1.6. A módszertani fejlődés jelentősége a protisztológiai kutatásokban

1.6.1. A vizualizáció fontosabb mérföldkövei és a hozzájuk kapcsolódó eljárások

A tudományos célú mikroszkopizálás kezdete egyben a protisztológia kezdete is. A fénymikroszkópia fejlődése a késői 17., majd 18-19. század során végigkísérte a protisztológia kibontalkozását. Az objektív típusok, az immerziós objektívek, majd a megvilágítási eljárások, az Abbé-féle kondenzor kidolgozása, a lencsehibák kiküszöbölése jelentették a fejlődés első szakaszát. A 20. század második felében már a kutatómikroszkópokon általánossá vált a fáziskontraszt és a differenciál-interferencia kontraszt eljárások használata, vagy a technikailag egyszerűbben megoldható sötétlátóterű megvilágítás. Ezek alkalmazásával más és más módon váltak a protiszta-sejt részletei mind jobban megismerhetővé, plasztikusabbá.

A protiszta-sejt különböző alkotórészeit a 19. századtól festési eljárásokkal tették láthatóvá vagy kontrasztosabbá. A sejtbiológiában és szövettanban használt módszereket sikeresen adaptálták a protisztákra is. A 19. század vége felé kezdtek el fémsókat használni állati szövetek festésére. Az egyik legnevezetesebb eljárás az ezüstözés, amit Camillo Golgi vezetett be a biológiába az idegszövet tanulmányozására, elsőként téve láthatóvá az egyedi idegsejtet az idegszöveten belül. A módszer lényege az ezüstnitráttal impregnált rögzített készítményben az ezüst redukálása. A redukálódó, fekete szemcsék formájában kiváló ezüst még ma sem tisztázott okokból jól kötődik a membránstruktúrákhoz. A protisztológiában az ezüstözési eljárások a bonyolult membránstruktúrák, ostorok, csillók szinciliumok és rostrendszereik láthatóvá tételénél ma is döntő fontosságúak. Apáthy István Golgival és Ramon y Cajallal egyidejűleg Magyarországon végzett alapvető fontosságú vizsgálatokat, amelyek során korszakos jelentőségű mikrotechnikai újításokat vezetett be az állati szövetek rögzítése, beágyazása és impregnálása terén. Szublimát (HgCl2) és ozmium keverékével végzett rögzítést, arannyal és ezüstnitráttal impregnált szöveteket. Módszerei fokozatosan átkerültek a protisztológiába is. Tanítványa, a világhírű magyar ciliatológus Gelei József[6] csillósokra alkalmazta és továbbfejlesztette mestere mikrotechnikai újításait. A csillós egysejtűek preparálásánál ozmium-toluidinkéket alkalmazott, amelynek révén 1925-ben kimutatta a csillósok fémsókkal impregnálható, az alapi testeket összekötő rosthálózatát, amelyet ezüstvonalrendszernek neveznek. Ozmiumos festéssel tette elsőként láthatóvá a lüktető űröcskét körülvevő citoplazmarészt, amelyet Gelei elnevezése nyomán ma is spongiomának neveznek. Nevéhez kötődik az ezüstnitráttal történő ú.n. Gelei-Horváth-félenedves ezüstözés eljárásának kidolgozása a csillósok ezüstvonalrendszerének impregnálására (Gelei és Horváth 1931). Az ezüstvonalrendszer felfedezése a leíró ciliatológia egyik legnagyobb előrelépését jelentette. Egészen az 1950-es évek végéig a rostrendszert az állati idegrendszer analógiájára egyfajta sejtszintű, a csillómozgást koordináló szerkezetnek gondolták és kiemelkedő jelentőséget tulajdonítottak neki az ingerületvezetésben. Ma már tudjuk, éppen Gelei tanítványa, Párducz Béla[7] munkássága nyomán, hogy az ingerületvezetéshez nincs köze (Párducz 1958), de a morfológiai vizsgálatoknála csillós kortex egyik meghatározó szerkezeti elemeként és a csillósok egyik legfontosabb apomorf bélyegeként ma is nagy jelentősége van. A csillós fajleírásoknál nélkülözhetetlen a csillózat és az alapi testeket összekötő rosthálózat bemutatása – a vizsgálatot ma is ezüstimpregnációval végzik. Nem csak csillósoknál, hanem ostorosoknál és opalinátáknál is használnak ezüstözést. Ma többféle eljárás használatos, legelterjedtebb az ezüstkarbonátos, vagy a protargolimpregnáció: utóbbi az ezüst és albumin komplexe. A protisztológiában az ezüstimpregnáció mellett számos más festést is használnak. A spórás egysejtűeknél vagy a vérben élő ú.n. haemoflagellátáknál a Giemsa-festést alkalmazzák széles körben. Az algáknál a Lugol-oldattal történő színezés a sejtszámlálást megkönnyítő egyik klasszikus módszer.

