3. fejezet - Drosophila genetika - géntérképezés

Dr. Vellainé Takács Krisztina egyetemi adjunktus

Billes Viktor PhD hallgató

ELTE TTK Biológiai Intézet, Genetikai Tanszék

Tartalom

Drosophila melanogaster mutánsok bemutatása és felismerése
Az ecetmuslica életciklusa, a vad típus bemutatása, a nemek elkülönítése
Mutánsok felismerése és jellemzése
A gyakorlat kivitelezése
Mendeli monohibrid, dihibrid öröklésmenetek, ivari kromoszómán lokalizált gének öröklődése, kapcsoltság és hárompontos térképezés vizsgálata Drosophila melanogasteren
F2 analízis: mendeli monohibrid, dihibrid öröklésmenetek, ivari kromoszómán lokalizált gének öröklődése
2.B rész: Kapcsoltság és hárompontos térképezés

Drosophila melanogaster mutánsok bemutatása és felismerése

A gyakorlat célja: a Drosophila melanogaster, mint genetikai modellorganizmus bemutatása, hímek és nőstények elkülönítése valamint mutánsok felismerése

Az ecetmuslica életciklusa, a vad típus bemutatása, a nemek elkülönítése

Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) a genetikusok egyik elsőként alkalmazott modellállata. Az 1900-as évek elején Thomas Hunt Morgan és tanítványai használták először, és segítségével az öröklődés alapvető törvényszerűségeit (kromoszóma elmélet bizonyítása, nemhez kötött öröklődés, kapcsoltság) tárták fel. Morgan munkásságát 1933-ban orvosi Nobel-díjjal jutalmazták, első olyan kutatóként, akinek nem volt orvosi végzettsége.

Az ecetmuslica rendelkezik mindazokkal a tulajdonságokkal, amelyek a genetikai modellorganizmusokat, mint kísérleti objektumokat jellemzik: laboratóriumban könnyen fenntartható, tenyészideje rövid (25oC-on 10 nap), utódszáma nagy (egy szülőpárnak több száz utódja lehet), a hímek és a nőstények egyszerűen elkülöníthetők, vonalai jól keresztezhetők valamint a morfológiai sajátságok jól jellemezhetők, és nagy következetességgel öröklődnek.

A Dipterák közé tartozó Drosophila teljes átalakulással fejlődő rovar, azaz Holometabola. A megtermékenyített petékből 25oC-on kb. 24 óra elteltével kelnek ki az első stádiumú (L1) lárvák, melyek szintén kb. egy nap elteltével vedlenek, és második stádiumú lárvákká (L2) fejlődnek. Az L2 stádiumot újabb 1 nap elteltével vedlés és az L3 stádium követi, amely hozzávetőleg két napig tart. Az L3 stádium végén az állatok bebázódnak, majd kb. öt nap múlva kelnek ki a kifejlett imágók (3.1. ábra). Ezek az adatok a 25oC-on történő tenyésztéskor érvényesek. A hőmérséklet csökkentése a tenyészidőt növeli. Egy nőstény imágó a 10 heti élettartam alatt 3000 petét képes lerakni.

A Drosophila genom mérete 180 Mbp, a teljes genom szekvenciáját 2000-ben határozták meg. A muslica genom jelenlegi becslések szerint kb. 14000 gént tartalmaz, ami az emberben található gének számának a fele (jelenleg annotálva 13601). Az ecetmuslica 4 kromoszómapárral bír, három autoszóma- és egy ivari kromoszómapárral. Az 1. kromoszóma a metacentrikus X kromoszóma, mellette 2 nagy metacentrikus (a 2. és a 3.), és 1 kis akrocentrikus autoszómája van (4.). Az XX egyedek nőstények, az XY egyedek hímek. Az Y kromoszómán nincsenek a túléléshez esszenciális gének, azaz az Y kromoszómát nélkülöző (X0 genotípusú) hím egyed is él, de terméketlen (az Y-kromoszómán a hímek fertilitásához szükséges gének lokalizálódnak).

Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) életciklusa és fejlődési stádiumai

3.1. ábra: Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) életciklusa és fejlődési stádiumai

A gyakorlaton bemutatott törzsek „tiszta vonalak”, amelyek nemzetközileg elismert törzsgyűjteményekből származnak. Vad típusként az Oregon vonalat használjuk (3.2. ábra). A vad típusú musli(n)ca testszíne sárgás-barna, szeme kerek, téglavörös színű, szárnya egyenes lefutású, ép szélű, jellemző erezettel, fekete színű szőrzete testre simuló.

A Drosophila hím és nőstény imágók közötti legszembetűnőbb különbséget a külső genitáliák mutatják (elsődleges nemi bélyeg). Ezen kívül a két nem egyedei egymástól jól megkülönböztethetők a potroh alakja és pigmentáltsága alapján. A nőstény potroha kövérebb, felülnézetben kerekebb, a végén kihegyesedő; a hím potroha keskenyebb, a vége pedig lekerekített. A hímek potrohának utolsó két háti lemeze teljesen fekete, ellentétben a nőstényekkel, ahol sötét pigmentációt csak a háti lemezek poszterior részén figyelhetünk meg. A hímek elkülönítésére használatos bélyeg a szexfésű is, amely a hímek első pár lábán található, kitin fogacskákból álló képlet; a nemek azonosítását sztereomikroszkóppal végezzük. A hímek és nőstények közötti különbségeket a 3.2. ábrafoglalja össze.

Vad típusú (Oregon törzsből származó) hímek, nőstények és szüzek elkülönítése

3.2. ábra: Vad típusú (Oregon törzsből származó) hímek, nőstények és szüzek elkülönítése. A külső genitáliák mutatják a legszembetűnőbb különbséget a két nem között. A hímek potroha keskenyebb, a vége pedig lekerekített. A nőstény potroha kövérebb, a végén kihegyesedő. A hímek potrohának hat, a nőstényekének nyolc íze van. A hímek potrohának utolsó két háti lemeze erősen pigmentált. A hímek első pár lábán található a jellegzetes szexfésű. A keresztezésekhez feltétlenül szűz nőstényeket kell gyűjteni.

Mutánsok felismerése és jellemzése

A Drosophila kutatása immár több mint 100 éves múlttal rendelkezik, ma a muslica az egyik legalaposabban elemzett modell rendszer. Hermann Joseph Muller, aki Morgan tanítványa volt, felfedezte és elsőként használta ki a Röntgen-sugár mutagén hatását: mesterségesen, laboratóriumi körülmények között mutánsok sorozatait állította elő (1946-ban e kutatásaiért Nobel-díjat kapott). Ezzel megteremtette annak a különösen gazdag Drosophila „mutáns parknak” az alapjait, amellyel ma világszerte kb. 15000 kutató dolgozik, és amelyeket különböző törzsgyűjteményekben tartanak fenn.

A gyakorlat során betekintést nyújtunk a muslica mutánsok morfológiai változatosságába. A bemutatott mutáns allélek többsége recesszíven öröklődő, funkcióvesztéses (loss-of-function) vagy csökkent funkciójú (reduction-of-function), azaz hipomorf allél. Néhány dominánsan öröklődő mutáns allélt is tárgyalunk. A mutáns alléleket az általuk okozott fenotípus alapján csoportosítjuk: eszerint találkozunk szemszín és szemalak mutánsokkal, testszín és testalak mutánsokkal, szárnymutánsokkal valamint szőrmutánsokkal.

