Tetrádelemzés

A tetrádanalízis során egyetlen meiotikusan osztódó sejt 4 haploid termékét (a tetrádot) vizsgáljuk. Szemben az eddig megismert statisztikus kiértékelési móddal a tetrád elemzés során egyedileg vizsgáljuk egy-egy meiózis termékeit. Ily módon az egyedi eseményeket hasonlítjuk össze. A meiotikus osztódás haploid terméke az állatokban a petesejt a három sarki testtel illetve a spermiumok. Virágos növényekben a végtermék a 8 sejtből álló embriózsák és a három haploid sejtből álló pollenszem. Haploid tömlősgombák esetében 4, illetve a meiózist követő mitotikus osztódás után 8 haploid aszkospóra egy meiózis terméke. A 4 illetve 8 aszkospóra a tömlőben vagy másnéven aszkuszban található, ez teszi lehetővé a tetrádok elkülönült vizsgálatát. A tömlősgombák egy részében a meiotikus osztódás, illetve a mitózis tengelye szigorúan rögzített. Az egyes osztódások lineáris rendben követik egymást és ezt az elrendeződést megőrzi a végtermék, a 8 aszkospóra is, ezeket nevezik rendezett tetrádoknak. A spórák genotípusának lineáris rendje a tetrádanalízis kulcsa, ez teszi lehetővé, hogy rendezett tetrádok esetén egyetlen gén és centromeronja közti távolságot tudunk megadni.

A gyakorlatban az aszkuszok mintázatának vizsgálata úgy történik, hogy az aszkuszokat egy csipesszel kinyomják az ún. termőtestből, majd az egyes aszkuszokból a spórákat sorrendben, egyenként kiemelik egy vékony üvegtűvel. Ezután minden spórát külön-külön kémcsőben táptalajon kicsíráztatnak és a gombafonaltömeg, a micélium tulajdonságait ellenőrzik. Ezt a munkafolyamatot disszekciónak nevezik. Mivel a spóra haploid, a micélium tulajdonságainak ellenőrzése elárulja a spóra genotípusát.

Van, amikor nincs szükség disszekcióra, mert a spórákról ránézésre meg lehet állapítani, hogy milyen allélt hordoznak. Ilyen pl. az, amikor a spóra színmutánsok segítségével végezzük a tetrádelemzést. A vad típusú spóra színe rendszerint sötét, de vannak mutánsok, amelyekben ez a festékanyag nem képződik, ezért a spóra színe világos. (Természetesen a gyakorlaton ez utóbbi tulajdonságot fogjuk vizsgálni.)

A spórasorrend jelentése

Az aszkusz szigorú térrendje azt eredményezi, hogy harántsíkban elhasítva két egyenlő félre osztható, a 8 aszkospóra első és második négyese az apai és anyai kromoszómapár centromeronjait jelképezi, illetve a centromeronhoz kapcsolódó kromatidák genetikai tartalmát. Hiszen az első meiotikus osztódáskor ez a két centromeron „vonszolta" a kromoszóma többi részét az utódsejtek pólusaihoz.

A második meiotikus osztódás, amikor a centromeron is osztódik, s ezáltal a testvér kromatidák is elválhatnak egymástól, a spórapárral jellemezhető: az 1. és 2.; 3. és 4.; 5. és 6. illetve 7. és 8. pozícióban fekvő spórák a kromatidák genetikai tartalmát jelképezik. Mivel a kromatida DNS-e egyetlen hosszú DNS kettős spirálból áll, a spórapár az adott DNS-molekulán fekvő allélokról tájékoztat. Ezek után nem nehéz belátnunk, hogy az aszkusz minden egyes spórája a kromatidafonalban levő DNS kettős spirál egyik szálát jelenti, illetve az azon levő genetikai információt. A spórapárok tagjai tehát elméletileg azonosak, hiszen egy DNS kettős spirál duplázódásával jöttek létre.