A sejt ultrastruktúrájának, organellum-szintű vizsgálatának lehetőségét az elektronmikroszkóp teremtette meg az 1950-es évektől. A mitokondrium és a plasztiszok membránjai transzmissziós elektronmikroszkóppal (TEM) váltak először láthatóvá és így ez az eszköz is hozzájárult az endoszimbionta elmélet kulcsfontosságú eseményeinek a bizonyításához, és a protiszták sejtszerveződésének a megismeréséhez. A korábban csak magfestékkel láthatóvá tett, ismeretlen funkciójú részletek természetére is így derült fény: például a Trypanosomatidák és rokonaik kinetoplasztjáról az elektronmikroszkópos vizsgálat mutatta ki, hogy ezernyi cirkuláris kromoszóma alkotja. A mitoszómát elektronmikroszkópos felvételek tanulmányozása során fedezték fel.

A pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) segítségével az egysejtűek háromdimenziós, valósághű képeit lehet tanulmányozni a fénymikroszkópét nagyságrendekkel meghaladó nagyításban és felbontásban. A csillósoknál és ostorosoknál számos részlet, például az ostor felülete, a csillók és szinciliumok elrendeződése és más részletgazdag struktúrák, mint a foraminifera- vagy radiolária-vázak is így tanulmányozhatók a legjobban.

A korábbiakhoz képest a fluoreszcens-mikroszkópia teljesen új vizsgálati lehetőségeket biztosított. E módszerrel vált először lehetővé a legkisebb eukarióta egysejtűek megbízható denzitásbecslése, továbbá különböző molekuláris jelölések in situ láthatóvá tétele (pl. molekulák vagy organellumok szelektív jelölése, vagy a fluoreszcens in situ hibridizáció: FISH). A legújabb-generációs mikroszkópok (például a konfokális lézermikroszkóp) már az UV hullámhossz-tartományban, lézermegvilágítással működnek. Így jobb a felbontásuk és a sejt ultrastruktúrájának a korábbinál behatóbb fénymikroszkópos vizsgálatát teszik lehetővé, az elektronmikroszkóphoz képest jóval kisebb anyag- és időráfordítással. A modern mikroszkópoknál a fényforrás minőségétől függetlenül lehetséges a tárgymagasság automatikus szabályozása, így a vizsgált objektumról akár mikrométerenként haladva, azt “szeletelve”, az egymás utáni látótérek képét digitálisan rögzítve végül egy teljes 3D-s rekonstrukciót kapunk, ami számítógépen rétegenként is eltárolható. Ez az ú.n. optikai szeletelés, amelynél kulcsfontosságú, hogy minden képen csak az adott síkban levő részletek legyenek láthatók. Ennek hátterében az áll, hogy csak az adott síkban lévő molekulákat gerjeszti a lézer. A képsorozatok képanalizáló programokkal feldolgozhatók, lehetővé téve a sejten belül látható struktúrák pontos térbeli orientációjának megismerését, a jelölések pontos helyének, számának a megállapítását.

1.6.2. A protiszta sejt kísérletes vizsgálata – mikroszkóp nélkül

A protisztákkal végzett fiziológiai, sejtbiológiai és biokémiai vizsgálati módszerek megegyeznek az állatok és növények laboratóriumi kutatásánál használatosakkal. A módszerek sokféleségét e könyvben nem tárgyaljuk, mégis fontos kiemelni a jelentőségüket nem csupán alapkutatási, hanem diagnosztikai szempontból is. Például az immuncitokémiai módszerek a patogének azonosításánál lehetnek nélkülözhetetlenek. A DNS-szintű vizsgálatok elterjedését megelőzően a kórokozók azonosításánál az immunelektroforetikus módszerek voltak a legelterjedtebbek. A labordiagnosztikában a rutinszerűen használt ELISA-tesztek lassan háttérbe szorultak a géntechnológián alapuló vizsgálatok előretörése miatt. A patogénnel való fertőzöttség kimutatásában a terepen történő in situ vérvizsgálatokra fejlesztett immunteszteknek viszont növekvő gyakorlati jelentősége van.

