I. gyakorlat:A mitózis tanulmányozása és a kolhicin hatásának megfigyelése a vöröshagyma gyökércsúcs merisztémájában

A gyakorlat során kolhicinnel kezelt és kezeletlen hagyma (Allium cepa) gyökércsúcsból szélesztett preparátumot készítünk. A preparátumokon azonosítjuk a mitózis fázisait és megfigyeljük a kolhicin sejtosztódásra gyakorolt hatását.

A mitózis

A mitózis a sejtek számtartó osztódása, melynek során a sejt genetikai állománya megkettőződik és két, az anyasejttel megegyező kromoszómaszámú, leánysejt sejt jön létre. A mitózis sejttanilag négy szakaszra bontható: profázis, metafázis, anafázis és telofázis   (1.8. ábra).

A mitózis folyamata vöröshagyma (Allium cepa) gyökércsúcs merisztéma sejtjeiből készült szélesztett preparátumon

1.20. ábra: A mitózis folyamata vöröshagyma (Allium cepa) gyökércsúcs merisztéma sejtjeiből készült szélesztett preparátumon (A) interfázis; (B) profázis; (C) metafázis; (D) anafázis;(E) telofázis;(F) utódsejtek; (G) normális metafázis; (H) kromoszómák „C mitózisban”

A profázis (1.20. ábra B):

A profázis a mitózis bevezető szakasza. A kromoszómák kondenzálódnak és már fénymikroszkóppal is meg lehet figyelni őket. Ezek a kromoszómák már két, genetikai információ tartalmúkat tekintve azonos testvérkromatidából állnak, amelyek a centromeronnál kapcsolódnak össze. Ez a kromoszóma kétkromatidás állapota.

A kései profázisban a sejtmagvacska (nucleolus) eltűnik és megkezdődik sejtmag (nucleus) membránjának lebomlása. Kialakul az osztódási orsó, amelynek fonalai a sejt pólusaihoz illetve a kinetochoron keresztül a centromerekhez kapcsolódnak.

A metafázis (1.20. ábra C):

A metafázisban a maghártya már teljesen lebomlott. A kromoszómákat a magorsó fonalak a sejt egyenlítői síkjába rendezik. A kromoszómák kondenzációja fokozódik, szerkezetük ebben a fázisban a legtömörebb. A citogenetikai vizsgálatokat is többnyire metafázisos kromoszómákon végzik. Ekkor figyelhető meg leginkább a kromoszómák alakja valamint ebben a fázisban célszerű meghatározni a fajra jellemző kromoszómaszámot.  Ez az állapot tehát a legmegfelelőbb a kariotípus elkészítéséhez.

Az anafázis (1.20. ábra D):

Az anafázis során a testvérkromatidák centromeronjai elválnak egymástól és a kétkromatidás kromoszómából két, egykromatidás leánykromoszóma jön létre. Az egykromatidás leánykromoszómákat a magorsó fonalak a sejt két ellentétes pólusára húzzák.

A telofázis (1.20. ábra E):

A mitózis a telofázissal zárul. A leánykromoszómák már a sejt ellentétes pólusain találhatóak. A kromoszómák szerkezete fellazul. Új sejtmaghártya kialakulása kezdődik meg a kromoszómák körül, újra megjelenik a sejtmagvacska, végül a sejtplazma is osztódik.

