Mendeli monohibrid, dihibrid öröklésmenetek, ivari kromoszómán lokalizált gének öröklődése, kapcsoltság és hárompontos térképezés vizsgálata Drosophila melanogasteren

F2 analízis: mendeli monohibrid, dihibrid öröklésmenetek, ivari kromoszómán lokalizált gének öröklődése

A gyakorlat célja: nagy egyedszámú F2 (2. filiális) nemzedék fenotípusos megoszlásának vizsgálatán keresztül következtetni tudunk az F1 (1. filiális), majd a P (parentális) nemzedék genotípusára és fenotípusára. Ezáltal javaslatot tudunk tenni az adott mutációk öröklésmenetére és a háttérben álló gének autoszómális vagy ivari kromoszómán való lokalizációjára. A gyakorlat során az előző Drosophila gyakorlaton megismert mutánsokkal dolgozunk.

Elméleti bevezető: mendeli egygénes (monohibrid) öröklésmenetek

Keresztezzünk vörösesbarna szemszínű homozigóta recesszív brown (bw) mutáns nőstényeket vad típusú hímekkel (bw+). Tudjuk, hogy a brown gén a 2. autoszómán lokalizált. Ismert az is, hogy a vad típusú allél (bw+) 100%-osan domináns a recesszív mutáns allél (bw) felett. Vizsgáljuk meg az F1 és F2 nemzedék feno- és genotípusos megoszlását.

Az F1 nemzedék egységesen heterozigóta egyedekből áll (uniformitás törvénye), amelyek vad fenotípusúak. Az F2 utódnemzedék a véletlenszerűen párba állított F1 egyedek egymás közötti, azaz inter se keresztezéséből jön létre. A hímek és a nőstények által termelt ivarsejtek genotípusát, az egyedek véletlenszerű párosításával létrehozott utódok (F2 generáció) genotípusát és fenotípusát az alábbi Punnett-tábla szemlélteti:

F2:

2. táblázat

Látjuk, hogy F2-ben az utódok ¾-e vad fenotípusú lesz (téglavörös szem), ¼ arányban pedig megjelenik a mutáns fenotípus (vörösesbarna szemszínű állatok), vagyis a híres mendeli 3:1-es hasadási arányt kaptuk, amely a genotípusokat tekintve 1:2:1-es aránynak felel meg (¼ homozigóta vad: ½ heterozigóta: ¼ homozigóta recesszív). A fenti öröklésmenet tehát egy mendeli egygénes vagy monohibrid öröklésmenet. A reciprok keresztezés (vad típusú nőstény keresztezése bw mutáns hímmel) ugyanerre az eredményre vezet.

Mendeli kétgénes (dihibrid) öröklésmenetek

Keresztezzünk vestigial (vg) mutáns, azaz csökevényes szárnyú nőstényeket ebony (e), vagyis fekete testű hímekkel. Ezúttal két tulajdonság öröklődését vizsgáljuk. Tudjuk, hogy a vestigial gén a 2. autoszómán, az ebony pedig a 3. autoszómán helyezkedik el, tehát a két tulajdonság egymástól függetlenül öröklődik. Vizsgáljuk meg az F1 és F2 nemzedék feno- és genotípusos megoszlását.

Az F1 egyedek mindkét mutációra heterozigóták, de vad fenotípusúak; egymás közötti kereszteződésük adja az F2 nemzedéket. Mivel a két gén egymástól függetlenül öröklődik, a két gén alléljai a gaméták képződésekor szabadon kombinálódnak, ezért a négy különböző gaméta azonos valószínűséggel képződik mindkét nemben, 1/4 arányban. A Punnett tábla mutatja, hogy a négyféle ivarsejt 16 féleképpen kombinálódhat, azonban a kombináció eredményeképpen azonos genotípusú egyedek is létrejöhetnek. Ezeket az azonos genotípusú párokat szimmetrikusan a Punnett tábla átlója alatt és felett találjuk. A balról jobbra haladó átló által metszett cellában vannak az egy vagy két lokuszukon homozigóta genotípusok, míg a mindkét lokuszukon heterozigóta típusok a másik átló mentén találhatóak. A vizsgált mutációk domináns-recesszív öröklésmenete következtében azonban a 9-féle genotípus csak 4 féle fenotípust eredményez.