Szemszín mutánsok

A vad típusú Drosophila összetett szeme téglavörös színű, amelyet háromféle pigment anyag, a drosopterin, a xantommatin és a sepiapterin együttesen alakít ki. A gyakorlat keretében, látványosabb hatásuk miatt a drosopterin és a xantommatin szintézisének folyamatában résztvevő gének mutáns alléljaival foglalkozunk. A xantommatin barna színű szempigment, amelynek termelését enzimek sorozata végzi (3.3. ábra). Ha az említett enzimek valamelyike az őt kódoló gén funkciójának kiesése következtében nem működik, xantommatin nem termelődik, ezért ezekben a mutánsokban csak a másik két szempigment van jelen, így szemük élénkpiros színű. A vermilion (v), a cinnabar (cn) és a scarlet (st) gének tehát a xantommatin útvonal egyes enzimeit kódoló gének. A vermilion gén az 1. (azaz X) kromoszómán, a cinnabar a 2., a scarlet pedig a 3. autoszómán lokalizált. Mindhárom gén recesszíven öröklődő, a funkcióvesztéses mutánsai élénkpiros szemszínűek. Ezek a példák is mutatják, hogy a muslica gének elnevezése gyakran a funkcióvesztéses mutáns fenotípusára vezethető vissza.

A Drosophila szem pigmentjei és a szintézisükhöz kapcsolódó útvonalak

3.3. ábra: A Drosophila szem pigmentjei és a szintézisükhöz kapcsolódó útvonalak. A muslica összetett szemének téglavörös színét három szem pigment, a drosopterin, a sepiapterin és a xantommatin együttesen alakítja ki. A drosopterin útvonal egyik enzimjét kódolja a sepia (se) gén, a vermilion (v), a cinnabar (cn) és scarlet (st) gének pedig a xantommatin szintéziséhez szükséges enzimeket kódolják

Ha a drosopterin szintézisében funkcionáló gének valamelyike nem működik, akkor a drosopterin hiánya barna szemszínű mutánst eredményez, amelynek szemében csak xantommatin van jelen (3.3. ábra). A drosopterin útvonalban funkcionáló gének a 2. kromoszómán elhelyezkedő brown (bw), illetve a 3. autoszómán található sepia (se). A bw gén recesszív, funkcióvesztéses allélje vörösesbarna, a sepia gén kiesése pedig csokibarna színű szemet okoz. Ha olyan kettős mutánsokat állítunk elő (például st/st; bw/bw), amelyekben mind a xantommatin mind a drosopterin szintézise gátolt, akkor fehér szemszínű állatokat kapunk, amelyeknek szemében egyáltalán nem található pigmentanyag (3.4. ábra).

A drosopterin és a xantommatin útvonalakban funkcionáló gének kiesése következtében kialakuló mutánsok fenotípusai

3.4. ábra: A drosopterin és a xantommatin útvonalakban funkcionáló gének kiesése következtében kialakuló mutánsok fenotípusai. A xantommatin útvonal génjeinek (pl. scarlet, st) funkcióvesztéses mutánsai élénkpiros szeműek. A drosopterin útvonalban működő brown (bw) gén kiesése barna szemhez vezet. Ha mindkét útvonal sérül (pl. mind a st mind a bw gén működésképtelen), akkor fehér szemű kettős mutánst kapunk.

Fehér szemszínt eredményez Morgan és tanítványa, Calvin Bridges híres génjének, a white-nak (w) a funkcióvesztése is. A white génnel folytatott kísérleteik szolgáltatták az első meggyőző bizonyítékokat az X kromoszómához kötött öröklődésre. Mai tudásunk szerint a white gén egy ABC transzportert kódol, amelynek esszenciális szerepe van a szem pigmentek transzportjában. A w mutáns fehér szemű fenotípusa annak köszönhető, hogy a szem pigmenteknek a szemsejtek pigment granulumjaiba történő transzportja sérül. Megismerkedünk a white gén egy másik, hipomorf alléljával is, a white-apricottal (wa). A wa mutánsok szemszíne barackszínhez hasonlít, ezt a fenotípust a copia nevű transzpozon white génbe való beépülése okozza, amely csökkent transzporter funkcióhoz vezet. Érdemes a különböző szemszín mutánsokat egymással és a vad típussal összehasonlítva vizsgálnunk, a köztük lévő különbség igazán így látványos (3.5. ábra).