1.6.3. A molekuláris genetika metodológiájának jelentősége a protisztológiában

Mint minden élőlény, úgy az egysejtűek tulajdonságait is alapvetően az örökítőanyag (DNS) határozza meg. A DNS kinyerhető a sejtből, felszaporítható, a vizsgált DNS-szakaszt alkotó építőegységek, nukleotidok sorrendje pedig meghatározható. A DNS nukleotidsorrendje fajonként eltérő, ezért a DNS alkalmas a fajok rokonsági viszonyainak és tágabb értelemben a leszármazási viszonyok (filogenezis) vizsgálatára. Az eukarióták körében a filogenetikai rekonstrukcióra legelterjedtebben használt gén a 18S rRNS gén, amely a nagyobb csoportok (rend és afölötti taxonómiai szinteknek megfelelő egységek) osztályozására alkalmas. Mellette a további rRNS, valamint az aktin- és a tubulin-gének is használatosak. A protiszta-filogenetika legfontosabb módszertani alapját tehát a DNS-szekvenvcia megállapításának módszertana jelenti. A rekombináns DNS-technológia megjelenésével útjára indult a molekuláris genetika, amely új korszakot nyitott a protisztológiában. A polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazása és az automatizált nukleinsav-szekvenálás kifejlesztése az1990-es évekre lehetővé tették, hogy hatalmas mennyiségű nukleotidszekvenciát állítsanak elő viszonylag egyszerű és megbízható, reprodukálható eredményt adó eljárással.

1.6.4. Genomika

A genomika a teljes genom vizsgálatával foglalkozó tudományterület. 1995-ben elkészült az első teljes genomszekvencia, egy baktériumé (Haemophilus influenzae baktérium 1,8 Mb), majd az első eukariótáé (sörélesztő, Saccharomyces cerevisiae) is. 2000-ben a tudományos és a népszerüsítő sajtó híradásai által kísérve indult útjára a Humán Genom Program, melynek keretében különböző eukarióta modellszervezetek vizsgálata is megkezdődött. Ezt követően természetesen a patogén szervezetekre irányult a legtöbb figyelem. 2004-re már körülbelül 60 eukarióta-genom vált ismertté, a protisztákat ekkor már tíz, csúcsszerves spórás képviselte. A genomika számos hasznos felfedezéssel kecsegtetett, egy adott faj teljes genetikai információjának a megismerésén túl például új gének, anyagcsereutak feltárásával és a genom evolúciójának beható megismerésével. 2012-re már minden jelentős parazita protiszta és egysejtű kísérleti modellszervezet genomszekvenciája elkészült. A genomika fontos hozadéka, hogy számos eddig nem ismert gén, géncsalád kerül a kutatók látóterébe. Például genomvizsgálat során fedeztek fel egysejtűekben több új tubulingén- és más motorfehérje-családot is. A kórokozóknál a felfedezett új gének termékei gyógyszerhatóanyag-célpontok lehetnek.

1.6.5. Filogenomika

A genomok filogenetikai elemzésével foglalkozó új résztudomány-terület, a filogenomika. A filogenomika alig egy évtizedes tudománya a protisztáknál szenzációsan új eredményeket hozott. Nagy mértékben hozzájárult a protiszta-filogénia tisztázásához is. Az 1990-es évek elejétől az évtized végéig néhány évente néha zűrzavarosnak ható, egymásnak homlokegyenest ellentmondó filogenetikai interpretációk születtek, részben a csekély számú szekvencia, részben a korai, kevésbé fejlett bioinformatikai eszköztár miatt. A filogenomika és a bioinformatika párhuzamos kifejlődésével a protiszták (és általában az eukarióták) filogéniájáról való ismereteink mára biztos alapokra helyeződtek.. Míg korábban egy, vagy néhány gén vizsgálatán alapultak az eredmények, ma a genomszekvenciák birtokában nagyszámú gén vonható be a filogenetikai elemzésekbe, növelve az eredmények robusztusságát.

1.6.6. Metagenomika

A metagenomika a környezeti minták összes DNS-tartalmának elemzésével foglalkozó résztudomány-terület, amely nem igényli az egyes élőlények izolálását, tenyésztését. Mind a gyakorlati, mind az elméleti kutatásoknál létező igény egy környezeti minta teljes protiszta-biótájának megismerése. Egy víz- vagy talajmintából valamennyi egysejtű-faj kinyerése, majd kitenyésztése komoly idő- és anyagi ráfordítást jelent és nem is ad tökéletes eredményt. Nem minden fajt sikerül izolálni és ráadásul a fajok nagy többségének a tenyészfeltételei ismeretlenek. Ezért közvetlenül a talaj-, ill. vízmintából kinyert DNS-t vetik alá az ú.n. metagenom-vizsgálatnak. Az elkészült genomok bioinformatikai elemzésével történik az egysejtűek azonosítása, mindenfajta morfológiai vizsgálat nélkül. Ez a megközelítés ugyan számos új filotípus megismerését eredményezte, de a protisztológusok szerint egy faj definiálása nem nélkülözheti a morfológiai leírást. Tehát a molekuláris filogenetika önmagában nem alkalmas a fajok meghatározására.