Azonos centromeronhoz kapcsolódó kromatidák (testvér kromatidák) közötti kicserélődés genetikai változást nem eredményez, így nem is észlelhető. A tetrád mintázata ezek szerint bizonyítja a fizikai kicserélődés tényét a centromeron és a vizsgált allélpár kromoszómális helye között.

A tömlősgombák életciklusa

A tetrádanalízis klasszikus objektumai az Ascomycetes/tömlősgombák osztályába tartozó gombák. A tömlősgombák közé olyan ismert fajok is tartoznak, mint például az élesztők, penészgombák, a lisztharmat, a kucsmagomba és a szarvasgomba. Gyakran vizsgálat fajok például a Neurospora crassa, a Sordaria fimicola és a Saccharomyces cerevisiae élesztő (ez utóbbi nem rendezett tetrádokat képez). Mivel a gyakorlaton S. fimicola törzseket vizsgálunk, most csak e faj életciklusát mutatjuk be.

A Sordaria fimicola vegetatív teste a válaszfalakkal tagolt haploid micélium (2.1. ábra). Szaporodása esetén termőtestet (ascocarpium) képez, a spórák miután kikerülnek az aszkuszból kicsíráznak és primer micéliumot (tenyésztestet) hoznak létre, melyen női ivarszervek (aszkogóniumok) és hímivarszervek (anterídiumok) képződnek. Az aszkogónium csúcsán helyezkedik el a párzó fonal (trichogin), ezen átvándorolva jutnak a hímivarsejtek az anteridiumból az aszkogóniumba. Egyesülve diploid úgynevezett magpárt (dikariont) képeznek, mely magpárok az aszkogónium által létrehozott hifákba vándorolnak. Az összeolvadást nem követi azonnal kariogámia, ezáltal magpáros sejtek, majd azokból magpáros („aszkogén”) hifák jönnek létre. A magpáros vagy dikariotikus hifákból jön létre a termőtest (ascocarpium). A termőtest kialakulása a tömlősgombákra általánosan jellemző. A kariogámia a dikariotikus hifa végsejtjében horogképzéssel megy végbe. A horogképződés mechanizmusa meggátolja két azonos ivarjellegű sejtmag összekerülését. A zigótát tartalmazó sejt megnyúlik, sporangiummá alakul, majd először meiózissal és azt rögtön követő mitózissal – általában nyolc – spóra alakul ki. Ezt a megnyúlt sporangiumot nevezzük tömlőnek vagy aszkusznak, a benne kifejlődött spórákat pedig aszkospóráknak.

a sordaria fimicola szexuális szaporodási ciklusa

2.1. ábra A Sordaria fimicola szexuális szaporodási ciklusa. A Sordaria fimicola életciklusa során az szkospórákból, hifák keletkeznek, melyeken a szexuális szaporodás során , kialakulnak a kép közepén látható termőtestek (peritéciumok), az aszkospórákat tartalmazó aszkuszokkal.

Sordaria nemzettségben és néhány más fajnál a spórák kialakulása szigorúan lineáris elrendeződésben történik az aszkuszban (2.2. ábra). Az ilyen lineáris elrendezésű tetrádokat, oktádokat rendezett tetrádoknak, oktádoknak nevezzük, a spórákat nem lineáris rendben tartalmazó tetrádokat nem rendezetlen tetrádoknak nevezzük. Nem rendezett tetrádokat alakít ki például az élesztő (2.3. ábra).

A rendezett oktádok kialakulása

2.2. ábra A rendezett oktád kialakulása. A diploid (2n) zigótából a meiózis során 4 (valójában 8) haploid (n) sejt keletkezik. A sejtmagokat lila gömbök jelölik. A második meiótikus osztódás után a tetrádból egy meiózissal alakul ki az oktád. A sejtek érése után kialakul a nyolc aszkospórát tartalmazó aszkusz. A végtermékben (aszkusz) a keletkezett haploid sejtek rendezetten helyezkednek el, pozíciójuk és fenotípusuk világosan mutatja a meiózis során fellépő homológ rekombinációs eseményeket vagy azok hiányát.

nem rendezett tetrádok, oktádok

2.3. ábra Nem rendezett tetrádok, oktádok. A nem rendezett tetrádokat, oktádokat kialakító fajokban (pl.: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) a tetrádok helyzete nem kötött, így azok helyzete nem hordoz információt. Ezek a rendszerek nem alkalmasak a meiotikus események (homológ rekombináció folyamtána) pontos követésére.

