióták filogéniája – Kládok és szupercsoportok

Az ezredforduló után nem sokkal több kutatóműhely publikálta egymástól függetlenül az eukarióták leszármazási viszonyait bemutató sokgénes molekuláris filogenetikai vizsgálatainak eredményét. Ezekből napjainkra kirajzolódott az a hét nagy eukarióta klád, amelyhez a legtöbb protiszta és a többsejtű eukarióták tartoznak. A multigén-szekvenálásos projektek eredményeként a következő nagy kládokat tekinthetjük létező monofiletikus csoportoknak: Opisthokonta, Amoebozoa, Archaeplastida, RAS (Rhizaria + Alveolata + Stramenopila) és Excavata. Szinte valamennyi ma ismert és vizsgált eukariótát el lehet helyezni e csoportok valamelyikében, a bizonytalan leszármazású csoportok helyét pedig intenzíven kutatják. Néhány újabban megismert élőlény – mint például a baktérium méretű pikoeukarióták egyik csoportja – egyben új kláddal is gyarapította az eukarióták világát. A 2010-es években mind több a valóban közös leszármazású csoportokat magában foglaló klád, míg néhányról, mint a sokáig „bombabiztosnak” tartott Chromalveolata, kiderült, hogy parafiletikus. Ha összehasonlítjuk az eukarióta filogéniáról a jelenlegi képünket a tíz-tizenöt évvel ezelőttivel, akkor látható, hogy a rokonság nélkül, magukban álló kládok száma egyre csökken és végső soron 7 nagy klád, ú.n. szupercsoport lefedi az eukarióta élővilág egészét.

Az Opisthokonta klád

Az Opisthokonta klád az állatoknak (Metazoa vagy Animalia), néhány kisebb egysejtű csoportnak (Choanozoa, Ichthyosporea, Filasterea, Nucleariida) és a gombáknak (Fungi) ad otthont. A Nucleariida és a Fungi közös leszármazási útvonalon vannak (Holomycota). A többi Opisthokonta a Holozoa kládot alkotja. Névadó tulajdonságuk az opisztokont ostor.

Az állatok (Metazoa) testvércsoportja a galléros-ostorosok (Choanozoa), amely két kis csoport (Capsaspora és Ministeria) kládjával áll testvércsoport viszonyban, ez a Filozoa klád. A Filozoa és az Ichthyosporea testvércsoportok a Holozoa klád.

A legújabb, robusztus, genomok vizsgálatán alapuló filogenomikai elemzés eredménye az eukarióta törzsfa első elágazását az Opisthokonta és valamennyi további szupercsoport közé helyezi el (Katz és mtsai 2012).

Az Amoebozoa klád

Zömmel lebenyes állábat képező amöboid szervezetek tartoznak ide. A plazmódiumot képző valódi nyálkagombák, a mitoszómás, néhol ostoros Archamoeba csoport (Entamoebida és Pelbiontida), valamint a mitokondriummal rendelkező csupasz és házas amőbák tartoznak ide.

Egyes kutatók az Opisthokonta és Amoebozoa kládokat az ú.n. Unikonta kládot alkotó testvércsoportoknak tartják (pl. Berney és Pawlowski 2006). Az Unikonta az elsődlegesen egyostoros karakterállapotú egysejtűek kládja, ahol előfordulhat, de nem jelenik meg feltétlenül az ostor. A legújabb filogenetikai elemzések azonban nem igazolják ezt a hipotézist (Parfrey és mtsai 2011). Az Opisthokonta és Amoebozoa kládokat ezért önállóan érdemes bemutatni.

Az Archaeplastida klád

Az Archaeplastida az első olyan klád, ahol az eukariótáknál a fotoszintézis megjelent. A növények (Plantae vagy Chromobiota) mellett a zöldalgák (Chlorophyta), a Prasinophyceae algák, a vörösmoszatok (Rhodophyceae) és a kékeszöld algák (Glaucophyta) csoportok ágaznak ki innen. Utóbbival mutat rokonságot két korábban Hacrobia-nak tartott algacsoport: a fotoszintetizáló Cryptomonadea és a színtelen Katablepharida.

A RAS klád

A RAS klád a Rhizaria, Alveolata és Stramenopila kládokat foglalja magában.

Úgy tűnik, a RAS klád és az Archaeplastida között szorosabb a kapcsolat mint a többi kláddal, bár azt, hogy testvércsoportok lennének, nem lehet kijelenteni.