Jelenleg például az óceánok vizét vizsgáló metagenomikai projekt célja a feltárt genomok filogenetikai elemzésén keresztül a földi biodiverzitás még rejtőző hányadának megismerése. A munkafolyamat máris számos új filotípus felfedezését eredményezte, főként a gombák, az alveoláták és a dinozoák között.

A közösségi szintű vizsgálatok rámutattak, hogy ebben a módszertani megközelítésben is lehetnek hibák. A polimeráz-láncreakciót (PCR) követő hagyományos génszekvenálás során előállított környezeti génkönyvtárak torz képet adhatnak a valóságról, ponosabban az egysejtű-csoportok mintán belüli gyakorisági eloszlásáról. Az igen kisméretű eukarióták, a tengeri piko-eukarióta közösségek rRNS génszekvencia-vizsgálata során készített környezeti génkönyvtárak több, egymástól független esetben az epifluoreszcens mikroszkópia segítségével végzett sejtszámlálás eredményéhez képest eltérő eredményt adtak a heterotróf–autotróf egysejtűek arányait illetően. A hiba oka a hagyományos szekvenálásig elvezető többlépcsős munkafolyamat. Ezzel szemben a metagenom-vizsgálatoknál nincs szükség a kijelölt génszakaszok felszaporítására, helyette a DNS direkt klónozása és új generációs módszerekkel való, közvetlen szekvenálása történik. Egy másik módszerrel magát a 18S riboszomális RNS-t vizsgálják közvetlenül, nem pedig annak génjét. E két módszer mentesít a PCR-ben és a hozzá kapcsolódó folyamatokban (pl. primerek tervezése) rejlő hibalehetőségektől. (Not 2009).

1.6.7. A bioinformatika jelentősége

A DNS vagy aminosav szekvenciák hossza miatt az adatok kezelése kizárólag számítógéppel lehetséges. A bioinformatika tudományterületének fejlődése fej-fej mellett halad a DNS technológiai újításokkal. E tankönyvben a bioinformatika alapjait nem ismertetjük, de azt mindenképpen hangsúlyozni kell, hogy az eukarióta filogénia vizsgálatának elmúlt húsz éve során a bioinformatika eszköztára nagyon sokat változott és ez meghatározta a kapott filogenetikai eredmények helytállóságát.

A korábbi elemzéseknél a kutatók nem voltak tekintettel arra, hogy az egyes gének evolúciója eltérő sebességű lehet. A gyorsan evolváló gének vagy génszakaszok az elemzésben élesen elváltak a többi csoporttól, és gyakran a törzsfa gyökereztetésére szolgáló külcsoport (outgroup) közelében helyezkedtek el. Ez a “long-branch attraction” okozta sok korai elemzés hibáját, amely azután félrevezető filogenetikai értelmezéshez is vezetett (ld. alább). A mai elemzéseknél a lassan evolváló génszakaszokat használják. A régen uralkodó egygénes (SSU rRNS gén) törzsfákkal szemben ma több gént vonnak be a vizsgálatokba (multigén-eljárások).

