A C. elegans általános jellemzése

A Caenorhabditis elegans mérsékelt égövi, talajban szabadon élő, baktériumokat fogyasztó, 1,2 mm hosszúságú fonalféreg (4.1. ábra). 25°C-on a megtermékenyített petesejt 52 óra alatt fejlődik ki ivarérett felnőtté. A felnőtt állatok 4-6 napig képesek szaporodni, majd a reproduktív időszak után még körülbelül 7-10 napig élnek. Egy hermafrodita állat viszonylag nagyszámú (közel 250) utódot képes létrehozni. Kis testméretnek köszönhetően a mikroorganizmusokhoz hasonlóan műanyag Petri lemezeken, átlátszó agar felületen (NGM – Nematode Growth Medium) lehet laboratóriumi körülmények között nagy számban fenntartani (Brenner, 1974). A fenntartás során táplálékként E. coli OP50 baktérium törzset használnak.

A C. elegans fonalféreg faj az 1970-es évek közepétől vált a genetikai analízis egyik közkedvelt genetikai modell rendszerévé (Brenner, 1974). Sydney Brenner (4.2. ábra) eredetileg fejlődésgenetikai problémák megválaszolására és az idegrendszer működésének tanulmányozására választotta ki ezt az élőlényt (4.3. ábra).

4.2. ábra. Sydney Brenner (1963). I would like to tame a small metazoan…” (szeretnék megszelídíteni egy kicsi állati szervezetet). Brenner választotta a C. elegans-t genetikai modellszervezetnek. Ma több mint 1000 C. elegans laboratórium található a különböző országokban.

4.3. ábra. Brenner levele Max Perutz-hoz, az MRC (Medical Research Center, Cambridge, UK) akkori igazgatójához.

Az állat testét alkotó közel ezer szomatikus sejt közül 302 idegsejt, amelyek közel 5000 szinapszist hoznak létre (Ward és mtsai., 1975). Idegrendszere elég komplex ahhoz, hogy az állat képes legyen a tanulásra, bonyolult mozgási folyamatokra, viselkedésre és érzékelésre. Ugyanakkor elegendően egyszerű ahhoz, hogy laboratóriumi körülmények között egyedi sejtszinten is tanulmányozhatóak legyenek ezek a biológiai folyamatok genetikai eszközökkel.

A C .elegans fejlődésmenete

Az embriógenezist követően a C. elegans 4 lárvastádiumon (L1-L4) keresztül fejlődik felnőtt állapotba (4.4. ábra). A lárvastádiumok között az állat egy-egy vedlési (un. lethargus) stádiumon megy keresztül. Lethargus állapotban az állat nem mozog, nem táplálkozik, garatműködése leáll. Az új kutikula kialakulása után a feji részen megreped a régi kutikula, és az állat kicsúszik belőle. Nagy populáció sűrűség és/vagy táplálékhiány esetén az állatok egy alternatív „kitartó forma” (un. dauer) lárvastádiumba fejlődnek (4.4. ábra). A dauer lárvastádium az L1 stádiumban érzékelt ingerek, mint pl. a túlnépesedés (dauer feromon), táplálékhiány, vagy magas hőmérséklet hatására alakul ki (Riddle és Albert, 1997). A dauer fejlődést iniciáló ingereket az állat a fején lévő kemoreceptorokon keresztül érzékeli. A dauer lárva a fejlődése során makroerg molekulákat halmoz fel, dauer lárvaként pedig nem táplálkozik, hanem tartaléktápanyagait égeti (szemianabiózis). Ez a fejlődési forma rendkívül ellenálló, kutikulája vastag, majdnem teljesen zárt. A dauer lárva akár 6 hónapig is képes életben maradni, miközben biológiai értelemben nem öregszik (non-aging fejlődési forma). Kedvező körülmények hatására a dauer lárva L4 stádiumú lárvává alakul (recovery), majd folytatja a reproduktív egyedfejlődési ciklust.

4.4. ábra. A C. elegans fejlődésmenete. Az embrionális fejlődést követően az állat 4 lárvastádiumon keresztül éri el a felnőtt kort. Kedvezőtlen körülmények egy alternatív lárvaforma, az ún. dauer lárva alakul ki, amely akár 6 hónapig is életképes, és a kedvezőtlen körülmények átvészelésére specializálódott (a dauer lárvát erős, detergensekkel szemben ellenálló kutikula védi; nem táplálkozik; alig mozog; nem növekszik és alig metabolizál). A kép alsó sarkában egy dauer lárva fénymikroszkópos képe látható. Az állat kb. akkora, mint egy L3 stádiumú lárva. A belében felhalmozódó lipidcseppek miatt a dauer lárva sötét színű.

