1. fejezet - Citogenetika

Dr. Barna János tudományos munkatárs

ELTE TTK Biológiai Intézet, Genetikai Tanszék

Tartalom

A kromoszómák vizsgálati módszerei
A kariotípus
A kromoszómák morfológiai jegyei
Kromoszómafestési eljárások
Kromoszómasávozási technikák
Tájékozódás a kromoszómán
Fluoreszcens in situ hibridizáció
A kromoszóma mutációk
Kromoszómaátrendeződések
A kromoszómák számában bekövetkező változások
I. gyakorlat:A mitózis tanulmányozása és a kolhicin hatásának megfigyelése a vöröshagyma gyökércsúcs merisztémájában
A mitózis
A gyakorlat menete
II. gyakorlat A meiózis vizsgálata a fás bazsarózsa pollenanyasejtjeiben

A citogenetika a kromoszómák tudománya. Története a XIX. század második feléig nyúlik vissza, amikor Walter Flemming elsőként írta le a kromoszómákat és viselkedésüket a mitózis során. A kromoszómák vizsgálatának jelentősége az után nőtt meg, hogy a XX. század elején Walter Sutton és Thedoroe Boveri egymástól függetlenül megfogalmazták az öröklődés kromoszóma elméletét, mely szerint a mendeli faktorok, vagyis a gének, a kromoszómák részei.

A kromoszómák vizsgálati módszerei

A kariotípus

Egy élőlény teljes kromoszómakészletét kariotípusnak nevezzük. A kariotípust általában úgy ábrázoljuk, hogy egy élőlény metafázisos kromoszómáinak képét párokba állítjuk és méretük szerint csökkenő sorrendbe rendezzük. Ez a kariogram (1.1. ábra).

Az emberi kariotípus

1.1. ábra: Az emberi kariotípus. (A) Egy férfikromoszóma készlete (kariotípusa). (B) Egy férfi kromoszóma készletének rendezett ábrázolása, a kariogram

A metafázisos kromoszómákat célszerű intenzíven osztódó szövetekből preparálni. Ez az állatok esetében legtöbbször vér vagy csontvelő, míg a növényeknél valamelyik merisztéma szövete. Az osztódó sejteket általában olyan anyaggal kezelik, amely a sejtosztódást metafázisban megakasztja, így a mintában a metafázisos sejtek aránya megnő. Ilyen anyag a kolhicin is, amelynek hatását az első gyakorlat során mutatjuk be. Ezt követően a mintákat rögzítik, megfestik a kromoszómákat, majd mikroszkópos felvételt készítenek róluk. A felvételt kinagyítják és az egyes kromoszómák képét kivágják és kariogramba rendezik. Ma a kariogram készítését már számítógéppel vezérelt mikroszkópos technika segíti.

A kromoszómák morfológiai jegyei

Kezdetben, a sávozási technikák hiányában, a kromoszómákat csak alakjuk és méretük alapján lehetett elkülöníteni egymástól. További problémát jelentett az, hogy a kromoszómákat szövettani metszeteken vizsgálták és a metszési síkba ritkán esett bele az összes kromoszóma. Ezzel magyarázható, hogy az ember kariotípusát csupán 1956-ban határozta meg Joe Hin Tjio és Albert Levanet.

A metafázisos kromoszómákon megkülönböztethetjük a karokat, a centromert és a telomereket (1.2. ábra). A telomerek a kromoszómák végei, más morfológiai jellegzetesség nem figyelhető meg rajtuk. A centromer a metafázisos kromoszómán a karok közti befűződésként jelenik meg ezért elsődleges befűződésnek is nevezzük. Egyes kromoszómákon úgynevezett másodlagos befűződés is megfigyelhető. Ez a nukleólusz organizátor régió (NOR). A NOR a riboszómális RNS-ket kódoló gének helye a kromoszómán, köré szerveződik interfázisban a nukleólusz. Általában csak egy vagy néhány kromoszómán van jelen. Azt a rövid kromoszóma részlete, amelyet a másodlagos befűződés választ le a kromoszóma karjáról szatellitának nevezzük. A szatellita ez esetben nem összekeverendő a genom rövid repetitív szekvenciáival.

A kromoszóma két karja közül a hosszabbik a hosszú (q=queue), a rövidebbik a rövid (p=petit) kar. A centromer elhelyezkedése alapján megkülönböztethetünk meta-, telo- illetve akrocentrikus kromoszómákat (1.2. ábra). A centromer helyzete jellemezhető a hosszú és a rövid kar egymáshoz viszonyított százalékos arányával is. Ez az úgynevezett centromer index.