F2:

3. táblázat

A cellák összeszámlálásával belátható, hogy 9/16 arányban vad fenotípusú állatokat, 3/16 arányban csökevényes szárnyú (vg) egyszeres mutánsokat, további 3/16 arányban fekete testű (e) egyszeres mutánsokat valamint 1/16 arányban csökevényes szárnyú és fekete testű kettős mutánsokat kapunk. Tehát a hasadási arány 9:3:3:1-es, ami a mendeli kétgénes (dihibrid), domináns-recesszív öröklésmenetek jellemző hasadása. A reciprok keresztezés elvégzése (ebony mutáns nőstény keresztezve vestigial hímmel), ugyanehhez az eredményhez vezet, ami alátámasztja, hogy egyik gén sem lokalizálódik az ivari kromoszómán.

Ivari kromoszómán lokalizált gének öröklődése

Keresztezzünk white (w) mutáns nőstényeket vad típusú hímekkel. Ismert, hogy a white gén az X kromoszómán lokalizált. Azt is tudjuk, hogy a white mutáció recesszíven öröklődik.

Az F1 nőstények heterozigóták (vad fenotípusúak), míg a hímek fehér szeműek (w), mivel X kromoszómájukat az anyjuktól öröklik (cikk-cakk öröklésmenet). Már itt látjuk az első eltérést a Mendel-szabályoktól, mivel az F1 nemzedék nem egységes (az uniformitás törvénye sérül). Az F2 nemzedék az F1 inter se keresztezésből jön létre.

4. táblázat

Az F2 generáció 1:1 arányban tartalmaz vad típusú egyedeket és fehér szemű mutánsokat. Ez a megoszlás mindkét nemben megfigyelhető.

Ezután végezzük el a reciprok keresztezést, vagyis keresztezzünk vad típusú nőstényeket hemizigóta white (w) hímekkel.

Az F1 nemzedék tagjai mindkét nemben vad fenotípusúak, ami eltér az előző keresztezés F1 generációjának összetételétől.

5. táblázat

Az F2 nemzedék is eltér az előző keresztezés F2 generációjának fenotípusos megoszlásától. Itt a nőstények mind vad fenotípusúak (bár heterozigóták), a hímek fele vad, másik fele pedig fehér szemű mutáns. Vegyük észre, hogy az F2 populáció egészére vonatkoztatva 3:1-es hasadási arány figyelhető meg a vad típusú állatok és a fehér szemű mutánsok között, de a nemekben a megoszlás különböző, s ez az eltérés az autoszómás lokuszokra vonatkozó mendeli monohibrid keresztezésektől. A fehér szemszín csak a hímekben (pontosan a hímek felében) jelenik meg.

Összefoglalva, az ivari kromoszómán lokalizált gének öröklésmenete eltér az autoszómás génekétől (a reciprocitás, uniformitás szabályai nem érvényesek, és az F2 hasadási arányok is különbözők). Az F2 nemzedékben 1:1-es hasadási arányt kapunk mindkét nemben vad fenotípusú és mutáns egyedekre vonatkoztatva, ha a szülők (P) közül a nőstény homozigóta recesszív mutáns volt az adott X kromoszómában lokalizált génre nézve, a hím pedig vad típusú volt. A reciprok keresztezés esetében (szülők (P) közül a hím hemizigóta formában hordozza az X-hez kötött mutációt, a nőstény pedig vad típusú) az F2 nemzedékben a vad és mutáns fenotípusok aránya 3:1, ahol csak a hímek, azok fele mutatja a mutáns fenotípust.

Az F2 nemzedék fenotípusos megoszlásának statisztikai vizsgálata

Ahhoz, hogy egy tulajdonság öröklésmenetét az ismertetett klasszikus módszerekkel felderíthessük meg kell állapítanunk, hogy a különböző fenotípus kategóriák milyen arányban vannak jelen az F2 nemzedékben. Ehhez statisztikai elemzésre van szükség, mert ha egy keresztezés kevés utódot eredményez illetve viszonylag kevés keresztezést csinálunk, akkor az adatok szórnak, nem pontosan egyeznek a kapott arányok a feltételezett öröklésmenetek alapján várt arányokkal. Mint látni fogjuk, a különböző genotípusú (bármely életszakaszban levő) egyedeknél hallgatólagosan feltételezett azonos életképesség sem teljesül. Különösen a kapcsoltság vizsgálatánál fontos megállapítanunk, hogy a független öröklődés hipotézise alapján várt arányoktól való eltérés vajon pusztán mintavételi hiba - azaz kis minta elemszám - eredménye-e. Az alkalmazandó módszer teljesen általános, ezért egy történetileg érdekes, egyszerű példán mutatjuk be. Morgan 1910-ben a Science folyóiratban publikálta, hogy a Drosophila fehér szemszínt okozó mutációja valószínűleg egy olyan faktorhoz kapcsolódik, amiből a hímekben egy kell, hogy legyen, a nőstényekben viszont kettő. A publikáció különleges tudománytörténeti jelentősége, hogy ez volt az első cikk, ami a Mendel-féle géneket nem puszta absztrakciókként, hanem valamilyen faktorhoz rendelhetőkként kezelte. Így ezt a cikket a modern genetika elindítójának is tekintik.