A Rhizaria klád

A Rhizaria ostoros és amöboid egysejtűek kládja, ahol az álláb rendszerint nem lebenyes. Az ostorok eredendően kétostoros (bikont) jelleget mutatnak. A Rhizaria egyik kládja a Retaria, amely a foraminiferákat és radioláriákat foglalja magában. A Cercozoa klád morfológiailag nagyon diverz, egyaránt vannak amöboid és ostoros képviselői. Ez volt az első olyan taxonómiai rangot kapott klád (törzs besorolással), amelyhez nem lehetett morfológiai apomorfiákat hozzárendelni.

Az érvénytelen Chromalveolata klád

A Chromalveolata klád az Alveolata kládot és a ma már érvénytelen, parafiletikus Chromista kládot foglalja magába. Ezáltal a Chromalveolata is parafiletikus, használata elvetendő. A Chromista-csoport a Cryptomonadea és Haptophyta algák különállása miatt bizonyult parafiletikusnak. Az utóbbi két algacsoport közös leszármazását feltételezve hozták létre a Hacrobia kládot (a név a két csoport kezdőbetűivel indul).

A Chromista nagyobb, monofiletikus része a Stramenopila, amely a Heterokonta algák és egy sor nem fotoszintetizáló protiszta monofiletikus csoportja. Az Alveolata klád a dinoflagelláták és rokonaik (Dinozoa) és a csúcsszerves spórások vagy spórás egysejtűek (Apicomplexa más néven Sporozoa) alkotta klád (Myzozoa vagy Miozoa), valamint a csillós egysejtűek (Ciliophora) kládjának az egysége.

A csoport két szupercsoportja, az Alveolata és a Stramenopila, valamint a Rhizaria közös leszármazását feltételezik, így jelenleg a Rhizaria+Alveolata+Stramenopila – RAS klád a protiszták legnagyobb kládja. A fenti filogenetikai rekonstrukció mutatja legjobban, mennyire mesterséges a protiszták algákra és állati egysejtűekre történő szétválasztása.

Az Alveolata klád

Az Alveolata kládban a Dinozoa és az Apicomplexa + Chromerida a Myzozoa (Miozoa) kládot alkotják. A testvércsoport Ciliophora-val együtt képezik az Alveolata kládot.

A Stramenopila klád

Az algológiában Heterokontophyceae néven foglalják össze az idetartozó fototróf protisztákat, de ebbe az igen heterogén csoportba heterotrófok és szaprotrófok, életmódjuk szerint szabadonélők és endobionták, paraziták is tartoznak.

A Hacrobia klád

Eredetileg a Haptophyta és Cryptomonadea algacsoportokat tartalmazó klád, amely tovább bővült különböző, korábban bizonytalan helyzetű heterotróf ostoros csoportokkal. A legújabb eredmények szerint a két „alapító tag” mégsem közös eredetű: a Cryptomonadea (a heterotróf Katablepharida ostorosokkal együtt) az Archaeplastida szupercsoportba tartozik, míg a Hacrobia maradék része a RAS klád testvércsoportja. A Hacrobia nyújt otthont a sokáig feltáratlan filogéniájú Centrohelida napállatkáknak és a Telonema ostorosnak, valamint a mészmoszatoknak (Haptophyta) (Burki és mtsai 2012).

Az Excavata klád

Az Excavata klád mitokondriumot tartalmazó tagjai a Discicristata klád (Heterolobosa és Euglenozoa) és egy kisfajszámú ostoros csoport, a Jakobida ostorosok (együtt: Discoba klád). A mitokondrium nélküli csoport tagjai erősen levezetett, a sejt szerkezetét tekintve leegyszerűsödött élőlények, amelyeknél az aerob mitokondrium helyett hidrogenoszómát és mitoszómát találni (Metamonada). Nagy részük parazita, de anoxikus üledékekben is előfordulnak.

Napfogyatkozás”

Az egysejtűek laikusok számára is ismert csoportját, a napállatkákat (Heliozoa) hiába keressük az új törzsfákon. A taxonómiában törzsnek számító csoport konvergens fejlődést mutató, ám filogenetikailag egymástól igen távol álló monofilumokból áll, amelyek közül az Actinophryda a Stramenopila közé, a Desmothoracida a Cercozoa-ba, a Centrohelida a Hacrobia kládba tartozik, a Taxopodida pedig a radioláriák egyik csoportja.

