I. Munka a C. elegans-szal

A C. elegans gyakorlatra az általános tűz- és munkavédelmi szabályok érvényesek. A gyakorlaton a C. elegans törzseket Petri lemezekben vizsgálják. A lemezekben NGM agar található, amit csíkokban E. coli OP50 baktérium fed. Az agar felszínén láthatóak a közel 1 mm hosszú, fehérnek tűnő állatok. Az állatokat sztereómikroszkóppal vizsgáljuk alsó megvilágítással (4.14. ábra). A mikroszkópra a lemezeket fedővel lefelé helyezhetjük el. Ha így nem tudjuk a megfelelő fókusztávolságot beállítani, megfordíthatjuk a lemezt, és a vizsgálat idejére levehetjük a tetejét. Ügyeljünk arra, hogy a mikroszkóp ne szennyeződjön! A mikroszkópot mindig csak a vizsgálat idejére tartsuk bekapcsolva. Ez egyrészt fontos a mikroszkóp élettartama miatt. Másrészt a C. elegans érzékeny a melegre. Ha túlmelegedett mikroszkópon vizsgáljuk, az állatok elpusztulhatnak. Ne nyúljunk a táptalajba! Ezzel a lemez fertőződése is minimálisra csökkenthető. A C. elegans nem veszélyes az emberi szervezetre. A táplálékául használt E. coli OP50 törzs uracil auxotróf, a Petri lemezen kívül korlátozott a szaporodása. Ha a munka során mégis szennyeződne a kezünk alapos kézmosás javasolt.

4.14. ábra. C. elegans vizsgálata sztereómikroszkóppal. Bal oldali panel: NGM műanyag Petri lemezek, melyekben agar felszínén, baktérium pázsiton (táplálék; világos fehér folt a lemezeken) tenyésznek az állatok. Középső panel: az NGM agar felszínén látható különböző korú állatok. Jobb oldali panel: alul megvilágítós sztereómikroszkóp.

A gyakorlaton előforduló mutáns törzsek

A gyakorlat első felében a C. elegans mutáns törzsekkel fogunk megismerkedni (15. és 16. ábrák). A vad típusú állatot hasonlítjuk össze több féle mutáns fenotípussal. A kapott Petri csészéken megtaláljuk a vizsgálandó mutáns törzsek nevének hárombetűs rövidítését. Először a vad típust (wild-type, WT vagy N2) vizsgáljuk meg. Ennek az állatnak a fenotípusa, genotípusa megegyezik az eredetileg izolált C. elegans-éval. A lemezen a legnagyobb állatok, a felnőttek formáját, mozgását próbáljuk megfigyelni. Általában a fejük irányában haladnak, színuszoid (S-alakú) mozgással. A testükben kivehetőek az embriók. Az állatok körül lerakott embriók, valamint kisebb méretű, mozgékony lárvákat láthatunk (4.14. ábra, középső panel).

A gyakorlatin vizsgált morfológiai mutáns törzsek:

him-8: Him (High incidence of males) fenotípus. Egy kromoszóma-szétválási rendellenesség következtében magas százalékban jelennek meg XO kariotípusú hím egyedek. A hímek karcsúbbak és mozgékonyabbak. Figyeljük meg a hímek farkán a zászló nevű párzó képletet!

lon-2: Lon (Long), hosszú testméret fenotípus. Az állatok megnyúlt testhossza a sejtek méretének túlzott növekedése következtében alakul ki.

sma-6: Sma (Small) kicsi testméret fenotípus. A Lon mutánssal ellentétes fenotípus, kicsi sejtméret eredménye.

dpy-6: Dumpy (Dpy) tömzsi fenotípus. Ezek az állatok rövid és vastag testtel rendelkeznek.

rol-6: Rol (Roller) fenotípus. Az állatok bőrizomtömlője spirál irányban megcsavarodik a test mentén, ettől mozgás közben pörög az állat a hosszanti testtengely mentén. Domináns mutáció, ezért a mutáns allélt kotranszformációs markerként is használják.

unc-2: Unc (Uncoordinated) fenotípus. Mozgásképtelen (béna, paralizált) állatok, az átlagosnál rövidebbek.

lin-28: Pvl (Prodruded vulva) fenotípus. A hermafroditák vulva szövete kifordul (kitüremkedik) a test ventrális síkjából.

unc-14; dpy-6: Kettős mutáns. Mivel a két gén működése független egymástól, a kettős mutáns mindkét törzs fenotípusát mutatja, azaz Unc és Dpy fenotípusú egyszerre.

let-60(gf): Muv (Multivulva) fenotípus. Domináns mutáció, a hermafrodita állatok ventrális testfalán több vulvakitüremkedés látható.

lin-39: Vul (Vulvaless) fenotípus. A hermafrodita állatokban nem fejlődik vulva szövet. Emiatt az utódok nem tudják elhagyni a mama ivarszervét, az anyában kelnek ki és kezdenek el fejlődni. Ez az anya pusztulásához vezet, amelyet bag-of-worms – egy zsáknyi féreg – fenotípusnak is nevezünk. A Vul mutáns törzsek nem raknak le embriókat az agar felszínére.

4.15. ábra. A gyakorlaton előforduló C. elegans mutáns fenotípusok. WT (wild-type – vad típus): vad típus; Lon (Long – hosszú): hosszú testméretű mutáns állat; Dpy: rövid, „köpcös’” testalakú állat; Unc: béna, paralizált állat, amely nem képese mozogni; Rol (Roller - gördülő): körbe-körbe mozgó állat; Pvl (Protruded vulva): kitüremkedő vulva fenotípusú állat; Muv (Multivulva): több vulvaszövetet tartalmazó állat; Vul (Vulvaless): vulva szövetet nem fejlesztő állat. A fenotípusok részletesebb leírása a szövegben megtalálható.

4.16. ábra. Egy unc-14; dpy-6 kettős mutáns állat. Az állat egyszerre tömzsi, rövid és nem képes mozogni (béna, paralizált). A mendeli szegregáció az F2 nemzedékben 9:3:3:1 hasadási arányt mutat. Az „1” kategória a kettős mutánsok arányát mutatja, amelyek fenotípusa: Unc, Dpy.