A gyakorlat menete

Felhasznált anyagok, eszközök:

  • Sordaria fimicola törzsek: 2918 (vad), 2800 (tan) , 2807 (yellow)

  • Sordaria táptalajok (Ø 5,5 cm-es Petri csésze)

  • alkohol

  • lándzsatű

  • tárgylemez

  • fedőlemez

  • cseppentő

A keresztezés

A gyakorlat során a haploid Sordaria fimicola törzzsel foglalkozunk. A Sordaria fimicola homotallikus, egy telepen belül helyezkednek el a hím és női ivarú szaporító képletek, így fenntartása egyszerű.

Három törzs felhasználásával végezzük a kísérleteket:

  • 2918 jelű törzs: vad típusú, fekete spórájú

  • 2800 jelű törzs: tan génben mutáns, barna spórájú

  • 2807 jelű törzs: yellow génben mutáns, sárga spórájú

A gyakorlaton a három törzs felhasználásával vizsgálható mono- és dihibrid keresztezés is. Monohibrid kísérlet esetén a vad típust keresztezzük valamely mutánssal (2918 x2 800 vagy 2918 x 2807), míg dihibrid kísérletek esetén az egyszeres mutánsokat keresztezzük egymással (2800 x 2807).

A gyakorlat során párokban dolgozunk. Magát a keresztezést Sordaria táptalajon végezzük, négy részre osztva a táptalajt leoltjuk fogpiszkáló vagy lándzsatű segítségével törzseket (2.14. ábra). Átlósan oltjuk az azonos törzseket (2.14. ábra), így az érintkezési felületeken (az ábrán szürke pontozott rész) összenövések lehetségesek. Itt mehet végbe a tényleges kereszteződés.

A Sordaria fimicola leoltása

2.14. ábra A Sordaria fimicola leoltása keresztezéshez. A Sordaria fimicola-t leolthatjuk kis agarkockák kivágásával és friss táptalajra helyezésével. Leolthatunk két (jobb oldalt) illetve négy kockát (bal oldalon) is egyetlen lemezre. A különböző genotípusú törzseket (tn, +) egymás mellé oltva köztük kereszteződési zóna (sűrűn pöttyös) alakulhat ki. A kialakuló peritéciumakat az apró fekete pöttyök jelzik.

Ezután napfényes meleg helyen, esetleg kivilágított termosztátban növesztjük a törzseket egy héten át. A törzsek három-négy nap elteltével érik el egymás területét és nőnek össze, majd az összenövési helyeken képesek szexuális szaporodása (génkicserélésre). További három-négy napot igényel a spórák beérése és a megfelelő mennyiségű melanin (színanyag) képzése (2.15. ábra).

A Sordaria fimicola életciklusa

2.15. ábra A Sordaria fimicola életciklusa. 0. nap: a spóra 4 óra elteltével hifát képez, 1. és 2. nap: telepnövekedés, 2. nap végére az átellenes telepek összeérnek. 3.-4. nap: aszkuszképzés a telepeken, 8.-9. nap: spóraképzés az aszkuszokban, 12. nap: spórák kikerülése.

Rekombináció megfigyelése

Mindezen ismeretek tudatában az összenövési területről érdemes lándzsatűvel mintát venni a telep felszínét megkapargatva. A mintát tárgylemezen elhelyezkedő vízcseppbe juttatjuk és fedőlemezzel fedjük le. Ezután finoman az ujjunkkal megnyomjuk a fedőlemezt, hogy a peritéciumokból kijussanak a spórák. Ezt a műveletet óvatosan érdemes végezni, mert túlzott erőkifejtés hatására a felnyílnak az aszkuszok és nem határozható meg a spórák sorrendje, mely pedig elengedhetetlen a feltételezett rekombinációk vizsgálatához. A mintát mikroszkóp segítségével 40x-es nagyításom vizsgáljuk. Az aszkuszon belül a spórák mintázata bizonyítja a rekombináció tényleges kialakulását

A gyakorlat pontokba szedve

1. hét: Keresztezések összeállítása

  1. Páronként egy Petri csészét kiválasztanak. A Petri csésze alját megjelölik. (Páronként egy keresztezést végeznek (szabadon választott), de minden csoportban mind a három lehetséges keresztezést összeállítják.)

  2. Steril fogpiszkáló vagy lándzsatű segítségével kis négyzetet vágnak ki a választott törzs micéliumait tartalmazó táptalajából.

  3. Az agar kockákat új táptalajra helyezik, az ábrának megfelelő, átlós elrendezésbe.

  4. Megismétlik a másik választott törzzsel.

  5. A Petri csészéket a gyakrorlóban növesztjük egy héten keresztül, szobahőmérsékleten, napfény mellett.

2. hét: Aszkuszok vizsgálat, rekombináció felismerése

  1. A keresztezéses lemezeken érett peritéciumokat keresünk (kis fekete mák szemek) a két törzs találkozási területén.

  2. Tárgylemezre egy csepp vizet cseppentünk.

  3. Steril fogpiszkáló vagy lándzsatű segítségével 10-12 peritéciumot helyezzünk a vízcseppbe.

  4. Fedőlemezzel lefedjük. A fedőlemezt ujjunkkal, vagy a citológia gyakorlaton alkalmazott módszerrel, ceruza véggel, enyhén, de határozottan megnyomjuk. A cél, hogy a peritéciumokból az aszkuszok kiszabaduljanak, de ne repedjenek fel (2.16. ábra).

  5. A mintákat fénymikroszkóp alatt vizsgáljuk, először kis nagyítással.

  6. Az aszkuszok mintázatát megfigyelve, rekombinációt (esetleg génkonverziót) keresünk (2.17., 2.18., 2.19 ábra).

Peritéciumok és aszkuzscsokrok

2.16. ábra Peritéciumok és aszkuszcsokrok. Az érett peritéciumok enyhe nyomás hatására felrepednek és kiszabadulnak az aszkuszok

dihibrid keresztezés aszkusz mintázatai

2.17. ábra Dihibrid keresztezés aszkuzs mintázatai. A képeken sárga és barna színű spórákat termelő törzsek keresztezéséből kapott aszkuszok láthatóak. Megfigyelhetőek a PD (barna és sárga spórákat tartalmazó), a NPD (fehér és fekete) és a TT (mind a négy színű spórát tartalmazó) aszkusztípusok.

      

monohibrid tetrádok

2.18. ábra Monohibrid tetrád mintázatok Vad típusú törzset mutánssal (például yellow) keresztezve a spórák színét vizsgálva a következő mintázatukat figyelhetjük meg: 4:4, 2:4:2, 2:2:2:2.

 

génkonverzió

2.19. ábra A génkonverzió kimutatása. A 2:2:2:2 tetrád mintázat helyett 1:1:1:1:2:2 (bal oldali panel), 1:1:1:1:2:2 (középen) és 1:1:1:3:2 (jobb oldali panel) mintázatok láthatók.