Térképezés a tetrádelemzés során

A tetrádanalízis során vizsgálható két gén távolsága és egyedülálló módon (igaz csak a rendezett tetrádok esetében, lásd később) egyetlen gén és centromeronjának távolsága is.

Monohibrid (egy génes) keresztezés elemzése

A következőkben kövessük nyomon egy kiválasztott gén (A) két alléljának (A, a) sorsát a meiózis során. (Természetesen az Aa genotípusú zigóta az A×a keresztezés eredményeként jön létre.) Ha a meiózis során nem történik crossing over a vizsgált gén és centromeronja között, a gén két allélja már az első meiotikus osztódás során külön sejtekbe kerül, ezt nevezik első osztódásos szegregációnak (MI) (2.4. ábra). Ezért az oktád első négy sejtje az egyik, második négy sejtje a másik allélt tartalmazza, a spórák mintázata az aszkuszban 4:4 (első osztódásos szegregációs mintázat, MI).

első osztódásos szegregáció

2.4. ábra Első osztódásos szegregáció a tömlősgomba meiózisa során. Első osztódásos szegregációró akkor beszélünk, amikor nem történ a meiózis során átkereszteződés (crossing over) a vizsgált gén (A) és centromeronja között. Az első meiótikus osztódás után a két allél (A és a) elvállnak egymástól, különböző utódsejtekbe kerülnek. Az érett aszkuszban a spórák mintázat 4:4.

Abban az esetben, ha crossing over történik a gén és centromeronja között, a két allél csak a második meiotikus osztódást követően kerül különböző sejtekbe, ezt nevezik második osztódásos szegregációnak (MII) (2.5. ábra). A spórák mintázata ebben az esetben többféle lehet attól függően, hogy mely kromatidák vettek részt a crossing overben. Kialakulhat kétféle 2:2:2:2 és kétféle 2:4:2 mintázat (rím), ezeket nevezzük második osztódásos szegregációs mintázatoknak (MII).

második osztódásos szegregáció

2.5. ábra Második osztódásos szegregáció. Amikor a heterozigóta zigóta miózisa során crossing over történik a vizsgált gén (A) és centromeronja között második osztódásos szegregációról beszélünk. A két allél (A és a) az első meiótikus osztódás után még nem válik szét, a sejtekben mindkét allél megtalálható. Az allélek a második meiótikus osztódás során válnak szét. Az érett aszkuszban a spórák mintázata 2:2:2:2 lesz.

Megfordítva a leírtakat, ha 4:4-es elrendeződésben látjuk a spórákat, tudjuk, hogy nem történt crossing over a vizsgált gén és centromeronja között az adott tetrád kialakulása során, ha eltérő mintázatot kapunk biztosak lehetünk benne, hogy történt átkereszteződés a meiózis során. Ez a tény teszi lehetővé számunkra egy gén és centromeronja közti távolság kiszámítását, annak ellenére, hogy egyetlen gén vizsgálatakor nem tudjuk egy spóráról megállapítani, hogy rekombináns vagy sem, de az aszkuszokról megállapítható, hogy crossing over történt-e kialakulásakor.

Hogyan számoljunk hát? Azt tudjuk, hogy a térképtávolság, rekombinációs gyakoriság meghatározásához az alábbi képletet használjuk.