(http://www.redli.esp.org/foundations/genetics/classical/thm-10a.pdf)

Morgan és munkatársai egy éve beltenyésztett tenyészetben egy fehér szemű hímet találtak. Ezt az egyetlen hímet keresztezték vad szemszínű testvéreivel, ami 1237 vörös szemű egyedet és 3 fehér szemű hím utódot eredményezett. A továbbiakban a 3 fehér szemű utódtól eltekintettek. Az F1 generáció egyedeit egymás között keresztezve a következő utódszámokat kapták:

Vad szemű nőstény

2459 darab

Vad szemű hím

1011 darab

Fehér szemű hím

782 darab

Összesen

4252 darab

6. táblázat

Az F1 egyedek keresztezése ebben az esetben a második fent felírt keresztezésnek felelhet meg, tehát feltételezve, hogy a nőstények heterozigóták, a hímek pedig a vad allélre hemizigóták az eredményeket így is írhatjuk:

7. táblázat

Ha a hím fehér szemszínét okozó mutáció az X kromoszómán öröklődik, akkor nem várunk fehér szemszínű nőstényeket, azt várjuk, hogy a hímek egyik fele vad típusú másik fele pedig fehér szemű legyen, s azt is várjuk, hogy az összes utód negyede legyen mutáns.  A keresztezésből valóban nem származtak fehér szemű nőstények, az arányok egyezése a várttal pedig illeszkedés vizsgálattal ellenőrizhető. A cikk publikálásakor a hipotézis vizsgálat statisztikai eszközei még nem álltak rendelkezésre. Természetesen mindkét arányra vonatkozó hipotézisünket ellenőrizhetjük.

A hímek közti 1:1 megoszlás ellenőrzése:

megfigyelt esetszám (O)

várt esetszám (E)

χ2 tagjai ((O-E)2/E)

1011

896,5

14,63

782

896,5

14,63

2459

2126

52,16

8. táblázat

E táblázatban a megfigyelt esetszámot a kísérlet szolgáltatja, a várt esetszámot pedig a 7. táblázatból és az 5. táblázatból számítjuk: a 7. táblázat szolgáltatja az összes egyedszámot, melyet az ötödik táblázatnak megfelelően osztjuk súlyozva (azaz  az összes egyed száma 2459 a fele vad típusú nőstény, negyede vad típusú hím, negyede mutáns hím).

A várt esetszámok és a tényleges adatok közti különbséget a várt esetszámhoz viszonyítva a következőképpen számoljuk:

Esetünkben n=3-al, mert három kategóriánk van. Bebizonyítható, hogy az így kapott összeg jól közelíti a megfelelő paraméterű χ2eloszlást, ha az adatok megfigyelt eloszlása és a várt eloszlás egyezik. Mivel a várt esetszámokat a kísérlettől független ismeretek alapján határoztuk meg, az eloszlás paramétere az ún. szabadsági fok, a kategóriák száma -1 –el egyenlő, azaz 3-1=2. A kapott 81,4-es χ2 érték óriási, p=0,001-nél is kisebb a valószínűsége, hogy az 1:1 arányra vonatkozó null hipotézisünk teljesülése esetén ekkora vagy ennél is nagyobb különbséget kapjunk az empirikus és a várt eloszlás között. Megismételve az eljárást a 3:1 arányra, szintén szignifikáns eltérést kapunk a null hipotézistől, 0.001-es szignifikancia szinten is. Az alkalmazott eljárást a statisztikusok tiszta illeszkedés vizsgálatnak nevezik. A tiszta jelző arra utal, hogy a várt arányokat nem a vizsgált adatok alapján becsüljük, hanem elméleti megfontolások vagy más adatok alapján tudjuk.