White, brown és vermilion mutánsok szemszíne összehasonlítva a vad (+) típussal

3.5. ábra: White, brown és vermilion mutánsok szemszíne összehasonlítva a vad (+) típussal

Szemalak mutációk

Az X kromoszóma 16A régióban található Bar régiónak a duplikációja homozigóta formában egy jellegzetes szemalakot, résszemet eredményez (erről már volt szó a citogenetika blokkban, Citogenetika, 3.11. ábra). A homozigóta Bar nőstények összetett szemében a facetták száma akár a tizede is lehet a vad típusú állatok facetta számának (ehhez hasonló a hemizigóta Bar hímek résszeme is). A duplikációt hordozó Bar allél domináns a vad alléllel szemben, jóllehet a heterozigóta (B/B+) nőstények szeme köztes fenotípust mutat (babalakú), és a facetta szám is a vad és a homozigótán megnyilvánuló résszem közé esik (3.6. ábra). Újabb kutatások szerint a Bar régióban a BarH1 gén duplikálódik, amely a fotoreceptor differenciációt gátló homeobox jellegű transzkripciós faktort kódol.

Az X kromoszóma Bar régiójának duplikációja résszemet hoz létre

3.6. ábra: Az X kromoszóma Bar régiójának duplikációja résszemet hoz létre. A homozigóta Bar (B/B) nőstények szemének facetta száma átlagosan közel a tizedére csökken a vad típusú (B+/B+) állatok szemében található 7-800 facettához képest. Heterozigóta (B/B+) nőstények szeme babalakú, facetta száma a vad és a homozigóta mutáns közé esik. Az Ultra-Bar mutáns nőstények (BD/B+) egyik X kromoszómáján a Bar régió normális dózisban található, a másik homológon viszont megháromszorozódott.

Az első, H. J. Muller által előállított balanszer kromoszóma az ún. Muller-5 balanszer (M5) volt (a balanszereket lásd alább). Az M5 homozigóták wa és B fenotípusúak, azaz résszeműek és a szemük barackszínű. Az M5 törzsben az X kromoszóma inverziók sorozatát hordozza, ezáltal gátolja a rekombinációt az X kromoszóma mentén. Azóta minden kromoszómának elkészültek a balanszeres változatai (kivétel a 4., az annyira kicsi, hogy alig kell rekombinációjától tartani). X-kromoszómás balanszeres kromomoszóma az FM (First Multiple) család tagjai, 2. kromoszómás a CyO és az SM (Second Multiple) család tagjai. 3. kromoszómások a TM-sorozat tagjai, melyek közül a leggyakrabban a TM3-t, és a TM6-t használják a kutatók. A balanszer kromoszómák sajátsága tehát, hogy azon a kromoszómán (vagy kromoszóma szakaszon), ahol genomi átrendeződést (inverziót, transzlokációt, stb.) tartalmaznak, elnyomják a crossing overt (pontosabban nem magát a crossing overt akadályozzák meg, hanem a crossing over után létrejött meiotikus termékek életképtelenek). Ezért a balanszer kromoszómák jól felhasználhatók letális mutációk (vagyis a csak heterozigóta formában életképes törzsek) fenntartására, hiszen balanszert alkalmazva a letális mutáció nem „veszhet el” a rekombináció során. Emellett a balanszer kromoszómák néhány kivételtől eltekintve (pl M5) homozigóta letálisak, és legtöbbször domináns marker mutációjuk (vagy mutációik) révén a balanszert hordozó egyedek azonosíthatóak. A M5 esetében a Bar marker mutáció az, ami megkönnyíti a balanszert hordozó (balanszírozott) egyedek felismerését és szelektálását.

Szemalak mutációk közé tartozik a Glazed domináns mutáció, ami tulajdonképpen a wingless/Wnt jelátviteli útvonal ligandumát kódoló génnek, a 2. autoszómán lokalizálódó winglessnek egy domináns, funkciónyeréses allélja (wgGla-1). A Glazed mutánsok szemalakja ovális, a szem mérete a vad típusnál valamivel kisebb (a facetta szám is alacsonyabb), a szemfelszín fényesnek tűnik az ommatídiumok összeolvadása miatt. A Glazed mutáció csak heterozigótaként tartható fenn, mivel ez a domináns mutáció homozigóta formában letális.