, (emlékeztetőül: a térképtávolság nem a rekombinánsok, hanem a crossing overek számával egyenesen arányos). Azon aszkuszokban, melyek MII mintázatot mutattak crossing over történt a meiózis során. Ezen aszkuszokban az utódok felében található rekombináns kromoszóma. Tehát az MII mintázatú aszkuszok számát megszorozzuk nyolccal (minden aszkuszban 8 spóra található!), és osztjuk kettővel (a 8 spóra felében van rekombináns kromoszóma) vagyis: 

 Az így kapott összeget osztjuk az összes aszkusz számának nyolcszorosával (8 spóra található aszkuszonként). Matematikailag rendezve az eddigieket kapjuk a következő képletet:

            

Dihibrid (kétgénes) keresztezés elemzése

Dihibrid keresztezés végzésekor meghatározható a két gén kapcsoltsági viszonya, ha kapcsoltak távolságuk, illetve mindkét gén centromerontól mért távolsága. Vagyis kapcsolt gének esetén eldönthető, hogy a kromoszóma azonos karján vagy különböző karokon találhatóak-e a vizsgált lokuszok.

Kétgénes térképezés esetében a monohibrid keresztezéskor megfigyeltnél több eltérő mintázat alakulhat ki. A lehetséges mintázatokat három csoportba sorolhatjuk (2.6. ábra):

Parentális ditípus (PD): csak a szülőivel megegyező (szülői típusú) feno/genotípusú spórát tartalmaz.

Nem parentális ditípus (NPD): csak a szülőitől eltérő kombinációjú (rekombináns) spórát tartalmaz.

Tetratípus (T): mind a négyféle spórát tartalmazza.

különböző aszkusztípusok

2.6. ábra Aszkusz szín fenotípusok. Aszkusztípusok dihibrid keresztezés után sárga és barna spórájú törzsek keresztezése után kialakuló aszkusztípusok sorrendben: PD, NPD, T, T, T, PD, NPD.

Kapcsolt gének

Kapcsolt gének esetén, ha a meiózis során nem történik crossing over, a vizsgált két gén között PD aszkuszokat kapunk. Ha egy átkereszteződés történik a két gén között mindig T aszkuszok alakulnak ki (7. és 8. ábrák). Ha a gének között két crossing over történik, attól függően, hogy mely kromatidák vettek részt az átkereszteződésekben, kaphatunk PD, NPD és T aszkuszokat is. Belátható, hogy ha a két átkereszteződés azonos két kromatida között játszódik le, visszakapjuk a szülői elrendezést, tehát az aszkusz parentális ditípusú lesz. A három kromatida között végmenő két crossing over T, négy kromatida átkereszteződés esetén NPD aszkusz alakul ki.

dihibrid keresztezés, kapcsolt gének esetén

2.7. ábra Dihibrid keresztezés, kapcsolt gének esetén (a). Két kapcsolt gén (a, b) keresztezése során három fő aszkusztípus alakulhat ki: parentális, nem parentális ditípus és tetratípus. Ha a meiózis során nem történik crossing over a két vizsgált gén között PD, ha egy crossing over történik TT, ha két crossing over történik attól függően, hogy mely szálak vesznek részt az átkereszteződésekben mindhárom aszkusztípus kialakulhat. Az ábrán a két crossing over során kialakuló aszkusztípusokból az NPD és a TT látható.

dihibrid keresztezés kapcsolt gének esetén

2.8. ábra Dihibrid keresztezés, kapcsolt gének esetén (b). A 7. ábrához hasonlóan itt is két kapcsolt gén (a és b) keresztezését ábrázoltuk. Látható, hogy két crossing over (DCO) háromféle aszkusztípust hozhat létre: ha két kromatida vesz részt az átkereszteződésekben PD, ha három TT, ha négy NPD aszkusz alakul ki. (NCO: nem történt crossing over, SCO: egyetlen crossing over történt, DCO: két crossing over történt a vizsgált gének között a meiózis során).

Ha feltételezzük, hogy minden kromatida egyforma valószínűséggel vesz részt a crossing overekben és felvázoljuk, hogy mely kromatidák átkereszteződése milyen típusú aszkuszhoz vezet (1. táblázat), beláthatjuk, hogy a kettős crossing overrel kialakult aszkuszok aránya 1PD:2T:1NPD.

1. táblázat. Két crossing over esetén kialakuló aszkusztípusok.