Ezen adatok alapján tehát a white lokusz öröklődésére vonatkozó ivari kromoszómás hipotézist el kellene vetnünk! Miért bizonyulhatott mégis igaznak az ivari kromoszómás hipotézis? Vegyük észre, hogy az egész eljárás kimondatlanul feltételezi, hogy a white mutáció nem hat az egyedek életképességére. Ugyanakkor láttuk, hogy a white mutáns egy ABC transzporter funkcióvesztéses mutációja, ami megváltoztatja a hímek udvarló viselkedését, s ezen keresztül utódaik számát. Ezért van kevesebb mutáns hím a vártnál. A túlélési rátákat kimérve az arányok korrigálhatóak és a hipotézis igazolható. Egyetlen kérdés maradt hátra. Miért nem zavarta Morgant és a kortársakat ez a statisztikai teszt nélkül is érzékelhető eltérés a várt arányoktól? Miért publikálhatta ezeket az eredményeket Morgan a korszak vezető tudományos lapjában? A durva egyezés valószínűleg azért volt elegendő, mert az F2-től független teszt-keresztezésekből adódó arányok is durván alátámasztották az új hipotézist, ami ráadásul összhangban volt a Mendel által feltételezett alapmechanizmussal, aminek az alkalmazási körét nagymértékben kiterjesztette. Ez elég volt ahhoz, hogy se a szerző, se a kortársak ne aggódjanak az eltérések miatt.

A gyakorlat kivitelezése

Ezután nézzük végig két konkrét példán, hogy az eddigi ismeretek alapján az F2 generáció fenotípusos megoszlásából hogyan következtethető ki az F1 nemzedék, majd a szülői (P) törzsek genotípusa, és hogyan tehetünk javaslatot a háttérben álló gének számára és az öröklés módjára, azaz a tulajdonság  öröklésmenetére. Fontos megjegyezni, hogy a gyakorlaton megoldandó példákban minden esetben tiszta szülői vonalakból (azaz homozigóta [vagy X kromoszómán öröklődő tulajdonság esetén hemizigóta] mutánsokból) indulunk ki.

1.      Rendelkezésünkre áll az alábbi F2 nemzedék:

F2

nőstények (♀)

hímek (♂)

Vad

61

59

barna szem, vad test

20

21

vad szem, sárga test

59

58

barna szem, sárga test

22

22

egyedszám összesen

162

160

9. táblázat

Első lépésben a két tulajdonság öröklésmenetét külön-külön vizsgáljuk. Ehhez adatainkat átrendezve, úgynevezett kontingencia táblában, nemenként külön-külön ábrázoljuk:

10. táblázat

A tábla alján, illetve jobb szélén feltüntetett értékek, amiket a megfelelő cellákban álló darabszámok összeadásával kaptunk a marginálisok.  E szerint a 162 nőstény közül 120 darab vad szemszínű, tehát 120/162=0,74 a nőstények között a vad szemszínűek aránya. Mivel 81 darab vad testszínű nőstényt találtak 81/162=0,5 a vad testszínűek aránya. Ugyanez a táblázat a hímekre azt mutatja, hogy a fenti arányok közöttük is hasonlóak.

11. táblázat

Látjuk tehát, hogy mindkét nemben körülbelül 1:3 hasadási arányt tapasztalunk a szemszínre. Ezért feltételezhetjük, hogy a barna szemszínt okozó mutáció recesszív és mendeli öröklésmenetet mutat. Így öröklődik például a 3. autoszómán elhelyezkedő sepia gén funkcióvesztéses mutációja (se). A testszín öröklődését hasonlóan vizsgálhatjuk. A sárga testszínű mutánsok aránya a vad testszínt mutatókhoz képest mindkét nemben 1:1. Ez arra utal, hogy a sárga testszín X kromoszómán lokalizálódhat, és mivel a mutáns fenotípus az F2 generációban mindkét nemben 1:1-es arányban jelenik meg, feltételezhető, hogy a P generáció nősténye hordozta az X-hez kötött mutációt homozigóta formában. Az előző gyakorlaton megismert mutációk közül így öröklődik az X-hez kötött yellow (y) mutáció. Ezek alapján feltételezhetjük, hogy a P generációban a nőstény homozigóta recesszív y mutáns volt, a hím pedig homozigóta recesszív se mutáns.

Ugyanakkor vegyék észre, hogy a se mendeli öröklődést mutat, tehát igaz rá a reciprocitás szabálya, s így azt is feltételezhetnénk, hogy a P nőstény y; se kettős mutáns, a hím pedig vad típusú volt. E feltevés alapján a keresztezések a következők:

F1-ben vad típusú nőstényeket és sárga testű hímeket kapunk, amelyek inter se keresztezése az alábbi F2 nemzedéket hozza létre.