A Drosophila legkisebb méretű, 4. autoszómáján helyezkedik el a szemfejlődés egyik mestergénje, az eyeless. Az eyeless gén funkciójának teljes kiesése embrionális letalitást okoz, mivel a gén nemcsak a szemfejlődéshez, hanem az embriogenezis folyamán zajló más folyamatokhoz is szükséges. Szemfejlődésben betöltött szerepét a vad típushoz képest szemméret csökkenést okozó hipomorf, azaz funkciócsökkenéses alléljának vizsgálatával érhetjük tetten (3.7. ábra).

Az eyeless gén egyik hipomorf allélja (ey2) az Oregonhoz viszonyítva kisebb szemet eredményez

3.7. ábra: Az eyeless gén egyik hipomorf allélja (ey2) az Oregonhoz viszonyítva kisebb szemet eredményez.

Testszín mutációk

A muslica testszíne, pigmentációja alapvetően összefügg a melanin termelésével. Három melanin szintézist befolyásoló gén recesszíven öröklődő, funkcióvesztéses mutánsát vizsgáljuk a gyakorlaton (3.8. ábra). Az X kromoszómán elhelyezkedő yellow (y) gén terméke segíti a melanin kialakulását, kifejeződési szintje és mintázata korrelál a sötét pigmentációval. Funkcióvesztéses mutációja melanin hiányhoz vezet és sárga testű állatokat eredményez. A melanin szintézis gátló faktorait termelik a 2. autoszómán lokalizálódó black (b) és a 3. autoszómán található ebony (e) gének, amelyek funkcióvesztése következtében sötét testű mutánsok alakulnak ki. Különösen sötéten pigmentáltak az ebony mutánsok (nemcsak a test, hanem a szárnyak is feketék).

Testszín mutációk: melanin hiány mutatkozik a yellow funkcióvesztéses mutánsokban (sárga test és sárgás szárny), míg az ebony mutánsok a melanin túltermelés miatt feketék

3.8. ábra: Testszín mutációk: melanin hiány mutatkozik a yellow funkcióvesztéses mutánsokban (sárga test és sárgás szárny), míg az ebony mutánsok a melanin túltermelés miatt feketék.

Szárny mutációk

Számos gén befolyásolja a szárny fejlődését. A 2. autoszómán található vestigial (vg) gén funkciójának kiesése csökevényes szárnyakat eredményez. A homozigóta recesszív vg mutáns legyek nem tudnak repülni. A szintén 2. kromoszómás domináns Curly (Cy) mutáció felkunkorodó szárnyakat okoz. (A Curly gén első azonosított mutáns allélja domináns volt, ezért a gén neve nagy kezdőbetűvel írandó.) A Curly mutáns legyek heterozigóták, mivel a Curly mutáció homozigóta formában letális. A 3. kromoszómás domináns Dichaete mutáció -hasonlóan a Curly-hez- csak heterozigótákban tartható fenn, homozigótán pedig letális. A Dichaete mutánsok szárnytartása tér el a vad típustól, szárnyaikat 45o-ban széttárják.

Szőrmutációk

A 3. kromoszómán lokalizált Stubble (Sb) gén mutációi homozigóta állapotban embrionális illetve lárvális életképtelenséget eredményeznek. A mutációra heterozigóta muslicák szőrei (a fejen és a toron) rövidebbek és vastagabbak a vad típusnál megfigyelhetőhöz képest.

A Humeral (Hu) mutáns állatok jellegzetessége, hogy a humerusukon nagy számban találhatók szőrök. A mutáns bélyeg az Antp gén AntpHu alléljának köszönhető (az Antp 3. kromoszómás gén).