Sejtvonalak

A C. elegans sejtjeinek leszármazási sorsa invariáns és meghatározott (4.5. ábra). Áttetsző, fénymikroszkóp alatt transzparens testfalának köszönhetően - máig egyedüliként a soksejtűek körében - 1983-ra meghatározásra került az állat teljes sejtleszármazási térképe (cell lineage), azaz minden testi sejt születése, osztódási síkja, és további egyedfejlődési sorsa (Sulston és Horvitz, 1977). Ez a sejtsors térkép adatbázisból elérhető.

4.5. ábra. A C. elegans sejtsors térképe. Baloldalon az egyedfejlődés órákban megadott stádiumai (25°C-on). Kis vonal jelzi a sejtleszármazási fa tetején a zigótát, majd alatta újabb vonalak jelzik a 2-sejtes, 4-sejtes … stádiumokat. Számos szövet (pl. a vulva szövet) csak az későbbi lárva stádiumokban alakul ki.

Az állat egyedfejlődése egyedi sejtszinten meghatározott Nomarski (DIC, differential interference contrast) optikával felszerelt fénymikroszkópia segítségével (4.6. ábra). Ez alapján megállapították, hogy a szövetek egy része csak egy adott embrionális alapító sejtből (blasztéma) származnak, míg más szövettípusok kialakításában többféle alapító sejt vesz részt (4.7. ábra). A bélszövetet felépítő 20 sejt például mind az embrionális E sejt leszármazottai.

4.6. ábra. A C. elegans embrionális egyedfejlődésének diszkrét stádiumai. Bal oldalon a megtermékenyített petesejt, jobb oldalon pedig a peteburokból kikelő L1 lárva képe látható. Ezekben a stádiumokban minden egyes szomatikus sejt egyedileg azonosítható. Ez lehetővé tette, hogy az állat egyedfejlődése egyedi sejtszinten vizsgálható legyen.

4.7. ábra. A blasztomérák (alapító sejtek) kialakulása a C. elegans korai embriógenezise során. A zigóta osztódásával egy anterior AB és egy poszterior P1 sejt képződik (2-sejtes embrió). A P1 sejt további osztódásával jön létre a csíravonal (P sejt leszármazottak; P2, P3, …). Az AB sejt osztódásával egy anterior Aba és egy poszterior ABp sejt képződik. A sejtek nevét a sejtmagok megfelelő színei jelölik. Az E sejt hozza létre a felnőtt állat 20 bélsejtjét. A felnőtt idegrendszer kialakításában viszont többféle blasztéma (pl. Aba, ABp és MS) vesz részt.

A C. elegans anatómiája

A felnőtt állat testfelépítése a többi nematodához hasonlóan tagolatlan, henger alakú, a farki végen elkeskenyedő (4.8. ábra). A hermafrodita C. elegans egyedfejlődése során összesen 1090 testi sejt keletkezik, amelyből 131 apoptózissal (programozott sejthalál) elpusztul az embrionális vagy lárvális fejlődési szakaszokban (Sulston és Horvitz, 1977).A kifejlett hermafroditát végül 959 testi sejt alkotja. A hímek a hermafroditáknál fragilisabb felépítésűek, felnőtt korban 1031 testi sejttel rendelkeznek.

4.8. ábra. A hermafrodita testfelépítése. A felnőtt állat testfelépítése a többi nematodához hasonlóan tagolatlan, henger alakú, a farki végen elkeskenyedő. Az emésztő rendszert az izmos garat, az egyenes lefutású bélcső és a végbél alkotja. Az ivarszerv az „U” alakú gonádkarokból és a test középtáján nyíló vulvából áll.

Az állat emésztőrendszere kétnyílású. A szájnyílás az izmos falú garatban folytatódik, amit az egyenes lefutású bél követ. Hermafroditákban a végbél a farok előtt végződik, hímekben a spermavezetékkel együtt a párzózászlóban végződik. A hermafroditák gonádja páros „U” alakú szerv. A petesejtek a spermatékában termékenyülnek meg, a peték lerakásig az uteruszban tárolódnak. A vulva az állat hasának középtáján nyílik. Hímekben a gonád egykarú.