12. táblázat

A Punnett-tábla bal oldalán az F2 nőstényeket, jobb oldalán pedig az F2 hímeket látjuk. A nőstények 3/8-a vad típusú, további 3/8-a sárga testű, 1/8 arányban kapunk barna szemű mutánsokat és további 1/8 arányban pedig sárga testű és barna szemű kettős mutánsokat. Az F2 hímekben ugyanezt a várható fenotípusos megoszlást mutatja a Punnett-tábla.

A feladat eredeti F2 adatai jól egyeznek az itt kapott arányokkal. A bemutatott hipotetikus adatok mellett nincs szükség statisztikai elemzésre, azonban valóságos esetekben az arányokra vonatkozó hipotézisünket statisztikailag igazolni kell, amire a fentiekben mutatott illeszkedés vizsgálat chi-négyzet próbával kiválóan alkalmas.

1. Rendelkezésünkre állnak az alábbi F2 nemzedék adatai, határozzuk meg a P és F1 generációkat, vezessük le az F2 generációt, és határozzuk meg, hogy az adott gének ivari kromoszómán vagy autoszómán helyezkednek-e el.

F2

nőstények (♀)

hímek (♂)

vad

0

92

babalakú szem

88

0

résszem

93

90

babalakú szem, fekete test

28

0

résszem, fekete test

31

31

fekete test

0

29

összesen

240

242

13. táblázat

Ismét válasszuk szét a két morfológiai bélyeg öröklődését és ábrázoljuk adatainkat kontingencia táblában.

Ha a fekete testszín vad testszínhez viszonyított arányát vizsgáljuk, látjuk, hogy mindkét nemben körülbelül 1:3 hasadási arányt tapasztalunk (nőstények: 59 fekete testű: 181 vad testszínű; hímek: 60 fekete testű: 182 vad testszínű). Ezért feltételezhetjük, hogy a fekete testszínt okozó mutáció recesszív és mendeli öröklésmenetet mutat. Így öröklődik például a 3. autoszómán elhelyezkedő ebony gén funkcióvesztéses mutációja (e). A szemalak mutánsok mindkét nemben megfigyelhetők az F2 nemzedékben. A hímek fele résszemű (121 egyed), a másik fele vad szemalakot mutat (121). Az F2 nőstények mind szemalak mutánsok, fele-fele arányban bab- illetve résszeműek. Valószínű, hogy a szemalak mutáció az X kromoszómán lokalizált, és a mutációt a szülők (P) közül a nőstény hordozta, mivel a mutáns bélyeg mindkét nemben megjelenik az F2-ben. Ráadásul a mutáció domináns, mivel minden F2 nőstény szemalak mutáns, a babalak és résszem pedig a mutáns allél heterozigóta valamint homozigóta formában való megnyilvánulása. Ez a szemalak mutáció az előző gyakorlaton tárgyalt Bar mutáció, amely homozigótán résszemet, heterozigótán pedig babalakú szemet eredményez. Ezek alapján feltételezzük, hogy a P generáció nősténye homozigóta domináns Bar mutáns, a hím pedig homozigóta recesszív ebony mutáns volt.

Természetesen az ebony mutációt a nőstény is hordozhatta, tehát az a feltevés is megállja a helyét, miszerint a P nőstény B; e kettős mutáns volt, a hím pedig vad típusú:

F1-ben babalakú szemű nőstényeket és résszemű hímeket kapunk, amelyek inter se keresztezése az alábbi F2 nemzedéket hozza létre.

14. táblázat

A Punnett-tábla bal oldalán az F2 nőstényeket, jobb oldalán pedig az F2 hímeket látjuk. A nőstények 3/8-a babalakú szemű, további 3/8-a résszemű, 1/8-1/8 arányban kapunk fekete testű, résszemű valamint fekete testű, babalakú szemű kettős mutánsokat. Az F2 hímek 3/8-a vad típusú, 3/8-a résszemű, 1/8-a fekete testű, további 1/8-a pedig résszemű és fekete testű. A feladat eredeti F2 adatai jól egyeznek az itt kapott adatokkal.

