Homológ rekombináció molekuláris modelljei

A homológ rekombináció molekuláris szintű magyarázatára több elmélet született. A továbbiakban két modellt ismertetünk ezek közül: a Holliday modellt, illetve a ma leginkább elfogadott DSBR (double strand break repair), vagy magyarul kettős szálú DNS törés javító modellt. A két modellnek több közös pontja van: mindkettő feltétele hosszabb homológ szakaszok jelenléte, mindkettőben szerepet játszik a DNS szálak törése (igaz jelentősen eltérő módon) és újraegyesülése (szálcsere), mindkettőben létrejön az úgynevezett kereszthíd (Holliday) struktúra, amely képes elmozdulni a (vándorlás; branch migration), illetve amelynek eltérő feloldási lehetőségei vannak.

A Holliday modell

A Holliday modell ismertetésekor a rekombinációban részt vevő két DNS dupla hélixet általában úgy ábrázolják, hogy két azonos polaritású szál kerül egymás mellé (2.12. ábra). Az ábrán tehát csak négy DNS szálat tüntettünk fel, a kromoszóma másik két kromatidáját nem jelöltük. A folyamat első lépéseként mindkét DNS kettős spirál egy-egy szála azonos helyen (azonos nukleotidok között) elhasad. A DNS szálak ezután átkereszteződnek (strand exchange), majd kovalensen kötődnek (ligálódnak). Így alakul ki a kereszthíd, vagy más néven a Holliday struktúra. Ez a folyamat nem igényel DNS szintézist. A kialakult kereszthíd bármely irányba elmozdulhat, ezt nevezik kereszthíd vándorlásnak (branch migration). Ez a vándorlás jelenti a modell lényegét. Megfigyelték ugyanis, hogy a rekombináció sosem pontszerű esemény, hanem mindig kiterjedése van, azaz a DNS molekula egy szakaszát foglalja magába. Az elmozdulás során (ha a két kromoszóma között allélikus/szekvenciális különbség volt) az adott szakaszon heteroduplex DNS alakul ki (a DNS molekula egyik szála az egyik homológból, a másik szála a másik homológból származik). Érdemes megjegyezni, hogy ha a két allél különbözött, ott heteroduplexben mismatchek alakulnak ki. A heteroduplex DNS a hasítás helyétől a kereszthídig tart. A két szabad kromatida visszanyeréséhez a DNS-t el kell hasítani, ezt a Holliday szerkezet feloldásának (resolution) nevezik. A feloldás folyamatának megértését nagyban segítik a szerkezet térbeli ábrázolása, vagyis a DNS kitekerése és 180°-os elforgatása. Mint látható, a Holliday struktúra kétféle (egymásra merőleges) hasítással oldható fel, ezek előfordulásának valószínűsége azonos/ezek egyforma valószínűséggel következnek be – a szálekvivalencia elvének megfelelően. Mint látható, az egyik hasítási irány eredményeként rekombináns kromoszómák (crossing over termék; ezt nevezik splice-nak is), a másik hasítás során nem jön létre rekombináns kromoszómák (nem keletkezik crossing over termék; ún. patch keletkezik). Mindkét termék/kromoszóma tartalmaz egy-egy génkonverziós régiót, amely hossza a szálvándorlás hosszától (heteroduplex) függ.

Holliday modell

2.12. ábra A Holliday modell. A Holliday modell legfontosabb elemei az egyszálú DNS hasítás, a Holliday struktúra kialakulása, a kereszthíd vándorlása, és a szálak különböző hasítási módjai. A Holliday struktúra hasítása után rekombináns és nem rekombináns terméket is kaphatunk, de mindkettő tartalmaz heteroduplex régiót.

A DSBR modell

A DSBR (kettős szálú törést javító modell; Szostak JW, Orr-Weaver TL, Rothstein RJ, Stahl FW. The double-strand-break repair model for recombination. Cell 33: 25-35, 1983) már első lépésében lényeges eltérést mutat a Holliday modelltől: az egyik DNS kettős spirál (homológ) mindkét szála eltörik egy enzim (Spo11) segítségével, tehát aktív módon, míg a másik DNS molekula (homológ) végig intakt marad (2.13. ábra). Valójában az intakt szál biztosítja az eltört DNS molekula javításához szükséges intakt genetikai információt. Ezután a DNS 5’ végei emésztődnek, így 3’ túlnyúló végek keletkeznek, melyet támadó szálnak is neveznek. Az egyik 3’ egyszálú DNS szál és a homológ kromoszóma két szála háromszálú DNS struktúrát hoz létre (D-hurok). Ezt követően egy újabb lényegi eltérés következik: a 3’ végeken DNS szintézis kezdődik. A DNS szintetáz primerként a 3’ a szálat használja a replikáció során, templátként a homológ kromoszóma megfelelő polaritású szálát. (Ha a törés közelében allélikus/szekvencia különbség volt a homológok között, annak információja az emésztés, majd a homológról történő pótlás során elveszhet. Ilyenkor génkonverzió történik javítás nélkül.) A szintézist követően a megfelelő polaritású szálak közt kovalens kötés alakul ki, ennek eredményeként két Holliday szerkezet keletkezik. Mindkét Holliday szerkezet szabadon elmozdulhat a DNS mentén (kereszthíd vándorlás). Két Holliday struktúra négy módon is feloldódhat/hasítódhat. Itt is kétféle: crossover (rekombináns) és nem crossover (nem rekombináns) terméket kaphatunk, és itt is megfigyelhetünk génkonverziós (azaz heteroduplexet tartalmazó) szakaszokat.