A kromoszómák három alapvető típusa és morfológiai jegyei.

1.2. ábra: A kromoszómák három alapvető típusa és morfológiai jegyei. A karok egymáshoz viszonyított hosszúsága szerint megkülönbözetünk metacentrikus, akrocentrikus és telocentrikus kromoszómákat. Másodlagos befűződés bármelyik típuson előfordulhat. 

Az emberi kromoszómák egységes osztályozását 1960-ban, egy Denverben rendezett konferencián dolgozták ki. A 23 pár emberi kromoszómát autoszómákra és szex-kromoszómákra osztották fel. A szex kromoszómákat X és Y karakterrel, míg az autoszómákat 1-22-ig arab számokkal jelölték. Az autoszómákat méretük, a centromeron helyzete és a másodlagos befűződések alapján hét csoportba osztották. A csoportokat latin betűkkel (A-G) vagy római számokkal (I-VII) jelölték (1. táblázat).

1. táblázat: Az emberi kromoszómák osztályozása

Csoport

Jellemzők

Kromoszómák száma

Centromeron index

Relatív hossz

I. vagy A

Nagyméretű metacentrikus

1

2

3

48

39

47

8,4

8,0

6,8

II. vagy B

Nagyméretű, szubmetacentrikus

4

5

29

29

6,3

6,1

III. vagy C

Közepes nagyságú, szubmetacenrikus

6

7

8

9

10

11

12

39

39

34

35

34

40

30

5,9

5,4

4,9

4,8

4,6

4,6

4,7

IV. vagy D

Közepes nagyságú, akrocentrikus, szatellitákkal

13

14

15

17

19

20

3,7

3,6

3,5

V. vagy E

Kisméretű, szubmetacentrikus

16

17

18

41

34

31

3,4

3,3

2,9

VI. vagy F

Kisméretű, metacentrikus

19

20

47

45

2,7

2,6

VII. vagy G

Kisméretű, akrocentrikus

21

22

31

30

1,9

2,0

X

23

40

5,1

Y

24

27

2,2

Kromoszómafestési eljárások

A kromoszómák festés nélkül csak fáziskontraszt vagy fluoreszcens mikroszkópos technikával láthatóak, ezért a kromoszómák fénymikroszkópos vizsgálatának érdekében számos kromoszómafestési technikát dolgoztak ki. Walter Flemminget például a bázikus anilin festék alkalmazása segítette a mikózis folyamatának tanulmányozásában. A Drosophila melanogaster óriás kromoszómái pedig orcein-ecetsavas festéssel tehetőek láthatóvá.

Széles körben elterjedt a kromoszómák kármin-ecetsavas festése. A kármint az amerikai kontinens trópusi vidékein és a Kanári szigeteken élő fügekaktuszon (Opuntia coccinellifera) élősködő bíbortetű (Coccus cacti) nőstényéből vonják ki (1.3. ábra). A kárminecetsav a kármin ecetsavas oldata. A citoplazmát rózsaszínűre, míg a kromoszómákat kékes-vöröses színűre festi.

A kármin

1.3. ábra: A kármin. A kármint (jobbra fent) a fügekaktuszon (balra) élősködő bíbortetű (jobbra lent) nőstény egyedeiből vonják ki.

Kromoszómasávozási technikák

A hasonló méretű és alakú kromoszómák megkülönböztetése nem egyszerű feladat. Ezért a citogenetikát forradalmasította a sávozási technikák megjelenése. Kiderült, hogy minden kromoszómának egyedi sávozási mintázata van. Ez jelentősen megkönnyítette az egyes kromoszómák azonosítását, illetve a kromoszóma rendellenességek kimutatását.

Az első kromoszómasávozási eljárást, a Q-sávozást Torbjorn Caspersson és munkatársai írták le 1970-ben. A Q-sávozás során egy fluoreszcens festékkel, a quinacrindihidro-kloriddal az adott kromoszómára jellemző, jól reprodukálható festődési mintázatot lehet kialakítani.

Azóta számos más sávozási eljárást kidolgoztak (1.4. ábra). Ilyenek a C-, az R-valamint a legelterjedtebb és a legnagyobb felbontást biztosítótechnika, a G-sávozás. A Q sávozástól eltérően a G-sávozás során a kromoszómákat a festés előtt valamilyen sóval vagy proteolítikus enzimmel, például tripszinnel kezelik. Ezt követően a kromoszómákat a Giemsa festék (a metilén kék és az eozin festékek keveréke) segítségével teszik láthatóvá.

