3.3. Az anyagcsere molekuláris biológiai szinten – Protiszta sajátosságok

Légzés során az élőlény a környezetből származó terminális elektronakceptort használja. A protiszták lehetnek aerob vagy anaerob (mikroaerofil) szervezetek, aszerint, hogy légzésüknél használnak-e oxigént vagy sem. A természetes vizek felszínéhez közel legtöbbször aerob protiszták fordulnak elő. Azonban anaerob és mikroaerofil protiszták is élnek sokfelé. A sekélytavi üledékek, az óceánok és tengerek oxigén-minimum zónája, valamint a tengerfenék alzata olyan élőhelyek, ahol lényegében nincs az élőlények számára felvehető oldott oxigén. A szimbionták és paraziták számára a különböző állatok belső terei, szövetei, sejtjei szolgálnak élőhelyül és ezeken az élőhelyeken az oxigén rendszerint csekélyebb mennyiségben található, mint a felszíni vizekben. (Ez alól egyedül a gerincesek vére jelent kivételt.)

Anaerob légzésről akkor beszélünk, ha a terminális elektronakceptor nem oxigén. A prokariótákkal szemben az eukariótáknál környezetből felvett elektronakceptorok használatára csak kevés példa akad. Állatoknál az anaerob respiráció legjellemzőbb változata a fumarát légzés (bár a légzés-definíció kritériumának nem felel meg teljesen, mert a fumarátot maga a szervezet állítja elő, ugyanakkor protongradiens viszont keletkezik). Protisztáknál csak a nitrát felhasználásról vannak eddig szórványos adatok. Nitrátlégzésről a bentikus foraminiferáknál, valamint a rokon Gromiida csoportnál (Piña-Ochoa és mtsai 2010), egyes kovaalgák (Kamp és mtsai 2011), valamint a csillós egysejtűek (Loxodes fajok, Finlay és mtsai 1983) körében tudunk. Egy gomba, a Fusarium oxysporum elemi ként használ végső elektronakceptorként (Abe és mtsai 2007) és néhány gombánál szintén a nitrát felhasználása ismert. Egy további különbség a prokariótákkal szemben az, hogy az anaerob légző eukarióták általában időszakos alternatívaként használják az eltérő anyagcsereutat az oxigén elektronakceptorral működő normál terminális oxidáció mellett.

Az anaerob protiszták legtöbbje anaerob respiráció helyett fermentál. Fermentáció során az intermedier anyagcsere valamely terméke lesz a végső elektronakceptor. Az erjesztéskor szerves elektronakceptorként leggyakrabban használt szubsztrát molekulák a következők: piruvát (a végtermék tejsav vagy etanol), acetaldehid (végtermék etanol), fumarát (végtermék szukcinát), protonok (végtermék hidrogén), és acetil-koenzim A (zsírsavak és származékaik). A fermentáció során lehetséges olyan reakcióút is, ahol a szubsztrát egy redukáltabb és egy oxidáltabb alakja is felszabadul, például amikor glükózból etanol és széndioxid képződik. A fermentáció vagy kizárólag a citoplazmában játszódik, mint a Giardia és az Entamoeba fajoknál, vagy egy része a hidrogenoszómában történik (pl. a Trichomonadida-nál).

A fermentációhoz nem alapfeltétel az anaerob környezet. Például a tripanoszómák gerincesek vérében élő metaciklikus alakjai magas cukor- és oxigén-koncentráció mellett erjesztenek. ATP-t a fermentálás során szubsztrátszintű foszforilációval termelnek és a glikolízis végtermékét, a piruvátot nem redukálják tovább tejsavvá. A mitokondrium ekkor sokkal kisebb mint a rovar gazdában élő prociklikus alaknál, nem működik benne sem a citromsavciklus, sem a terminális oxidáció. A csökevényes mitokondriumban egyedül a redukált koenzimek oxidációja zajlik: egy alternatív oxidáz végső elektronakceptorként oxigént használ, oxidatív foszforiláció nélkül, miközben a NADH-t oxidálja. Az oxigén közreműködése miatt ezt a folyamatot aerob fermentációnak nevezik. Végtermékei között víz is szerepel, miközben az enzimrendszere az anaerob eukariótákéra jellemző.