Az eukarióta filogenezis vizsgálatának történetében a legismertebb példa a hibás metodika következtében félreértelmezett eredményekre az Archezoa-hipotézis volt. Az Archezoa-elmélet szerint a törzsfa alapjánál elhelyezkedő, tehát legősibb eukarióták még a mitokondriumhoz vezető szimbiogenezist megelőző időszakban alakultak ki, így elsődlegesen anaerob eukarióta szervezetek lennének. Az 1990-es évek elején központi jelentőségre szert tett Archezoa-hipotézis egyik fő pillérének a törzsfaelemzés eredménye számított, míg másiknak az érintett egysejtűeknél a mitokondrium elsődlegesnek vélt hiánya volt. A következő anaerob egysejtűeket sorolták az Archezoa csoportba: Metamonada, Parabasalia, Archamoebae és Microsporidia. Azt a jellegzetes törzsfa topológiát, amelyben az anaerob egysejtűek egymás mellett helyezkedtek el, már a korabeli tudományos közvélemény is némi kétkedéssel fogadta, de mivel további génekkel végzett vizsgálatok is hasonló elrendezést adtak, a hipotézis erősödni látszott. A törzsfakészítő eljárások fejlődésével a “long-branch attraction” elkerülhetővé vált, és kiderült, hogy az Archezoa csoportjainak az elhelyezkedése is ennek a hibának a következtében jött létre. Időközben gyarapodtak a bizonyítékok amellett, hogy az Archezoa egysejtűek sejtmagjában is vannak mitokondrium-eredetű gének. Az Archezoa-hipotézis a mitokondriális eredetű hsp70 hősokkfehérje génjének a nukleáris DNS-ben történt kimutatásával kapta meg a kegyelemdöfést, hiszen a vizsgálat igazolta, hogy egy Archezoa egysejtűben jelen volt a mitokondrium (I_Keeling1998).

A szekvenciaadatok nyilvános, online hozzáférésű adatbázisokban tárolhatók (pl. GenBank). Filogenetikai vizsgálatokhoz az összehasonlító szekvencia adatokat a kutatók ezekből töltik le. A protiszta filogenetika fejlődése már az adatbázisokban tárolt szekvenciaadatok mennyiségének drasztikus növekedéséből is kiolvasható.

1.6.8. A molekuláris óra

A mikropaleontológiai leletek soha nem adhatnak olyan átfogó képet a protiszták fejlődéstörténetéről, hogy valamennyi csoport leszármazását rekonstruálni lehetne. Bioinformatikai módszerekkel, ú.n. molekuláris órák segítségével azonban hozzárendelhető a törzsfa elágazási pontjaihoz az elválás időpontja. A DNS- vagy aminosav-szekvenciák sorrendjében levő különbségek megfeleltethetők az evolúció sebességével. DNS esetében a kalibrálás során a vizsgált gén homológjaiban a bázissorrend százalékos különbségét vonatkoztatják egy adott intervallumra (például 0,1% / egymillió év). Olyan szekvenciák alkalmasak molekuláris órának, ahol a bázisok kicserélődésének (szubsztitúciójának) a rátája egyenletes az idő folyamán, vagyis az evolúciós változás üteme nem változik. Két protiszta csoport elválása a közös őstől millió évben megadható a következő módon: a kiválasztott homológ gének bázissorrendjében tapasztalt százalékos különbség és a molekuláris óra (egymillió évre vonatkoztatott) szubsztitúciós rátájának hányadosának 50%-a. Számos leküzdendő akadály hátráltatja a szétválások rekonstrukcióját. Az evolúció sebessége a valóságban nem egyenletes, és az órának megfelelő gének kiválasztása sok körültekintést igényel, továbbá a kalibrációt jelentősen nehezíti a megfelelő egysejtű-mikrofosszíliák hiánya. Ha van is ősmaradvány, az akkor sem az adott vonal legősibb képviselője, az ősmaradvány kormeghatározása nem mindig helytálló, és az adott lelet taxonómiai azonosítása esetleg hibás. A kalibrációra azok a protiszták alkalmasak, amelyekről a lehető legtávolabbi múltra visszamenően rendelkezünk ősmaradványokkal, és amelyek képviselői folyamatosan jelen vannak a különböző korú üledékrétegekben (Parfrey és mtsai 2011).



[6] Gelei József (1885-1952): protisztológus, zoológus, egyetemi tanár Kolozsváron, majd Szegeden. Iskolateremtő egyéniség, a protisztológiában elsősorban csillósokon végzett morfológiai és taxonómiai vizsgálatai kiemelkedő jelentőségűek, de sejttani vizsgálatai a meiózis folyamatának megértését is elősegítették. Behatóan tanulmányozta a planáriák regenerációs képességét. A protisztológia nemzetközileg elismert hazai művelője. Neves protisztológus tanítványai közé tartozott Párducz Béla, Kormos József, Stiller Jolán, Gellért József.

[7] Párducz Béla (1911-1964): protisztológus, Gelei József tanítványa. Elsősorban a sejtfiziológiai témák foglalkoztatták. Gyorsrögzítő eljárásának köszönhetően új irányt szabott a csillós egysejtűek mozgásának kutatásában, tisztázta az izolált csilló és a kinéta csillóinak mozgásmintáját, felismerte a metakronia jelentőségét és bizonyította, hogy az ezüstvonalrendszer nem vesz részt a sejt ingerületi folyamataiban.