A C. elegans ivari dimorfizmusa

A C. elegans speciális ivari dimorfizmustmutat: két nemet – önmegtermékenyítő hermafroditákat, valamint hímeket – különböztethetünk meg (4.9. ábra) (Hodgkin, 1987). A hermafroditák a tiszta genetikai vonalak fenntartását, a hímek a genetikai vonalak kombinálását (keresztezést) teszik lehetővé. A hermafroditák öt pár testi és egy pár ivari kromoszómával rendelkeznek (XX kariotípus). Az L4 lárvastádiumban csak spermiumokat, felnőtt korban csak petesejteket termelnek, önmegtermékenyítéssel 200-300 utódot hoznak létre. A hímek csak egy darab X-kromoszómát hordoznak. Ez a XO kariotípus a meiotikus kromoszómák szét nem-válásának (non-disjunction) eredményeként jön létre. A természetes populációkban körülbelül 0,2 % arányban vannak hímek. Megtermékenyítéskor a hím spermiumainak szelekciós előnye van a hermafrodita spermiumokkal szemben. A megtermékenyített hermafrodita akár 1000 utódot is lerakhat. Keresztezés eredményeként a nemek aránya 1:1 lesz. Bizonyos X kromoszóma szegregációért felelős gének (például him-8) funkcióvesztéses mutációja következtében a hímek aránya akár a 37 %-ot is elérheti a populációban hímekkel történt megtermékenyítés nélkül is (Hodgkin, 1979).

4.9. ábra. A C. elegans ivari dimorfizmusa. Az önmegtermékenyítő hermafroditánál (A panel) a hím (B panel) kisebb és vékonyabb testfelépítésű, teste poszterior végén a zászlónak nevezett párzószerv található (C panel). Az A és B panelek azonos nagyítással készültek. A felnőtt állatok testén a gonádokat világos foltokként láthatóak.

A C. elegans, mint genetikai modellrendszer

A C. elegans genomja volt az első megszekvenálták metzoan genom (4.10. ábra) (Hodgkin és mtsai., 1998). Genetikai állománya kompakt, mindössze 100 Mb-nyi szekvencia kódolja a genomban található 19.700 nyitott leolvasási keretet (potenciális gén, ORF – open reading frame). Ezek 70%-ának van humán ortológja. A C. elegans genom 12 %-a transzpozábilis eredetű, amelyek döntő többsége elvesztette mobilitását. A legjobban jellemzett transzpozonokat (Tc1-et és Mos1), mutáns allélek izolálásához használják fel (Johansen és Baillei, 1988). Kémiai és fizikai mutagenezist elsősorban EMS (etil-metán-szulfonát), psoralén és röntgensugárzás segítségével végeznek (Johnsen és Baillie, 1997). A mutáns törzsek egy törzsnévvel (pl. BC1370) rendelkeznek, és a mutáns alléleket is név alapján azonosítják (pl. daf-2(e1370)). Jelenleg közel 6000 C. elegans gént jellemeztek mutáns alléllel, és folyamatban van a szisztematikus (minden génre kiterjedő) deléciós mutánsok előállításának projektje (gene knockout project). A C. elegans kutatások eredményeit internetes adatbázisok foglalják össze. A genetikai információk a WormBase portálon (www.wormbase.org), az anatómiai adatbázis a „wormatlas.org” címen, a nemzetközi törzsgyűjtemény (CGC: Caenorhabditis Genetics Center) pedig a biosci.umn.Edu/CGC/CGC honlapon érhető el.

4.10. ábra. A C. elegans genom egy részlete. Az adott kromoszómát hosszú YAC (yeast artificial chromosome) és rövidebb cosmid klónok fedik le. A kromoszóma szakaszt átfedő klónok sárga színnel vannak jelölve. Ezek alkotják a kontigot (klónokkal teljesen lefedett kromoszóma szakasz). A kromoszómát jelölő zöld vonal alatt azok a gének találhatóak, amelyeket az adott genomi régióba térképeztek vagy klónoztak.