Az anaerob fermentáló egysejtűeknél a mitokondrium belső membránjáról hiányoznak az elektrontranszportlánc összetevői. Ilyenek a mitoszómás Entamoebidae, a Giardia intestinalis vagy a hidrogenoszómás Trichomonadida. Nagyon kis mennyiségben elviselik az oxigént, sőt, végső elektronakceptorként fel is használják, tehát elhanyagolható mennyiségben ugyan, de az oxidációs folyamatok végén víz is keletkezik. Szaporodásukat azonban már kifejezetten gátolja az oxigén. A gátlás az oxigénszenzitív vas-kén klaszter tartalmú fehérjék károsodása miatt alakulhat ki, ilyen például a piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz enzim (PFO).

Az aerob élőhelyek mellett a természetben nagyon sokféle oxigénszegény környezet alakul ki, és ezeken az élőhelyeken jellemzően sok protiszta található. Az oxigén ugyan jelen van, de változó, rendszerint igen alacsony koncentrációban. Az itt élő protiszták alacsony oxigénszint mellett még életben maradnak: például 3–30 μM/l oxigén-tartalomnál ami a légköri oxigén tartalom 1–10 százalékának felel meg. Az alacsony oxigén koncentráció mellett szaporodni és növekedni tudó élőlényeket mikroaerofilnak nevezik. Némelyik szervezet alacsony oxigén tenzió mellett jobban növekszik mint oxigén mentes környezetben. Számos fermentáló protiszta él ilyen feltételek között. (Müller és mtsai 2012)

Anaerobok azok a protiszták, amelyek nem tudnak szaporodni oxigén jelenlétében, az oxigén rájuk nézve toxikus. Az oxigén toxikus hatása azt jelenti, hogy a sejtben található redukált molekulák oxigénnel találkozva oxidálódnak, amelynek során szuperoxid anion, peroxid és hidroxil gyökök képződhetnek. Ha nincs olyan enzim, ami ezeket semlegesíti, akkor kárt tesznek a létfontosságú enzimekben. A kataláz enzim, ami a peroxiszómákban termelődik, semlegesíti a fenti anyagokat. Azokban az egysejtűekben azonban, amelyek nem termelnek katalázt, az oxigén veszélyes méreg. Az ilyen egysejtűek kerülik az aerob környezetet.

Oxigénmentes környezet leginkább a vízi üledékekben és a nagy növényevő gerincesek bélcsatornájában fordul elő. Az oxigénmentes üledékben különösen a csillósok alkotnak diverz közösségeket. Anaerob üledékekben élnek például a Metopus, Caenomorpha, Saprodinium, Plagiopyla csillós egysejtűek. De igen jellemzők a Pelobiontida-k és számos különböző filogéniájú ostoros is. Citoplazmájukban endoszimbionta metanogén baktériumok élhetnek, amint azt a csillósok és a Pelomyxa palustris esetében többször kimutatták már. A metanogén baktériumok számára az oxigén halálos méreg, tehát csak olyan gazdában fordulnak elő, amely biztosítja számukra az oxigénmentes környezetet.

3.20. ábra. Anaerob egysejtűek a) Metopus sp. csillós egysejtű b) Caenomorpha sp. csillós egysejtű c) mocsári amőba (Pelomyxa palustris)

3.20. ábra. Anaerob egysejtűek a) Metopus sp. csillós egysejtű b) Caenomorpha sp. csillós egysejtű c) mocsári amőba (Pelomyxa palustris)