A kolhicin hatása a sejtosztódásra

A kolhicin az őszi kikericsből (Colhicum autumnale) és más Colhicum fajokból izolálható alkaloida, mely a magorsó fonalakat bénítja. Hatására a leánykromoszómák a metafázisban nem képesek szétválni és a sejt ellentétes pólusaira vándorolni. Ezt használják ki a növénynemesítők. Segítségével poliploid növényi szöveteket lehet létrehozni, ez pedig alkalmas olyan fajhibridek sterilitásának leküzdésére, ahol a terméketlenség oka az, hogy a két faj kromoszómái nem képesek egymással párosodni ezért véletlenszerűen szegregálnak a meiózis során. A kolhicin hatása attól függően, hogy milyen sejtosztódási fázisban végezzük, a kezelést eltérő lehet. A profázisból a sejtek visszakerülhetnek az interfázisba. A profázis megrövidül és a sejtek hosszabb ideig tartózkodhatnak metafázisban, ez pedig a  metafázisok gyakoriságának megnövekedését eredményezi. Ennek megfelelően az ana- és telofázisok ritkábbak. A kolhicinnel kezelt szövetben a kromoszómák tömörebbek, méretük kisebb. Megfelelő kolhicines kezeléssel kariotipus meghatározására alkalmas preparátumot kapunk.

A gyakorlat menete

Anyagok:

  • 1kg dughagyma

  • Carnoy rögzítő: abszolút alkohol és jégecet 3:1 elegye

  • 1N sósav

  • papírvatta

  • szűrőpapír

  • 0,1%-os kolhicin oldat

  • 5%-os kárminecetsav 45%-os ecetsavban oldva

  • tárgylemez

  • fedőlemez

Előkészítés

A dughagyma gyökereztetés (2-5 nap):

A hagymák gyökerét megtisztítjuk az elszáradt részektől majd vigyázva, hogy csak a tönkjük érjen a vízbe, gyökereztető edénybe helyezzük. A gyökereztetés során a vizet az edényben naponta cseréljük és a gyökerek állapotát ellenőrizzük. A preparátum készítésére a néhány centiméter hosszú, még nem barna gyökér alkalmas. A gyökércsúcs porcelánszerű. Az intenzíven osztódó zóna sárgásfehér, mögötte a gyökér áttetsző.

Kolhicinezés (4-5 óra):

A kezelendő gyökereket 1-2 ml 0,1%-os kolhicin oldatba helyezzük, majd 4-5 óra elteltével, szűrőpapír segítségével leitatjuk róluk a kolhicin oldatot és rögzítjük.

Rögzítés Carnoy rögzítőben (1 nap):

A gyökereket ún. Carnoy oldatban (abszolút alkohol és jégecet 3:1 arányú elegye) áztatjuk. A rögzítés 24 órája alatt a Carnoy oldatot egyszer cserélni kell. Az így rögzített minta mélyhűtőben illetve 70%-os alkoholban szobahőmérsékleten is sokáig, akár évtizedekig is eláll.

Alternatív rögzítés:

Jobb minőségű, de nem annyira tartós preparátumot kapunk, ha Carnoy oldat helyett a gyökereket 45%-os ecetsavban áztatjuk 20 percen keresztül.

Puhítás

A szélesztett preparátum készítése során arra törekszünk, hogy a mintánk egy sejtsor vastagságú legyen. A rögzítést követően a gyökércsúcsok azonban még több sejtsor vastagok és a sejteket a sejtfalak tartják össze. Annak érdekében, hogy megfelelő minőségű preparátumot tudjunk készíteni a sejtfalakat alkotó poliszacharidokat el kell hidrolizálnunk.

A gyökereket a rögzítőből kivéve vízzel mossuk, leitatjuk, majd 1N hideg sósavval átöblítjük, hogy a maradék vizet eltávolítsuk. Ezután a gyökereket 60°C-on 1N sósav oldatban inkubáljuk 5 percig – vigyázzunk, mert ha tovább főzzük benne a sejtmag is károsulhat. A puhítást követően a gyökereket desztillált vízzel mossuk, majd a vizet leitatjuk. Az így kapott puhított gyökeret 70%-os alkoholban tároljuk.

a hagyma gyökércsúcs előkészítésének és festésének fázisai.