1 – 3

1 – 4

2 – 3

2 - 4

1 – 3

PD

T

T

NPD

1 – 4

T

PD

NPD

T

2 – 3

T

NPD

PD

T

2 - 4

NPD

T

T

PD

A különböző típusú aszkuszok számának ismeretében meghatározhatjuk két gén távolságát. A monohibrid keresztezéshez hasonlóan most is aszkuszokat számlálunk meg, nem pedig egyes spórákat. Láttuk, hogy PD és T aszkuszt kétféleképpen is kaphatunk (az eltérő módon kialakuló azonos típusú aszkuszokat nem tudjuk megkülönböztetni). NPD aszkusz azonban csak akkor alakul ki, ha két crossing over történt a gének között. Az egy átkereszteződés után kialakuló aszkuszok számát megkaphatjuk úgy, hogy a T aszkuszok számából levonjuk a NPD aszkuszok számának kétszeresét (ennyi T aszkusz keletkezett kettős crossing overrel) ez tehát T - 2NPD. A két átkereszteződéssel keletkezett aszkuszok számát a fenti táblázat alapján, úgy kaphatjuk meg, hogy a NPD aszkuszok számát szorozzuk néggyel (4NPD). 4NPD számú aszkuszban összesen 8NPD számú crossing over történt. Az összes crossing over száma tehát T - 2NPD + 8NPD = T + 6NPD. A rekombináció gyakorisága tehát az alábbi képlettel számolható (a monohibrid keresztezésnél levezetett gondolatmenet alapján osztunk az összes aszkusz számának kétszeresével):

  

Független gének

Független gének esetén a szabad kombinálódás miatt crossing over nélkül egyenlő arányban kapjuk a PD és NPD aszkuszokat (2.9. ábra). Egy átkereszteződés esetén T (2.10. ábra), kettő esetében PD, T NPD keletkezhet.

dihibrid keresztezés független gének, crossing over nélkül

2.9. ábra Dihibrid keresztezés, független gének esetén, crossing over nélkül. Ha a két vizsgált gén (a és b) különböző kromoszómákon találhatóak (függetlenek) Parentális ditípusú és nem parentális ditípusú aszkuszok egyforma valószínűséggel alakulhatnak ki, amennyiben nem történik crossing over a meiózis során.

dihibrid keresztezés, független gének, crossing overrel

2.10. ábra Dihibrid keresztezés, független gének esetén, crossing overrel. Ha a két vizsgált gén (a és b) függetlenek és a meiózis során egy crossing over történik (fent a gén és centromeronja, lent b gén és centromeronja között) tetratípusú aszkuszok alakulnak ki.

Ha két génről el akarjuk dönteni, hogy kapcsoltak-e, egyszerűen a PD és NPD aszkuszok arányát kell megvizsgálnunk: ha PD száma közelítően egyenlő NPD számával, a vizsgált gének függetlenek, ha PD jóval meghaladja NPD számát, a gének kapcsoltak, hiszen kapcsoltság esetén NPD mintázatot csak a kettős crossing over után kialakult aszkusszok negyede mutat. Ha eldöntöttük, hogy a két gén kapcsolt, a korábban megadott képlettel számolhatjuk ki a távolságukat. A gének és centromeronjaik távolságát pedig a monohibrid keresztezésnél leírtak alapján állapítjuk meg.

Nem rendezett tetrádok

Nem rendezett tetrádok esetén, mint korábban láttuk, nincs jelentése a spórák sorrendjének, ezért nem tudunk gén és centromeron közti távolságot számolni. Dihibrid keresztezés esetén azonban a rendezett tetrádokhoz hasonlóan megállapítható a három aszkusztípus és ezek alapján eldönthető a gének kapcsoltsága, és azonos képlettel számolható a gének távolsága is.