A Metopus fajoknál jellemzőek a metanogén endoszimbionták. A Metopus es vizsgálatánál kiderült azonban, hogy bizonyos határig elviseli az oxigén stresszt: a tenyészetet légköri levegőnek kitéve az egysejtűek két napig életben maradtak. A tenyészet 80 százaléka azonban az első napon elpusztult, az életben maradó csillósok mozdulatlanok maradtak és citoplazmájuk erősen vakuolizált lett. A nagyarányú pusztulás oka az lehetett, hogy károsodtak az intermedier anyagcsere fontos enzimjei, mint a hidrogenáz, a piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz, valamint az endoszimbionta metanogén baktériumok. A néhány túlélőnél a citoplazmájukban levő szuperoxid diszmutáz (SOD) biztosította az enzimek védelmét az aktív oxigéngyököktől. A szuperoxid diszmutázt már kimutatták számos parazita egysejtűből (pl. Entamoeba, Acanthamoeba, Trypanosoma, Leishmania, Plasmodium, Tritrichomonas és Monocercomonas fajok) és szabadonélőkből (Hexamita, Loxodes, Trimyema fajok) egyaránt. A Metopus es csillósnál megvizsgálták, hogy hogyan változik a tenyészet oxigénfelvétele a külső oxigénkoncentráció függvényében. A kezdeti emelkedést követően a görbe telítődésbe ment át, ami arra utal, hogy egy bizonyos koncentráció alatt a sejtek felveszik az oxigént, mert a szuperoxid diszmutáz semlegesíti az aktív gyököket, magasabb koncentrációnál viszont már nem. A természetben az oxigénkoncentráció emelkedése viselkedési választ is kivált, az egysejtűek összetömörülnek. A sejtek aggregációja egy félig-meddig izolált mikrokörnyezetet teremt, amelyből az oxigént az egysejtűek hamar eltávolítják (felveszik), így az aggregátumban az oxigén koncentrációja mindig akkora, hogy a SOD még metabolizálni tudja. A Metopus-ban talált SOD aktív centrumában mangán ion van. Mangán-tartalmú SOD enzimeket már sok más eukariótánál, köztük protisztáknál is kimutattak. Az eddig vizsgált protiszták közül azonban a Metopus-ban van a legkevesebb SOD, ez összefügg azzal, hogy csak alacsony oxigén szint mellett, rövid ideig képes oxigén jelenlétében életben maradni (Narayanan 2010).

Az endozoikus parazita Trichomonas vaginalis némiképp más módon reagál az oxigénre. A labortenyészet kialakításakor nem szükséges az anaerob környezetet előzetesen biztosítani: az egysejtű maga állítja elő azt. Eleinte az egysejtűek ugyan aktívan fermentálnak de nem osztódnak. Ez idő alatt a citoplazmában levő diaforáz enzimek (NADH oxidáz és NADPH oxidáz) a glükóz lebontása során keletkező redukált koenzimeket oxigén jelenlétében oxidálják, víz keletkezése közben. A reakció közben nem keletkezik ATP és nem alakul ki proton gradiens sem. Addig tart, amíg az oxigén el nem fogy. Amint az anaerob környezet kialakul, a Trichomonas oxigén-szenzitív anyagcsere útvonalra tereli a cukorlebontást és szaporodásnak indul. Giardia-ban is hasonló diaforázok gondoskodnak az oxigén eltávolításáról. A „kóbor” oxigénmolekulák eltávolítását szolgálják még az Flvd (flavo-diiron) fehérjék, amelyeket Trichomonas-ból Giardia-ból és Entamoeba-ból mutattak ki (pl. Vicente és mtsai 2012). A genom-projektek során ezek homológjait zöldalga szekvenciákban is megtalálták. Utóbbi elsőre talán meglepő, hiszen a fotoszintézis során maguk az algák képeznek molekuláris oxigént. Az Flvd azonban egy nagyon is adaptív stratégia része az algákban, például a Chlamydomonas reinhardtii-ban. Ez az alga gyakran vizes talajban fordul elő, ahol nem ritkán anaerob viszonyok uralkodnak. Sötétben, körülbelül fél óra alatt, átvált az anaerob anyagcserére. Ennek során molekuláris hidrogén keletkezik és a fermentáció alatt oxigénszenzitív enzimek jelenlétében termeli az ATP-t. Ilyenkor az oxigén miatti detoxifikálás létfontosságú a számára.

A fermentációs anyagcsereútvonalak száma nem túl nagy az eukarióták és így a protiszták körében. Minden fajnál van egy jellemző anyagcsereút, de lehetnek fajon belül egy-egy adott egysejtű népességre jellemző variánsok is, ismertek ilyenek például a Trichomonas vaginalis-nál, az Euglena gracilis-nél vagy a Chlamydomonas reinhardtii-nál. A komplex életciklussal fejlődő endozoikus egysejtűek között van, amelyik eltérő metabolizmussal fejlődik a különböző gazdákban: például a Trypanosoma brucei a rovar- és emlősgazdában.