2.B rész: Kapcsoltság és hárompontos térképezés

Eddig láthattuk, hogy milyen öröklésmenetet mutat egy autoszómán lokalizált recesszív mutáció, milyet egy X kromoszómán levő, milyen hasadási arányok jellemzőek a mendeli dihibrid öröklésmenetben, és milyen akkor, hogyha két olyan gén öröklésmenetét vizsgáljuk, amelyek közül az egyik autoszómán a másik pedig X kromoszómán lokalizált.

A XX. század első éveiben Bateson és a Punnett a szagos bükköny két tulajdonságának öröklődését vizsgálták, és az F2-ben tapasztalt hasadási arány nagymértékben eltért a várt 9:3:3:1-es hasadási aránytól, oly módon, hogy két fenotípusos kategóriába tartozó utódok jóval többen voltak a vártnál, míg a másik két kategóriába tartozók jóval kevesebben. Már e két kutató úgy gondolta, hogy fizikailag kapcsoltak ezek a gének, de nem ismerték e kapcsoltság természetét.

A hipotézis igazolása Drosophila genetika alkalmazásával történt. Morgan hasonló eltéréseket talált a mendeli öröklődéshez képest, amikor két autoszómás gén öröklődését vizsgálta. Az egyik gén a purple (pr) volt, melynek recesszív mutáns allélja homozigóta formában bíbor szemszínt okoz, a másik a vestigial (vg), amely homozigóta állapotban csökevényes szárnyat eredményez.

Kettősmutáns nőstényeket keresztezett vadtípusú hímekkel, majd az F1 nőstényeket tesztelő keresztezésbe vitte, azaz a mindkét lokuszra recesszív homozigóta hímmel keresztezte.

E keresztezésből az alábbi fenotípusú muslincákat figyelte meg:

15. táblázat

Ha e gének mendelien öröklődnének, akkor 1:1:1:1-es hasadási arányt kellene kapni. A két nagylétszámú kategória a kiindulási, szülői fenotípusokkal egyezik meg (ún. parentális típus). A parentális típustól eltérő fenotípusú utódok a rekombináns kategóriákat alkotják.

Az egyazon kromoszómán levő gének fizikailag kapcsoltak, az ő öröklődésük nem mendeli módon, hanem a crossing over, az átkereszteződés szabályszerűségeit követve öröklődnek.

Minél távolabb van egymástól a két vizsgált lokusz, annál nagyobb eséllyel következik be átkereszteződés közöttük, annál több rekombináns utód lesz jelen az utódnemzedékben.

Így a rekombinánsok arányából következtetni lehet a vizsgált lokuszok távolságára (ld. Sordaria gyakorlat, Haldane-függvény; kis távolságok esetén egyenes illeszthető a függvény kezdeti szakaszára, azaz a rekombináció gyakoriságát és a távolságot számértékileg megegyezőnek tekinthetjük). A kapcsolt génekkel végzett kísérletek éppen ezért lehetővé tették és teszik ezen ún. kapcsoltsági logikán alapuló genetikai térképek elkészítését.

A Drosophila-ban csak a nőstényekben történhet rekombináció meiozis során, a hímekben nem. Ezért mindig a nőstényben (annak ivarsejtképzése során) lejátszódó rekombinációkat monitorozzuk.

A gyakorlat során hárompontos térképezéseket fogunk végezni: három kapcsolt gén öröklésmenetét fogjuk vizsgálni, amelynek során meghatározzuk a (vizsgált) gének relatív sorrendjét, és a vizsgált lokuszok közötti távolságokat, valamint a crossing over interferenciát is.

A fentiekkel összhangban az első lépés az utódnemzedékben a parentális típusok azonosítása. Mivel relatíve közel elhelyezkedő lokuszok öröklésmenetét vizsgáljuk, így annak a valószínűsége, hogy nem történik rekombináció jóval nagyobb, minthogy történik, ezért a nem rekombináns,  a parentális típusba tartozó utódok képviseltetik magukat nagy számban.

Figyeljük meg, illetve gondoljuk végig a következőket!

  • A rekombináció vizsgálatához a kérdéses lokuszokra heterozigóta nőstényekre van szükség.

  • A heterozigóta nőstények kétfélék lehetnek. Vagy azonos kromoszómán hordozzák a két mutációt, ezek a cisz heterozigóták vagy különböző kromoszómákon hordozzák azokat, ezek a transz heterozigóták.

  • A nőstényben lejátszódó rekombinációs eseményeket csak akkor látjuk az utódnemzedékben, ha a hímekből származó allélek ezt lehetővé teszik (azaz az apától öröklött allél nem domináns az anyától örökölttel szemben). Ebben az esetben a vizsgált utódnemzedék, az ún. térképező populáció egyedeinek fenotípusát a petesejt haplotípusa határozza meg.