Génkonverzió

Az eddig megismert mintázatokon kívül kis százalékban megjelennek olyan aszkuszok is amelyek mintáza meglepő: 3:5, 6:2 arányban tartalmazzák a két allélt, illetve aberráns 4:4 mintázatúak (3:1:1:3), ahol „csak” a spórapárok tagjai térnek el egymástól (2.11. ábra). Az egyenlőtlen spórapár tökéletlenül párosodó DNS-szekvenciát jelez (mismatch), amelyben legalább egy bázispár inkorrekt: pl. AC, TG, AG, TC, stb.

génkonverziós aszkusz mintázatok

2.11. ábra Génkonverziós aszkusz mintázatok. A 4:4 es mintázattól eltérő aszkusz mintázatok magyarázata a génkonverzió jelensége. A 6:2, 2:6 és5:3, 3:5 aszkuszok esetén nem azonos arányban jelenik meg a két allél (m és +), vagyis a meiózis során az egyik allél átalakult a másikká. Az aberráns 4:4, vagyis 3:1:1:3 mintázatú aszkusz esetében pedig az eltérő fenotíusú spórapárok mutatják a génkonverziót.

Az ilyen úgynevezett heteroduplex DNS-ek javítását általában a mismatch (nem megfelelő bázisok párosodása a DNS két antiparallel lánca között) repair (javítás) rendszer javítja. A tetrádban a mismatch kijavítása értelemszerűen az egyik vagy másik szál (javított) genetikai tartalmának elvesztéséhez vezet, ill. az ellentétes szál (javító) genetikai tartal­mának megduplázódásához. A javított DNS kettős spirál replikációja azonos genetikai tartalmú utód kettős spirálokhoz vezet, amelyet mint spórapárt ész­lelünk az aszkuszban - azonos genotípussal.

A fenti megfontolások után az aberráns tetrádokat jól értelmezhetjük: az ilyen tetrádban heteroduplex kromatidáknak kellett keletkezni a meiózis első osztódása (profázis) során, s a mismatch javítása vezet az allélok eltűnéséhez, illetve fölös számú megjelenéséhez. Ezt a jelenséget génkonverziónak (allélek egyirányú – nem reciprok – kicserélődése; az egyik allél a maga képére alakítja a másik allélt) nevezzük. A génkonverzió jelensége (amelyet közvetlenül tudunk detektálni a tetrádok elemzésével) sérti Mendel szegregációs alapelvét. Ez az alapelv azt mondja ki, hogy a meiózis során keletkezett 4 haploid sejtben (gaméta) a gének fele anyai, a másik fele apai eredetű lesz (az allélek függetlenül kombinálódnak, tehát az egyik az egyik utódsejtbe, a másik a másik utódsejtbe szegregálódik). A kérdés akkor válik jelentőssé, ha arra gondolunk, mennyire univerzális jelenség a génkonverzió. Csupán néhány gombában detektálható, vagy a többi élőlényben is inherensen megfigyelhető a homológ rekombináció során?

A 6:2, illetve 2:6 tetrádokban két mismatch kromatida keletkezett, ame­lyeket a javító enzimek azonos módon javítottak ki. Az 5:3, illetve 3:5 esetekben ismét két mismatch kromatida keletkezett, de ezek közül csak az egyiket javította ki a javító rendszer.

Az egyenlőtlen spórapár jelenségét posztmeiotikus szegregálásnak nevezik, mert a meiotikus osztódást követő replikáció, illetve mitózis következtében válik genetikailag önállóvá az eredeti mismatch két tagja. Az aberráns 4:4 esetekben az eddigiek alapján belátható, hogy a két mismatch kromatida egyik tagjában sem történt javítás: az eredmény két egyenlőtlen spórapár az aszkusz két másik, azonos genotípusú spórapárja mellett.

Javításkor a hibajavító enzimek elméletileg bármely szálat használhatják templátul, ám elképzelhető, hogy valamelyik allélt nagyobb valószínűséggel (preferáltan) javítják, mint a másik allélt (biased gene conversion). Fontos felhívni a figyelmet, hogy a hibajavítás irányától függően egyes allélek előfordulása kisebb, másoké nagyobb lehet az utódpopulációban, mint a szülőiben (3:5, 2:6 arányok).

A génkonverziók megfigyelése a tetrádanalízis során fontos felfedezés volt, amely elősegítette a homológ rekombináció molekuláris modelljeinek kidolgozását.