A nagyobb kládokat tehát jórészt már ismerjük, de az utolsó közös eukarióta ősből történő leszármazás folyamatának rekonstrukciója még sok bizonytalanságot hordoz, azaz, a kládok közötti rokonsági viszonyok megismerése még távolról sem zárult le. Számos technikai akadály nehezíti ma is egyes csoportok vizsgálatát. Néhány protiszta csoportban, például a radioláriáknál a tenyésztés még mindig megoldhatatlannak tűnik, ezért a szekvenciák előállítása sejtenként történik (single cell PCR), amelynek módszerét minden fajra külön finomítani kell. A kísérleti anyag beszerzése viszont nehéz, mert a fajok többsége a nyílt óceáni területeken nagy mélységben él.

A protiszták valamennyi kládban megtalálhatók, ahogyan a soksejtű szerveződés formái is jelen vannak – a Rhizaria és Excavata kivételével – mindenhol. Az állatok és gombák (Opisthokonta klád), valamint a növények (Archaeplastida klád) mellett a nyálkagombák (Amoebozoa) a vörösmoszatok (Archaeplastida klád), a barnamoszatok (Stramenopila klád) valamennyien komplex, többsejtű szervezeteket hozhatnak létre. A kládokból kibontakozó összkép ismeretében az eukarióták fototróf vs. heterotróf, vagy egysejtű vs. többsejtű csoportokra történő tagolása mesterséges és értelmetlen.

1.3.2. A molekuláris vonalkód alkalmazásának első eredményei a protisztáknál

A protiszták DNS alapon történő azonosítására szolgáló módszer a molekuláris vonalkódolás (barcoding). Olyan, viszonylag rövid DNS szakasz alkalmas erre a célra amely a fajok között eltérő, de fajon belül nem változékony. A citokróm C oxidáz 1. alegysége (cox1) hétszáznál is kevesebb bázispárból áll és az egysejtűeknél barcoding céljára a legtöbbet használt molekula.

Az egysejtű barcoding 2007-ben kezdődött a cox1 Tetrahymena fajok azonosítását célzó vizsgálatával. A fajok között a cox1-ben 11 százaléknyi eltérést tapasztaltak, míg a különböző fajok izolátumai között csupán 0,65%-nál is kevesebbet. A Tetrahymena pyriformis és T. tropicalis fajoknál azonban kiugróan magas, 5–10% körüli különbségek adódtak és az egyesített törzsfákon is távolabb helyezkedtek el a többi Tetrahyamena fajtól. A barcoding vizsgálat ebben az esetben rejtett fajok jelenlétét mutatta ki, amelyek morfológiai alapon nem különböztethetők meg. Az elemzésből az utóbbiakat kizárva a fajok közötti eltérés százalékos értéke, valamint a fajon belüli százalékos eltérések átlagértéke között már egy nagyságrendnyi különbség van, csakúgy, mint az állatoknál (Chantangsi és mtsai 2007).

A nagyfajszámú protiszta csoportoknál az általánosan használt cox1 mellett más gén esetleg még előnyösebb lehet. A foraminiferáknál a riboszóma kis alegység RNS (SSU RNS) génjének egyik hipervariábilis régióját, egy mindössze 37 bázisnyi szakaszt használtak vonalkódként, ez majdnem a huszadrésze a teljes cox1 szakasznak, így ez a választás nemcsak specifikusabb (már elegendő a faji szintű különbségek megállapítására), de költséghatékonyabb is. A fenti esetben egy óceáni abisszális síkságról származó üledékminta metagenomikai feldolgozása során az üledékből kinyert DNS-t barcoding vizsgálatnak alávetve kiderült, hogy az az óceáni üledékben a várthoz képest az egykamrás (monotalamikus) foraminiferák vannak többségben a sokkamrás fajokhoz képest. A klasszikus taxonómiai vagy mikropaleontológiai vizsgálatok eddig éppen az ellenkezőjét sugallták (Lecroq és mtsai 2011).

A tengeri dinoflagelláták tenyésztett fajainak 70%-ánál hatékony volt a cox1 vonalkódolás. Három különböző térségből származó óceáni minta környezeti barcoding vizsgálatnál a dinoflagelláták túlnyomó része nem volt azonos a valaha is kitenyésztett, leírt fajokkal. A módszer tehát jól működik és használata rávilágított arra, hogy a kutatók eddig messze alábecsülték a csoport biodiverzitását (Stern és mtsai 2010).