  • Két parentális típus van, amelyek rekombináció hiányában keletkeznek, és megfeleltethetőek a nőstény két homológ kromoszómájának. A két parentális típus egymásnak a „reciproka” a heterozigócia miatt.

Két gén távolságát a vizsgált lokuszok rekombinációs gyakorisága alapján határozzuk meg:

1/a feladat. Drosophila-ban két recesszív gén, a black (, melynek recesszív mutációja szürkés testszínhez vezet) és a vestigial (vg - csökevényes szárny) a 2. kromoszómán helyezkedik el. F1 dihibrid, azaz mindkét vizsgált génre heterozigóta nőstényeket tesztelő keresztezésbe vitték és 1930 vad típusú, 1888 szürke testű, csökevényes szárnyú, 412 szürke testű és 370 csökevényes szárnyú utódot kaptak.

Számítsuk ki a b és vg közti távolságot!

Az utódnemzedék négyféle fenotípusos kategóriája közül két parentális és két rekombináns van. A két parentális jelen esetben a vadtípus (1930) és a kettősmutáns (szürke testű, csökevényes szárnyú, 1888), mivel e típusok gyakorisága magas. A dihibrid nőstény genotípusa tehát:

A szürke testű (412) illetve a csökevényes szárnyú (370) egyedek a rekombinánsok, a b és vg locusok közti rekombináció eredményeként jöttek létre (3.9. ábra).

3.9. ábra

A b és a vg locusok közti rekombinációs gyakoriság – rb-vg – meghatározása:

A rb-vg rekombinációs gyakoriság 0,17, azaz a db-vg távolság  0,17M = 17cM. (Mivel ez az érték nagyobb 5cM-nél, ezért valójában korrigálni kellene a Haldane-függvénnyel, de mi ettől eltekintünk a Drosophila gyakorlat során.)

Nézzük meg, mi történik egy harmadik pont bevonása esetén!

1/b feladat

Egy másik recesszív gén a cinnabar (cn - élénkpiros szemszín) szintén a 2. kromoszómában lokalizált. Az F1 trihibrid nőstényekkel tesztelő keresztezést végeztek és

664 vad típusú

652 szürke testű, élénkpiros szemű, csökevényes szárnyú

72 szürke testű, élénkpiros szemű

68 csökevényes szárnyú

70 szürke testű

61 élénkpiros szemű, csökevényes szárnyú

4 szürke testű, csökevényes szárnyú

8 élénkpiros szemű

egyedet kaptak.

Ugyancsak két parentális típus van, de nem kettő, hanem hat rekombináns kategóriát figyelhetünk meg. A két parentális típus:

P1: vadtípusú (664)

P2: szürke testű, élénkpiros szemű, csökevényes szárnyú (652)

Állapítsuk meg a gének közötti távolságokat, a génsorrendet és a crossing over interferencia értékét. Azonosak az a) és b) kérdésben a b és vg lokuszok közötti távolságok?

Nem evidencia, hogy a harmadik pont az előbbi kettő között van, meg kell határoznunk a génsorrendet! Csak a relatív génsorrend meghatározására van lehetőségünk (azaz arra, hogy a három pont közül „melyik van középen”), nem nyerünk információt arról, hogy melyik lokusz található a centromerhez ill. a telomerhez közelebb.

A génsorrend meghatározása a ritka osztály segítségével lehetséges. A ritka osztály az a két fenotípusos kategória, amelybe tartozó egyedek a legkisebb arányban képviseltetik magukat. Három pont vizsgálata lehetőséget ad arra, hogy azokat az utódokat is azonosítsuk, melyek kettős crossing overrel jöttek létre. Az egyik crossing over az egyik külső és a belső pont között, míg a másik crossing over a belső pont és a másik külső pont között történt. Két crossing over egyidejű bekövetkeztének, tehát a kétszeres crossing overnek a gyakorisága sokkal kisebb még az egyszeres crossing overénél is, ez a magyarázata a nagyon alacsony egyedszámnak a térképező populációban.