A Sternopleural (Sp) mutánsokban a tor egy részén, a sternopleuriton több illetve hosszabb szőr található, mint a vad típusban. A Sp mutáció a wingless génben következik be (wgSp-1), a mutációra homozigóta egyedek nem életképesek. A wingless gén a második kromoszómán található.

A vad típusú állatok torpajzsán (scutellumán), négy hosszú szőrszál található. Vannak olyan mutánsok, amelyekben négynél kevesebb szőr van jelen, ilyen Scutoid (Sco) mutáns, mely a snail gén egy allélja (snaSco). A szőrfenotípus heterozigótákban figyelhető meg, a mutáció homozigóta állapotban letális. A snail a második kromoszómán lokalizált.

Testalak

A Tubby (Tb) génben bekövetkezett mutáció rövidebb és vaskosabb állatokat eredményez a vad típusnál. Ez különösen L3-as lárvastádiumban és bábkorban szembetűnő. A Tb a harmadik kromoszóma jobb karján helyezkedik el.

Az eddig tárgyalt különböző mutációkhoz kapcsolódó gének genomi (adott kromoszómán történő) lokalizációját a 1. táblázat foglalja össze.

szimbólum

név

Krom. lokalizáció

fenotípus

y

yellow

I(X) 0,0

sárga test

w

white

I(X) 1,5

fehér szem

wa

white-apricot

I(X) 1,5

narancssárga szem

v

vermilion

I(X) 33,0

élénkpiros szem

B

BarH1

I(X) 57,0

résalakú szem

Cy

Curly

II. 6,1

felkunkorodó szárny

Gla vagy wgGla-1

Glazed

II. 21,9

sima szemfelszín

Sp vagy wgSp-1

Sternopleural

II. 21,9

szőrösebb sternopleurit

b

black

II. 48,5

szürkés test

Sco vagy snaSco

Scutoid

II. 51,0

kevesebb szőr a scutellumon

vg

vestigial

II. 67,0

csökevényes szárny

cn

cinnabar

II. 57,5

élénkpiros szem

bw

brown

II. 104,5

vörösesbarna szem

se

sepia

III. 26,0

csokibarna szem

D

Dichaete

III. 40,7

széttárt szárny

Hu vagy AntpHu

Humeral

III. 47,5

szőrösebb humerus

Sb

Stubble

III. 58,22

rövid, vastag szőrök

e

ebony

III. 70,7

fekete test

Tb

Tubby

III. 90,6

tömzsi testalkat

ez

eyeless

IV. 2,0

kisebb szem

1. táblázat Néhány eddig tárgyalt gén genomi lokalizációja, valamint mutáns allélja által homozigóta vagy heterozigóta formában okozott fenotípus. A mutáció domináns vagy recesszív voltát nagy illetve kis betűvel jelzik.

A gyakorlat kivitelezése

Vad típusú (+) imágókat és az említett mutánsokat tartalmazó egy-egy kémcső áll mindenki rendelkezésére. Minden kémcsőben egy pár állat, egy hím és egy nőstény található. Néhányszor ütögessük puha felülethez érintve a kémcsöveket, hogy a muslicák a cső aljára kerüljenek. Közben csepegtessünk néhány csepp étert a kémcső vattadugójára (annak a belső, a kémcső alja felé néző oldalára), így altassuk el az állatokat, majd csempére téve vizsgáljuk meg őket sztereomikroszkóp alatt. Az elkábított muslicákat ecsettel tudjuk mozgatni, megfordítani. Különítsük el a nőstényeket a hímektől. Figyeljük meg a külső genitáliákat, a potroh eltérő alakját és pigmentációját a két nemben, valamint azonosítsuk a szextüskét a hímek első pár lábán. Figyeljük meg az említett morfológiai bélyegeket az egyes mutánsokon.

Ezt követően egy több egyedből álló kevert tenyészetet kap mindenki. Éteres altatás után meg kell határozni az egyedek fenotípusát, (ahol lehet: pontos, ahol nem: potenciális) genotípusát és nemét.