Keresztezés

Kettős mutánsok előállításához az egyik törzs hermafroditáit keresztezzük a másik törzs hímjeivel. Laboratóriumi körülmények között hím egyedeket vad típusú állatok rendszeres keresztezésével, him-8 mutánsok vagy him-8 géncsendesítéssel (RNS interferencia, RNSi) használatával kapunk. A keresztezést úgy kell megtervezni, hogy mindig a normálisan mozgó mutánsból hozunk létre hím egyedeket. A hermafroditák késői L4 vagy fiatal felnőtt korúak legyenek, ellenkező esetben sok önmegtermékenyített petesejtet tartalmazhatnak. Bár a hím egyedek képesek megtermékenyíteni a hermafroditákat, a keresztezés különleges körülményeket igényel. A nőstények igyekeznek elkerülni a folyton partnert kereső hímeket. Hogy csökkentsük a hermafroditák menekülési mozgásterét, az NGM lemez 4/5-öd részét eltávolítjuk, ügyelve, hogy a fennmaradó részen elegendő OP50 baktérium maradjon. A hímeket nagy feleslegben alkalmazzuk. 3-4 L4 hermafrodita mellé 10-15 hím egyedet teszünk. Az állatokat egy éjszakán át 20°C-on tartjuk, majd másnap a hermafroditákat egyesével külön-külön lemezekre rakjuk. Akkor volt sikeres a megtermékenyítés, ha az F1 generáció nagyszámú hímet tartalmaz. Az F1 nemzedékből a hermafroditákat még lárvaként egyesével külön lemezekre tesszük (meggátolva a hímekkel történő keresztezést), majd az F2 nemzedéket teszteljük az adott mutáns fenotípusokra.

RNS interferencia a C. elegans-ban

A funkcionális vizsgálatokat mutáns allélek mellett RNSi alkalmazásával végeznek (Timmons és Fire, 1998; Conte és Mello, 2003). Az RNSi jelenségét duplaszálú RNS (dsRNS) váltja ki, amely a vele homológ szekvenciájú mRNS degradációjához vagy transzlációs gátlásához vezet. Az RNSi használatával valójában „fenokópiát” kapunk (fenotípust kialakító mutáns allél nem található a genomban). C. elegans-ban a módszer igen nagy hatásfokkal működik. A hatás sejtről-sejtre és szövetről-szövetre terjed (szisztematikus), és az utódokba is átjut (Fire és mtsai, 1998; Conte és Mello, 2003).

A dsRNS az állat testébe közvetlenül injektálható. Újabban a táplálékként használt baktériumban expresszálják a kívánt dsRNS-t („etetéses módszer”; Alcazar és mtsai., 2008). A teljes genomszekvencia ismeretében elviekben bármely gén csendesíthető. A kísérletek tervezésénél különös gondossággal kell eljárni az ún. aspecifikus off target hatások elkerüléséért (csak az adott génre jellemző egyedi szekvenciára tervezzük az RNSi klónt).

Genetikai transzformáció

Az állatok transzformálásával lehetőség nyílik a gének expressziós mintázatának feltárására, fehérjék expresszálására, illetve DNS szabályzó elemek vizsgálatára (4.11. ábra). A transzformáció történhet injektálással, ami általában instabil extrakromoszómális DNS-t eredményez, vagy génpuska (bombarding) technikával, ami nagy valószínűséggel a transzgén integrációjához vezet (Berezikov és mtsai., 2004).

4.11. ábra. Transzgénikus C. elegans. A bec-1::gfp transzgén expressziós mintázata egy L4 stádiumú lárvában. A gfp (green fluorescence protein – zöld fluoreszcens fehérje) riporter gén csak meghatározott sejtekben expresszálódik egy adott egyedfejlődési állapotban (expressziós mintázat). Az expresszáló (aktív) sejteket zöld szín jelöli.

A C. elegans-on végzett genetikai vizsgálatok vezettek el a programozott sejthalál genetikájának és számos jelátviteli útvonal mechanizmusának megértéséhez. Sydney Brennert és két közvetlen tanítványát, John Sulstont és Robert H. Horvitzot 2002-ben élettani és orvosi Nobel-díjjal jutalmazták a szervfejlődés (az ebben szerepet játszó jelátviteli utak) és az apoptózis genetikai szabályozásának feltárásáért (4.12. ábra). 2006-ban Andrew Fire és Craig Mello szintén orvosi Nobel-díjban részesült az RNS interferencia folyamatának C. elegansban történt felfedezéséért (4.13. ábra). 2008-ban a kémiai Nobel díjat Martin Chalfie kapta a zöld fluoreszcens fehérjén (GFP) alapuló expressziós rendszerek kidolgozásáért, amelyhez szintén a C. elegans-t használta modell rendszerként.

4.12. ábra. A 2002-es orvosi Nobel díjasok. A képen látható három kutató C. elegans-on végzett kísérletekért részesült az elismerésben. Horvitz és Sulston Brenner egyik első tanítványai voltak. Az elismerésben így egy genetikai iskola részesült.

4.13. ábra. A 2006. évi orvosi Nobel díjasok. Fire és Mello C. elegans-ban fedezték fel a géncsendesítés (RNS interferencia) molekuláris mechanizmusát.