A génsorrend meghatározásához a ritka osztályt úgy használjuk föl, hogy tudjuk a parentális típusoknak köszönhetően a nőstény homológ kromoszómáinak genotípusát és azt is tudjuk, hogy a kétszeres crossing overnek milyen haplotípusú gamétákat kell eredményeznie. (3.10. ábra) A génsorrend meghatározásnál kiindulunk egy feltételezett génsorrendből és megnézzük, hogy e hipotetikus génsorrend esetén kettős crossing overrel keletkező gaméták a ritka osztályt hozzák-e létre. Az 10. ábrán látható, hogy az I. és a II. feltételezett génsorrend nem a ritka osztályba tartozó egyedekhez vezet, míg a III. feltételezett génsorrend az, ami a 4 illetve 8 egyedszámú kategóriához, a tényleges ritka osztályhoz vezet. 

3.10. ábra

Megvan tehát a gének relatív sorrendje: b – cn – vg.

A távolságok kiszámítása során először a b-cn távolságot határozzuk meg!

Ehhez minden olyan rekombináns egyedet össze kell adni a számlálóban, amely kialakulásához a b ás a cn locusok között történt rekombináció. A 11. ábrán láthatjuk, hogy ezek egyrészt az egyszeres rekombinánsok egyik csoportja (R1 és R2, az ábrán az őket létrehozó rekombinációs eseményt a zöld vonalak szimbolizálják), valamint a kétszeres átkereszteződéssel létrejövő R5 és R6. (Az utódok száma összesen 1599.)

3.11. ábra

Hasonlóképpen járunk el a cn és vg locusok közötti távolság meghatározásánál, az ábrán az R3 és R4 rekombinánsokat létrehozó átkereszteződéseket a kék vonalak jelzik.

E térképező populáció felhasználásával is meghatározhatjuk a db-vg távolságot. Minden egyes rekombinációs eseményt összegezni kell. Ez jelenti az összes egyszeres rekombinánst, valamint a kétszeres rekombinánsokat, ráadásul az utóbbiakat kétszeresen, hiszen egy kétszeres rekombinációval létrejött egyed két rekombinációs eseményt jelent.

Természetesen ezt a távolságértéket kapjuk akkor is, hogyha a már korábban kiszámolt db-cn és dcn-vg távolságokat egyszerűen összeadjuk. Ugyanakkor az így kapott 18,44cM nem egyezik meg az 1/a feladatban meghatározott 17cM-nal! A különbség fő oka abban keresendő, hogy ’beiktattunk egy belső pontot’, így láthatóvá lettek a kétszeres crossing overek a b és a vg locusok között. Ez magyarázza azt a tényt, hogy mennél több pont áll a rendelkezésünkre a géntérképezés során, annál pontosabban lesz a lokuszok közötti távolság becslése.

A térképezésnél a kiindulási hipotézisünk az volt, hogy az átkereszteződések bármely bázispárnál azonos valószínűséggel történhetnek és egymástól függetlenül következnek be egy-egy kromoszóma szakaszon, azaz nem befolyásolják egymás előfordulását. Ez a hipotézis azonban nem teljesen igaz. A megfigyelt és a várt kétszeres átkereszteződések gyakoriságának hányadosa az ún. koincidencia koefficiens (rövidítése cc).

A függetlenségtől való eltérés mértéke meghatározható a crossing over interferencia (jele: I) segítségével. I azt fejezi ki, hogy ha valahol crossing over történik, az milyen hatással van egy második crossing over kialakulására. A koincidencia koefficienst egyből kivonva kapjuk meg az interferencia értékét. Mivel arányszámról van szó, mértékegysége nincs.

Ha I = 1, akkor komplett interferenciáról, teljes mértékű gátlásról beszélünk, a kialakult crossing over nem teszi lehetővé egy másik crossing over létrejöttét (nincs kétszeres crossing over).

Ha 0 < I < 1, akkor inkomplett, (pozitív) interferencia van, a már kialakult crossing over valamilyen (de nem teljes) mértékben gátolja az újabb crossing over létrejöttét.

Ha I < 0, az a negatív interferencia jelensége, ez akkor következik be, hogyha a már kialakult crossing over serkentően hat egy másik crossing over létrejöttére. (E területek a rekombinációs forrópontok.)

Határozzuk meg az 1/b feladatban az I-t!

A valószínűségszámítás tanulmányainkból tudjuk, hogy két független esemény együttes bekövetkezésének valószínűsége a két esemény külön-külön vett bekövetkezési valószínűségének a szorzata. A kétszeres átkereszteződések  várt gyakoriságát tehát az egyik és a másik lokuszpár  közötti rekombinációs gyakoriság szorzataként kapjuk meg.

Az interferencia mértéke tehát 0,12, azaz gátlás van.