Az R-sávozás segítségével a G mintázat negatívját kapjuk meg. Az R- sávozás során forró sóoldattal kezeljük a kromoszómákat, és ennek következtében az AT gazdag DNS régiók denaturálódnak. A kromoszómákat ezután festik meg Giemsa festékkel. Az R-sávozással különösen az kromoszómavégek tanulmányozhatóak jól, mivel ezek általában gyengébben festődnek a G-sávozás során. A C-sávozás során a kromoszómákat savval vagy bázissal kezeljük elő. Ez az eljárás különösen a heterokromatikus régiók megfestésére alkalmas.

A sávok kialakulásának molekuláris oka a DNS bázisösszetételében és a helyi kromatinszerkezeti különbségekben rejlik. Általában a heterokromatikus, génben szegény, AT gazdag régiók sokkal sötétebben festődnek, míg a kevésbé kondenzált GC gazdag DNS-t tartalmazó eukromatikus régiókhoz a festék kisebb affinitással kötődik. Ezért fénymikroszkóposan a heterokromatin sötét, míg az eukromatin világos sávként jelenik meg (1.4. ábra) Az általánosan elterjedt G-sávozási technikák segítségével 400-600 sávot különböztethetünk meg egy metafázisos kromoszómán.

Különböző sávozási technikákkal létrehozott emberi kariogramok.

1.4. ábra: Különböző sávozási technikákkal létrehozott emberi kariogramok. G sávozással (A) és Q sávozással (B) létrehozott női kariogram. (C)R sávozási technikával készült férfi kariogjamja. (D) C sávozással megjelenített emberi kromoszómák.

Tájékozódás a kromoszómán

A kromoszómákon belüli tájékozódás megkönnyítése érdekében létre hozták a régiók és sávok elnevezésére szolgáló standard nevezéktant(ISCN= International System for Human Cytogenetical Nomenclature). A kromoszóma karokat régiókra osztják. A régiók jellegzetes morfológiájú kromoszómaterületek Számozásuk a centromertől kezdődik.A régiókat sávok tagolják. A sávok számozása egy régión belül szintén a centromer felől indul. A sávok alsávokra (subband) bonthatóak. Az X kromoszóma rövid karjának 2. régiójának 2. sávján belüli 3. alsáv jelölése a következőképpen alakul: Xp22.3.

A sávozási technikák segítségével azonosított kromoszóma rendellenességeket a 2. táblázatban feltüntetett módon nevezzük el. Az átrendeződés megnevezése után (például t = transzlokáció; del = deléció; dup = duplikáció; inv = inverzió) zárójelben tüntetjük fel az érintett kromoszóma területet.

2. táblázat: Néhány gyakoribb kromoszóma átrendeződés elnevezése

Rövidítés

Jelentés

Példa

Leírás

46, XX

Normális női kariotípus

46, XY

Normális férfi kariotípus

cen

centromér

del

deléció

46,XX,del(5p)

Macskasírás (cri du chat) szindrómás nő. Az 5-ös kromoszóma rövid karjának egy része hiányzik.

der

származtatott kromoszóma

der(1)

Az 1-es kromoszómából származó transzlokációval létrejött kromoszóma, amely az 1-es kromoszóma centromerjét tartalmazza.

dic

dientrikus kromoszóma

dic(X;Y)

Transzlokációval létrejött kromoszóma, amely az X és az Y kromoszóma centromerjét is tartalmazza.

dup

duplikáció

inv

inverzió

inv(3)(p25:q21)

a 3-as kromoszóma peri centrikus inverziója.

mat

anyai eredetű

47,XY,der(1)mat

Férfi, aki az anyjától egy transzlokációs kromoszómát (der(1)) örökölt.

p

A kromoszóma rövid karja

pat

apai eredetű

q

A kromoszóma hosszú karja

r

gyűrű kromoszóma

46,X,r(X)

Gyűrű X kromoszómával rendelkező nő

rcp

reciprok transzlokáció

rob

Robertsoni transzlokáció

t

transzlokáció

46,XX,t(2;8)(q21;p13)

Kiegyensúlyozott transzlokációs kromoszómával rendelkező nő. A 2-es kromoszóma rövid karja és 8-as kromoszóma hosszú karja cserélődött ki. A transzlokáció töréspontjai: 2q21 és 8p13.