Az Entamoeba histolytica anaerob endozoikus parazita amőba, amelynek fermentációja CO2, etanol és acetát képződéséhez vezet. Az utóbbi kettő aránya a nyomokban jelenlevő oxigénmolekulák mennyiségétől függ[12]. A cukorlebontás teljes mértékben a citoplazmában zajlik. A keletkező foszfoenol-piruvátból (PEP) piruvát keletkezik. Ezt a folyamatot az eukariótákban jellemző piruvát kináz enzim helyett a piruvát-ortofoszfát dikináz katalizálja (kis mennyiségben egy ritka piruvát kináz homológ is jelen van). A piruvátot a piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz (PFO) oxidálja. A keletkező acetil-koenzim A-ból részben acetát lesz miközben ATP keletkezik, részben (több lépésben) etanol, ennek során oxidálódnak a redukált koenzimek (NADH). Az Entamoeba acetil-koenzim A szintáz enzime az eukarióták között ritka, de Giardia-ban szintén ez működik. Genomvizsgálatok alapján homológja több protisztában is előfordul (pl.Thalassiosira pseudonana kovaalga, több spórás egysejtű: Plasmodium spp., Cryptosporidium muris, a sztramenopila Blastocystis hominis és az exkaváta Naegleria gruberi). Az etanolt előállító enzim egy kettős aktivitású dimér alkohol-aldehid dehidrogenáz, amely N-terminális végén egy aldehid dehidrogenáz, C-terminális végén pedig egy alkohol dehidrogenáz domént hordoz. Működése során az acetil-koenzim A-ból először acetaldehid majd etanol képződik. Ennek az enzimnek a monomerje előfordul zöldalgákban, Giardia-ban, és a gén homológját kimutatták több más protisztában. Az Entamoeba aminosavat (alanint) is termelhet.

3.21. ábra. Az Entamoeba histolytica fermentációjának lépései a citoplazmában és a lehetséges végtermékek kialakulása (Enzimek: 1: foszfoenol-piruvát karboxitranszferáz, 2: malát dehidrogenáz, 3: malát enzim, 4: piruvát kináz, 5: piruvát-ortofoszfát dikináz, 6: L-alanin aminotranszferáz, 7: piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz, 8: acetil-koenzim A szintetáz, 9: alkohol dehidrogenáz) (Müller és mtsai 2012 nyomán)

3.21. ábra. Az Entamoeba histolytica fermentációjának lépései a citoplazmában és a lehetséges végtermékek kialakulása (Enzimek: 1: foszfoenol-piruvát karboxitranszferáz, 2: malát dehidrogenáz, 3: malát enzim, 4: piruvát kináz, 5: piruvát-ortofoszfát dikináz, 6: L-alanin aminotranszferáz, 7: piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz, 8: acetil-koenzim A szintetáz, 9: alkohol dehidrogenáz) (Müller és mtsai 2012 nyomán)

Az Entamoeba-okozta betegségek gyógyszeres kezelése során nitroimidazol vegyületeket használnak (pl. metronidazol). Ezeket többek között a sejt PFO által katalizált reakciói során keletkező elektronok redukálják és az így aktivált citotoxikus vegyületek pusztítják el az egysejtűt.

Az Entamoeba-ban levő mitokondrium származék a mitoszóma, amely a mitokondriumokra jellemző ADP/ATP transzlokázt tartalmaz. Nem tudni még, hogy itt mi a szerepe. Nemrég a szulfát aktiváláshoz szükséges enzimet is kimutattak belőle. Eddig csupán egyetlen anyagcserefolyamatot gyanítottak a mitoszómával kapcsolatban, a vas-kén klaszterek (ferredoxin) érési és detoxifikálási folyamatát. (A citoplazmában működő PFO katalitikus centrumában két vas atom van, amelyeket cisztein aminosavak kénatomjai kötnek. A PFO katalitikus centruma tehát konzervatív felépítésű vas-kén fehérjéből áll, ezek képzésében vehet részt a mitoszóma.) A mitoszóma az energiaszerző folyamatokban valószínűleg nem vesz részt. A PFO a citoplazmában működik, a hidrogenoszómára jellemző hidrogenáz aktivitást nem mutattak még ki Entamoeba-ban. Genomja azonban több hidrogenáz homológot is rejt, amelyek egyikét E. coli baktériumba beültetve az aktívnak bizonyult.

A mitoszóma fontos gyógyszerhatóanyag célpont, ezért a protein-import mechanizmusát behatóan kutatják.