1.3.3. A horizontális géntranszfer jelentősége a mikroeukarióták filogenezisében

A genomszintű vizsgálatok a protiszta filogenetikában is számos, korábban érthetetlen kérdés tisztázásához járultak hozzá. A filogenomika olyan átütő erejű felfedezéseket hozott az eukarióták ismeretében, amik gyökeresen megváltoztathatják az eukarióta evolúció menetéről alkotott ismereteket.

A genomszintű filogenetikai elemzésekből derült ki, hogy számos távoli kládon kialakult mikroeukarióta jelentős számú metabolikus gént „szerzett” prokariótáktól. Az első információk alapján úgy tűnik, hogy a horizontális géntranszfer (más szóhasználattal laterális géntranszfer) főleg a mikroeukariótáknál jelentős tényező, bár a többsejtű élőlényekben is előfordul. A legtöbb esetben eddig prokariótából eukariótába irányuló géntranszfert azonosítottak. Ehhez az állapothoz az az előfeltevés is hozzájárult, hogy döntően ezirányban képzelték el a folyamatot. A napjainkra azonosított nagyszámú eukarióta-eukarióta transzfer miatt ez a nézet túlhaladottá vált. Az eukarióta egysejtűek között zajló horizontális géntranszfer nem egyedi, hanem jellemző folyamatnak tekinthető. Egyik speciális megvalósulása az endoszimbionta géntranszfer, amikor egy gén például a másodlagos vagy harmadlagos szimbiogenezissel létrejött plasztisz sejtmagjából kerül át a gazdasejt magjába. Az endoszimbionta géntranszfer másik kiváló példája domének között valósult meg: a primer szimbiogenezis során a plasztisszá és mitokondriummá alakuló prokariótákból az eukarióta sejtmagba került át a szimbionta genomjának nagy része. Bár az endoszimbionta géntranszfer kétirányú volt, a sejtmag felé irányuló folyamat dominált.

Az eukarióta gének evolúciójával kapcsolatban általánosan elterjedt az a feltételezés, hogy a legalapvetőbb sejtszerkezeti vagy életműködést biztosító ú.n. „core” gének ritkán vesznek részt géntranszferben. Például a transzláció egyik kulcsfontosságú fehérjéje, az 1-alfa elongációs faktor (EF-1α) génje néhány eukarióta leszármazási vonalból hiányzik. Ezeknél az élőlényeknél azonosítottak egy elongációs faktor-szerű fehérjét (EFL), amelyről bebizonyosodott, hogy ugyanazt a feladatot látja el mint EF-1α. Az EFL különféle eukariótákban került elő, de az EF-1α valamennyiüknél következetesen hiányzott. Ezt a jelenséget többszöri eukarióta-eukarióta géntranszfernek tulajdonítják. Az evolúció során a két gén szimultán meglétét követően az eredeti EF-1α eltűnt.

A filogenetikai vizsgálatokra használni szándékozott gének némelyikéről a törzsfák árulták el, hogy géntranszferrel került át másik eukariótába. Az egyik legkonzervatívabbnak tartott fehérje a sejtváz egyik alkotója, az α-tubulin. Éppen konzervatív volta miatt számos filogenetikai vizsgálat kedvelt eszköze volt. Az α-tubulin gén alapján azonban egy Andalucia nevű ostoros a törzsfán a diplomonádok, a parabazálidák vagy az opisztokonták között csoportosult, holott az ultrastruktúrája alapján a megjelenését a jakobida ostorosok között várták volna a. Öt további gén alapján elkészített törzsfákon viszont az Andalucia mindig a hasonló sejtszerkezetet mutató jakobida ostorosok között jelent meg. A jelenség legvalószínűbb magyarázata az, hogy az Andalucia ősében a kládban jellemző tubulin molekula génje egy másik eukarióta kládban jellemző tubulingénre cserélődött. Tehát még a sejtváz konzervatívnak tartott molekulái sem mentesek a horizontális folyamatoktól. Mindkét példában a sejt alapvető működését szolgáló ortológ eukarióta gének cserélődtek ki.