+

gain of

47,XX,+21

A 21. kromoszómából 3 példányt hordozó (triszómia) Down kóros nő.

-

loss of

45,XX,-14,-21,+t(14q21q)

Normális nő. A 14-es és a 21-es kromoszómából Robertsoni transzlokációval létrejött kromoszómát hordoz. Egy-egy normális 14-es és 21-es kromoszómája hiányzik.

Fluoreszcens in situ hibridizáció

Az elmúlt néhány évtizedben egy forradalmian új módszer, a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) technika jelent meg a citogenetikában. A FISH lényege az, hogy egy fluoreszcens festékkel jelölt DNS vagy RNS próbát a vele komplementer DNS szekvenciához hibridizáltatnak a kromoszómán. Így a kromoszómákat fluoreszcens mikroszkópiával vizsgálva az adott DNS szekvencia elhelyezkedését a fluoreszcens jel mutatja (1.5. ábra).

A fluoreszcens in situ hibridizáció elve.

1.5. ábra: A fluoreszcens in situ hibridizáció elve. A próbát fluoreszcensen vagy más módon jelölik. A kettős szálú próbát és a vizsgált DNS-t hő segítségével denaturálják. A denaturált próbát és a vizsgált DNS-t összekeverik, és a renaturáció (hűtés) során a jelölt egyszálú próbák a velük komplementer DNS-hez hibridizálnak. Így az adott szekvencia megléte illetve elhelyezkedése a kromoszómán fluoreszcens mikroszkópiával detektálható.

A FISH technika lehetővé tette a kromoszóma átrendeződések egyszerűbb és finomabb vizsgálatát. Segítségével akár kisebb kromoszóma régiókat érintő kromoszómális átrendeződések is kimutathatóak (1.6. ábra).

A Williams szindróma kimutatása FISH segítségével.

1.6. ábra: A Williams szindróma kimutatása FISH segítségével. A Williams szindrómás betegekben a 7. kromoszóma hosszú karján egy körülbelül 26 gént érintő deléció található. A hiányzó gének egyike az elasztint kódolja. (A) Williams szindrómás beteg esetében a 7. kromoszómát kijelölő kontroll és az elasztin génjére tervezett fluoreszcens próba csak az egyik 7. kromoszómán található meg együttesen. Az elasztin próba a deléciós kromoszómához nem hibridizál. (B) Egészséges egyedekben a kontroll és az elasztin génjére tervezett próba mindkét homológ kromoszómához hibridizál.

A spektrális kariotipizálás segítségével akár az ember 24különböző kromoszómája külön-külön színben jeleníthető meg. A módszer során olyan jelölt DNS próbákat használnak, amelyek kizárólag egy adott kromoszómához képesek hibridizálni. Ilyen próbák előállításához az egyes kromoszómákat áramlási citométer segítségével szétválasztják, majd a rövid degenerált oligonukleotid primereket felhasználva az egyes kromoszómákra specifikus DNS szakaszokat szaporítanak fel PCR reakcióval. Az adott kromoszóma-specifikus próbákat egy vagy több fluorokrómmal jelölik. Így a különböző módon jelölt kromoszómák eltérő hullámhosszú fénnyel fluoreszkálnak. (1.7. ábra A és B).

A spektrális kariotipizálás.

1.7. ábra:A spektrális kariotipizálás. (A) A spektrális kariotipizálás elve. (B) Az ember spektrális kariotípusa. (C) Egy leukémiás beteg sejtjeinek R-sávozással készült részleges kariotípusa (fent) és ugyanezen beteg spektrális kariotípusa(lent). Az R sávozás segítségével a 18. kromoszómán található idegen kromoszóma részlet (nyíl) eredete nem határozható meg. A spektrális kariotípus alapján azonban megállapítható, hogy ez a kromoszóma részlet a 9. kromoszómáról származik. A további nagyobb kromoszóma rendellenességeket karikák jelölik. 

                                                                

A FISH technikát ma már rutinszerűen használják a klinikai diagnosztikában. Gén specifikus próbák használatával meg lehet határozni azokat a géneket, amelyeket az adott kromoszóma átrendeződés érint. A spektrális kariotipizálás lehetőséget nyújt arra, hogy néhány óra alatt ki lehessen mutatni a kromoszóma átrendeződéseket és kromoszóma számban bekövetkező változásokat (1.7. ábra C).