A Trichomonadida anaerob egysejtűekben fedezték fel a hidrogenoszómát (Lindmark és Müller 1973). Ezt az organellumot legtöbbet a Trichomonas vaginalis humán parazitában kutatták. Normál fermentációjának végtermékei glicerin, tejsav és etanol, ezek a citoplazmában képződnek, valamint molekuláris hidrogén, széndioxid és ecetsav, amelyek a hidrogenoszómában keletkeznek. Kis mennyiségben aminosav, alanin is képződik a citoplazmában, de ezt nem bocsájtja ki a környezetébe, szemben a glicerinnel, ami a sejten kívül is kimutatható. A hidrogenoszómába a citoplazmában képződött piruvát vagy malát kerül be. Az almasav piroszőlősavvá alakul, amelyet nem a citoplazmás, hanem a hidrogenoszómában lokalizált malát enzim katalizál. A piruvátot a PFO dekarboxilálja, miközben széndioxid, acetil-koenzim A keletkezik és az enzim ferredoxin része redukálódik. A redukált ferredoxint a ferredoxin-dependens vas hidrogenáz oxidálja, miközben az elektronok a mátrixban levő protonokkal egyesülve molekuláris hidrogént képeznek. Az acetil-koenzim A átalakítása során az acetát-szukcinát-koenzim A transzferáz enzim szukcinil-koenzim A-t és acetátot hoz létre. Az acetát mint végtermék távozik, a szukcinil-koenzim A molekulát a szukcinil-koenzim A szintetáz hasítja, szukcinátra és koenzim A-ra, miközben ATP keletkezik. Ez a hidrogenoszóma reakcióútjainak energia-konzerváló lépése. Az ATP-t valószínűleg egy mitokondriális jellegű ADP/ATP szállító fehérje homológ juttatja ki a citoplazmába. A Trichomonas vaginalis fajnál egy további energiaszerző reakcióút is létezik, bár jelentősége messze elmarad a fenti útvonalétól. Az arginin dihidroláz útvonal első enzimjét, az arginin deiminázt kimutatták a hidrogenoszómából, a folyamat többi komponense a citoplazmában található.

3.22. ábra. Anyagcsereutak a Trichomonas vaginalis fermentációja során a citoplazmában és a hidrogenoszómában (Enzimek: 1: glicerin-3-foszfát dehidrogenáz, 2: glicerin-3 foszfatáz, 3: PEP karboxikináz, 4: malát dehidrogenáz, 5: piruvát kináz, 6: malát enzim, 7: alanin aminotranszferáz, 8: piruvát dekarboxiláz, 9: laktát dehidrogenáz, 10: alkohol dehidrogenáz, 11: NADH dehidrogenáz két különböző alegysége 12: piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz, 13: acetát:szukcinát-CoA transzferáz, 14: szukcinil-CoA szintetáz) (Müller és mtsai 2012 nyomán)

3.22. ábra. Anyagcsereutak a Trichomonas vaginalis fermentációja során a citoplazmában és a hidrogenoszómában (Enzimek: 1: glicerin-3-foszfát dehidrogenáz, 2: glicerin-3 foszfatáz, 3: PEP karboxikináz, 4: malát dehidrogenáz, 5: piruvát kináz, 6: malát enzim, 7: alanin aminotranszferáz, 8: piruvát dekarboxiláz, 9: laktát dehidrogenáz, 10: alkohol dehidrogenáz, 11: NADH dehidrogenáz két különböző alegysége 12: piruvát-ferredoxin oxidoreduktáz, 13: acetát:szukcinát-CoA transzferáz, 14: szukcinil-CoA szintetáz) (Müller és mtsai 2012 nyomán)

A Trichomonas tisztított ferredoxin fehérjéjének molekulaszerkezetét behatóan vizsgálták, már a pontos térszerkezetét is ismerik.

A közeli rokon, Tritrichomonas foetus fajban hasonlóak a reakcióutak, de a végtermékek között nincs tejsav, csak etanol és alanin (Müller és mtsai 2012).



[12] Az Entamoeba histolytica bakteriális eredetű gének által kódolt oxigén reduktáz enzimekkel rendelkezik, amelyek flavo-diiron típusú fehérjék (Vicente és mtsai 2012).