A DSBR modell

2.13. ábra A DSBR modell. A DSBR modell első lépésében egyik DNS mindkét szála hasítódik. Az 5’ végek emésztésével 3’ egyszálú DNS szálak keletkeznek. Fontos, hogy ebben a modellven új DNS szintézis történik. Két kereszthíd alakul ki amelyek ebben a modellben is többféleképpen oldódhatnak fel. Baloldalon a nem rekombináns, jobb oldalon a rekombináns termék kialakulását ábrázoltuk. Mindkét esetben (rekombináns, nem rekombináns) génkonverziós szakaszt (egy DNS két szála eltérő színnel jelezve) tartalmaz.

A homológ rekombináció folyamán tehát mindig történik génkonverzió (az eltört DNS szál „kifoltozása” a homológ információja alapján – az egyik allél a saját képére alakítja a másik allélt; nem reciprok kicserélődés). A génkonverzió a rekombináció alapvető eseménye. Vegyük észre, hogy a génkonverzió rekombináns kromoszómákat (amilyen nem volt a szülői kombinációkban) eredményez. A génkonverziót vagy követi, vagy nem követi crossover esemény (a határoló szekvenciák reciprok kicserélődése). A génkonverzió és a crossing over tehát függetlenül szabályozott folyamatok a homológ rekombináció során.

A két modellen kívül több elmélet is született (pl.: Meselson Raddig) a homológ rekombináció molekuláris lépéseiről, illetve a DSBR modellnek más útvonalai is ismertek (SDSA; single DNA strand annealing – egy DNS szálat másoló), de ezek ismertetésétől most eltekintünk.

A homológ rekombináció enzimjei

A homológ rekombinációt biztosító fehérjék egy részét már megismerték, jellemezték mind prokariótákban, mind eukariótákban, ezeket ismerteti a 2. táblázat.

2. táblázat. A meiotikus homológ rekombinációban résztvevő enzimek.

Funkció

Prokarióta

Eukarióta

Dupla törés

Nem ismert

Spo11

Egyszálú DNS kialakítása

RecBCD

helikáz/nukleáz

MRX komplex

(Rad50, 58, 60)

Támadás (invázió)

RecA

Dmc1, Rad51

Szálvándorlás

RuvAB

Nem ismert

Feloldás

RuvC

Mus81 és mások

Prokariótákban részletesen tanulmányozott a RecA és RecBCD fehérjék szerepe. A RecBCD három fehérjéből álló komplex, mely helikáz és nukleáz aktivitással is rendelkezik, a 3’ túlnyúló végek kialakításáért felelős. A recBCD kettős szálú töréseket ismer fel, majd mindkét szálat degradálja, amíg egy speciális, úgynevezett chi (crossover hotspot instigator) szekvenciáig nem ér. A chi szekvencia után már csak a chi-t nem tartalmazó szálat emészti, így alakul ki a 3’ egyszálú DNS. A Chi szekvenciája E. coli-ban: GCTCGTGG. A chi jelentőségét a rekombinációs forrópontok vizsgálatakor fedezték fel, ugyanis E. coli-ban a rekombináció preferált helyeken kezdődik, Chi szekvenciák környezetében a rekombináció valószínűsége 10 nagyobb, mint máshol.

RecA. A RecA fehérje egyszálú DNS-hez kötődik kooperatívan (hasonlóan a SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein) fehérjéhez). Aktív formája az akár 100 RecA fehérjét is tartalmazó nukleoprotein filamentum (vö.: legtöbb fehérje: mono-, di-, tetra-, hexamer formában aktív). A RecA filamentumban egy egyszálú és egy kétszálú DNS kötődhet, tehát itt alakul ki a háromszálú DNS szerkezet, illetve a szálcsere is.

A kereszthídak vándorlásáért a RuvAB komplex felelős. A RuvA a Holliday szerkezetét ismeri fel specifikusan. A RuvB helikáz aktivitással rendelkezik, és a szálvándorlást katalizálja.

RuvC nukleáz aktivitású fehérje, nevezik rezolváznak is. E fehérje is a Holliday szerkezetet ismeri fel majd hasítja, vagyis feloldja azt.

Prokariótákban a homológ rekombináció elsősorban hibajavító szereppel rendelkezik, illetve lehető teszi a sejtbe bejutó (pl. transzdukcióval, konjugációval) „idegen” DNS-ek beépülését a kromoszómális DNS-be.

Eukariótákban ismert egy DNS kettősszálú hasítását végző fehérje, amely a homológok párba állásakor aktív, ez a Spo11. A kettős szálú hasításhoz két fehérje szükséges, melyek egy-egy szálat vágnak el, majd a hasítás után a kovalensen kötődnek a DNS lánchoz.

Az 5' végek emésztését az MRX komplex végzi, az egyszálú DNS-hez a Rad51 illetve a Dmc1 fehérjék kötődhetnek. Természetesen az említett fehérjéken kívül még számos más (itt nem részletezett) fehérje vesz részt a rekombináció folyamatában.

Eukariótákban a homológ rekombináció esszenciális a meiózis alatt, a kromoszómák tökéletes párosodásához, ezen keresztül a genom integritásának fenntartásához nélkülözhetetlen. A rekombinációs fehérjék hibája gyakran csökkenti a fertilitást. A meiózis mellett a homológ rekombináció enzimjei (kivéve természetesen a spo11-t) fontos szerepet játszanak a duplaszálú törések javításában (rekombinációs hibajavítás). A homológ rekombinációnak fontos szerepe van még más folyamatokban, mint például az élesztők párosodási típus váltása.