1.21. ábra: a hagyma gyökércsúcs előkészítésének és festésének fázisai

Festés

A hagyma gyökeret egy tárgylemezre helyezzük, megállapítjuk, hogy melyik a csúcsa (sárgásfehér vég, alatta az áttetsző állandósult szövetek) és 5%-os kárminecetsavat cseppentünk rá (1.21. ábra). A tárgylemezt nyílt láng felett óvatosan melegítjük egy-két percig. Ügyeljünk arra, hogy a festék ne forrjon fel! A festődés akkor jó, ha a gyökércsúcsok sötétbarnás-vörössé válnak. Ha a preparátumot túlfestjük, akkor a színe feketésen vörös.

A festést követően a felesleges kárminecetsavat felitatjuk szűrőpapírral és a gyökeret új, tiszta tárgylemezre helyezzük, a gyökércsúcs mögötti állandósult szöveteket eltávolítjuk. Ezután gyorsan egy csepp kárminecetsavat rakunk rá és befedjük a fedőlemezzel. Ha a minta elég puha, akkor már a fedőlemez súlya hatására is szétterül a szövet. A tárgylemezt még 1-2 percig melegítjük, néha egy-egy csepp kárminecetsavat hozzáadásával.

A sejtek szélesztése

A fedőlemezre szűrőpapírt helyezünk, leszorítjuk és a ceruza végével vagy más tompa végű tárggyal finoman kopogtatjuk, majd „firkáljuk” a mintát. Ha ekkor mikroszkóppal megnézzük a preparátumot, akkor látjuk, hogy a sejtek még gömbölyűek. Ezért van szükség a preparátum kilapítására. A szűrőpapírt rászorítjuk a fedőlemezre és egy határozott mozdulattal, hüvelykujjunkkal ránehezedünk a mintára. Ezek utána a kész szélesztett preparátumot fénymikroszkóppal vizsgáljuk meg.

Feladatok

  1. Figyeljük meg a mitózis fázisait a kezelt és a kezeletlen preparátumon!

  2. Készítsünk rajzot az egyes fázisokról!

  3. Próbáljuk meg meghatározni a diploid a kromoszómaszámot. 2n=?

  4. Figyeljük meg, hogy milyen hatással van a kolhicin a kromoszómák elrendeződésére, méretére illetve az egyes fázisok gyakoriságára!

II. gyakorlat A meiózis vizsgálata a fás bazsarózsa pollenanyasejtjeiben

A gyakorlat során fás bazsarózsa (Paeonia sufruticosa) bimbók pollenanyasejtjeiből szélesztett preparátumot készítünk. A preparátumokon azonosítjuk a meiózis fázisait. 

A meiózis

A meiózis a gaméták termelésére specializálódott sejtek osztódás típusa, melynek során egyetlen meiocita anyasejtből 4 utódsejt más néven meiótikus termék keletkezik. Egyetlen meiótikus termék kromoszóma száma - ezáltal genetikai információ tartalma - pontosan fele az anyasejtének. A négy meiótikus termék információ tartalma egymástól különböző

A meiózis lényegében két egymást követő sejtosztódásból áll. Az első osztódási szakaszban a homológ kromoszómák - Mendel első törvényének megfelelően - szétválnak egymástól, és külön utódsejtbe kerülnek, mialatt a testvér kromatidák együtt maradnak.

A második osztódási szakaszban a testvér kromatidák válnak szét egymástól, így az utódsejtek egy DNS szálból álló, de az anyasejthez képest fele kromoszóma számú kromoszóma készlettel rendelkeznek.

A meiózis sejttanilag négy szakaszra bontható: profázis, metafázis, anafázis és telofázis (1.22. ábra).

A meiózis fázisai fás bazsarózsa (Paeonia sufruticosa) pollenanyasejtjeiben

1.22. ábra: A meiózis fázisai fás bazsarózsa (Paeonia sufruticosa) pollenanyasejtjeiben (A), (B) és (C) Profázis I; (D) Metafázis I.; (E) Anafázis I; (F) Telofázis (G) Profázis II; (H) Metafázis II; (I) Anafázis II; (J) és (K) Telofázis II; (L) pollenek

Profázis I (1.22.ábra A -C):

Leptotén (vékony fonalas): a kromoszómák hosszú vékonyfonalként láthatóvá válnak.