Géntranszfer úgy is történhet, hogy a gén egy prokariótából először egy eukariótába kerül, majd onnan más eukariótákba. Például különböző tRNS szintetázok génjei egy ősbaktériumból jutottak át a parabazálidák és diplomonádok ősébe. Egyikük ezt követően a parabazálidából csillósokba és Entamoeba-ba került, két, egymástól független lépésben. Feltehetőleg igen korai eseményekről lehet szó, még azelőtt játszódhattak le, mielőtt a két utóbbi egysejtűnél megtörtént volna az életmódváltás és egy élőhelyen fordultak elő a szabadonélő csillósokkal. Az utóbbi típusú, először inter-domén, majd intra-domén jellegű géntranszfer nem megy ritkaságszámba a mikroeukarióták között. Példaképpen a szénhidrát-anyagcsere jól ismert génjei között hármat érdemes megemlíteni: a transzketoláz, a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz és a ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz génjei a törzsfákon mindig egyöntetűen a prokarióták között csoportosultak. Ahogy mind több eukarióta génszekvenciát vontak be ebbe a vizsgálatba kiderült, hogy nem csak inter-domén, hanem intra-domén átmenetek is történtek. A prokarióta gén változatait mindhárom génnél távoli eukarióta kládok képviselői is hordozták, az inter-domén átmenet során a génre először szert tevő eukarióta szervezet legközelebbi rokonai azonban nem.

A glikolízis folyamata valószínűleg létezett már az utolsó közös ősben, ezért úgy vélték, hogy a glikolízis enzimrendszere vertikálisan adódott át az eukarióta evolúció során. Különböző excavata egysejtűek glikolízis enzimeinek filogenetikai vizsgálata azonban egy erősen mozaikos rendszert tárt fel. Az enzimek egy része monofiletikus eukarióta csoportokat rajzolt ki, a vertikális átadásra utalva, de több enzimnél kiderült, hogy prokarióta eredetű, ugyanakkor a legkülönbözőbb rokonsági körbe tartozó mikroeukarióták között felbukkan. Ez a folyamat – mai ismereteink szerint -, csak horizontális géntranszfer útján történhetett. Az alapvető anyagcsere-gének mellett számos más gén is hasonló módon cserélt gazdát.

A géntranszfer az élőhelyhez történő adaptációt is elősegítette, mégpedig egy, a mikrobiális eukariótáknál kiemelten fontos életmódváltásnál, az aerob-anaerob átmenetnél. Több anaerob (mikroaerofil) protisztánál kiderült, hogy anaerob baktériumból származó géneket hordoz. Az anaerob excavata Trimastix pyriformis-ban mitoszómák találhatók, csakúgy mint az amoebozoa Entamoeba histolytica-ban. Az anaerob anyagcsere két kulcsfontosságú enzime, a piruvát-ferredoxin-oxidoreduktáz (PFO) és a vas-hidrogenáz génjei bevonásával készített törzsfákon a Trimastix pyriformis az Amoebozoa-ban az Entamoeba mellett jelent meg, horizontális átmenetre utalva a két csoport őseinél.

1.5. ábra. A horizontális géntranszfer főbb útvonalai. a) Interdomén géntranszfer b) Intradomén géntranszfer eukarióták között c) Endoszimbionta géntranszfer mitokondrium és sejtmag, ill. plasztisz és sejtmag között. n – nukleusz

1.5. ábra. A horizontális géntranszfer főbb útvonalai. a) Interdomén géntranszfer b) Intradomén géntranszfer eukarióták között c) Endoszimbionta géntranszfer mitokondrium és sejtmag, ill. plasztisz és sejtmag között. n – nukleusz

A géntranszfernél az adó és befogadó szervezet tisztázásakor a recipiens a donor rokonsági körébe ágyazódva jelenik meg a törzsfákon. Továbbá, a recipiens olyan monofiletikus csoport tagja, amelynek minden tagja hordozza a horizontális úton szerzett gént, a testvércsoport tagjai viszont nem. Hasonló helyzet nagy valószínűséggel nem fordul elő olyan fehérjegéneknél, amelyek más okból mutatnak foltos eloszlást az eukarióták között, az efféle topológiák kialakulását más evolúciós folyamatok idézhetik elő.

A megvizsgált taxonok számának növelésével az eredmények meggyőzőbbek lesznek, ezért az újonnan felfedezett eukarióta filotípusoknak igen nagy jelentőségük van. Ugyanakkor a taxonszám növelése hibás interpretációkhoz is vezethet: pédául intradomén átmenetnél kiderülhet, hogy két, független pro-eukarióta géntranszfer történt (Andersson 2009).