Zigotén (párosodó fonalas): homológ kromoszómák hossztengelyük mentén párosodnak, kialakul a bivalens kromoszóma, amit 4db. kromatida alkot.

Pahitén (vastag fonalas): a kromoszómák szálai megvastagodnak, megrövidülnek. Ebben a fázisban megy végbe a crossing-over.

Diplotén (dupla fonalas): a négy kromatid egymáshoz tapadása lazul, kiazmák (átkereszteződések) jelennek meg. A kiazma a crossing-over citológiai megjelenése.

Diakinézis:a kromoszómák tovább rövidülnek, a maghártya eltűnik.

Metafázis I (1.22.ábra D):

A homológok az egyenlítői síkban rendeződnek, a testvér kromatidák nem válnak el, a homológok centromerei ellenkező pólushoz tartozó húzó fonalakhoz tapadnak

Anafázis I (1.22.ábra E):

A homológ párok tagjai az ellenkező pólusra jutnak

Telofázis I (1.22.ábra F):

Fajonként változó lehet. A második osztódás rögtön folytatódik, vagy kialakulhat a magmembrán, sőt a sejtmembrán is. Az első osztódás redukciós, mert a kromoszómák számát a felére, a haploid számra (n) csökkenti az utódsejtekben.

Profázis II (1.22.ábra G):

Megrövidült, haploid kromoszómaszámot mutató kétkromatidás kromoszómák látszanak

Metafázis II (1.22.ábra H):

A kromoszómák az egyenlítői síkba rendeződnek.

Anafázis II (1.22.ábra I):

A cetromerek elhasadnak, a húzófonalak az ellentétes pólusokra viszik a testvérkromatidákat.

Telofázis II (1.22. ábra J és K):

Kialakul a magmembrán és létrejön a négy haploid meiótikus termék vagy tetrád.

A gyakorlat menete:

Anyagok:
  • bazsarózsa bimbók

  • Carnoy rögzítő: abszolút alkohol : jégecet 3: 1 elegye

  • papírvatta

  • szűrőpapír

  • 0,1 %-os kolhicin oldat

  • kárminecetsav

  • tárgylemez

  • fedőlemez

Előkészítés

A bimbókat egy tavaszi reggelen érdemes begyűjtenünk az ELTE botanikus kertjéből. A közepes méretű bimbókat érdemes begyűjteni, a nagyon nagy illetve nagyon kicsi bimbó már vagy még nem jó. Egy bimbóban rengeteg portok található. Ha a portok sárga, akkor már nem alkalmas a vizsgálatra, mert már pollenek vannak benne. A begyűjtött bimbókról eltávolítjuk a takaróleveleket és Carnoy rögzítőbe áztatjuk 2 napon keresztül, a rögzítőt 12 óránként lecseréljük. A rögzített bimbók 70%-os alkoholban, mélyhűtőben tárolhatóak. 

A festés

A tárgylemezre egy porzószálat helyezünk. A portok végéből 1mm-t levágunk és lándzsatűvel felaprítjuk, mint a petrezselymet. Kárminecetsavat cseppentünk rá, fedőlemezzel lefedjük és így melegítjük óvatosan néhány percig, majd szélesztett preparátumot készítünk (lásd mitózis gyakorlat).

Feladatok
  1. Figyeljük meg a meiózis fázisait a pollenanyasejtekben

  2. Figyeljük meg a mitózis fázisait a portok szövetében!

  3. Figyeljük meg a bivalenseket

  4. Készítsünk rajzot az egyes fázisokról

  5. Próbáljuk meg megszámolni a kromoszómákat. A meiózis mely fázisát érdemes kiválasztani erre a célra?