II. A Ras jelátviteli útvonal vizsgálata

A gyakorlat második felében a vulva szövet kifejlődésében szerepet játszó Ras jelátviteli útvonal mutánsaival fogjuk az episztázis analízist gyakorolni. A Ras (RTK/Ras/MAPK, Receptor Tirozin Kináz/Ras/Mitogén Aktivált Protein Kináz) jelátviteli kaszkád egy tipikus genetikai útvonal, amelynek központi szerepe van a vulva szövet kialakításában (4.17. ábra). Az útvonal egy ligandum (EGF, epidermal growth factor - epidermális növekedési faktor) szekretálásával „kezdődik”, amely egy konzervélt RTK receptort aktivál. A receptor aztán egy sor citoplazmás átvivő molekula (kinázok) aktivációját eredményezi, amelyek végül egy olyan transzkripciós faktort szabályoznak, amely a vulva kifejlődéséhez szükséges célgének aktivitását határozza meg. Az útvonal normális működése teszi lehetővé a vulva indukcióját az L3 lárvastádium elején. Addig a stádiumig az állat középső része egy „zárt cső”. A vulva szövet kialakulásával egy nyílás (vulva) képződik az állat ventrális részén, amelyen keresztül az embriók elhagyják a hermafrodita ivarkészülékét, illetve a hím spermái a hermafroditába jutnak párosodáskor. A Ras útvonal hiperaktiválódása több vulva kifejlődését (Muv – Multivulva – fenotípus), csökkent működése a vulva indukció elmaradását (Vul – Vulvaless – fenotípus) eredményezi. Ezek az egyszeres mutánsok könnyen felismerhetőek sztereómikroszkóp segítségével. A Vul és Muv fenotípusú egyszeres mutánsok keresztezésével kettős mutánsok állíthatók elő. Világos, hogy egy ilyen kettős mutáns nem lehet egyszerre Vul és Muv is, valamelyik egyszeres mutáns fenotípusa nyilvánul meg a kettős mutánsban (vagy Vul vagy Muv lesz a kettős mutáns fenotípusa). Ez azt mutatja, hogy a mutáns allélek által kijelölt gének nem függetlenül öröklődnek egymástól (nem a mendeli 9:3:3:1 hasadási arányt mutatják az F2 nemzedékben, ahol az 1 a kettős mutánsok aránya), hanem genetikai interakciót mutatnak. Érdemes megjegyezni, hogy a Ras útvonal számos egyedfejlődési lépést szabályoz. A Ras útvonalban deficiens mutáns állatok fenotípusa ezért pleiotróp. Az útvonal teljes hiánya korai lárva életképtelenséget okozhat, de számos más szerv és szövettípus kialakulásáért felelős.

4.17. ábra. A Ras útvonal komponensei C. elegans-ban. A Ras jelátvitelt a szomatikus gonád egyik speciális sejtje, az un. horgonysejt (anchor cell, AC) generálja. Az AC szekretálja a LIN-3 (lineage defective-3; hiányában nem alakul ki a vulva szövet sejtvonala) növekedési faktort, amely egy EGF (epidermális növekedési faktor) ligandum. A LIN-3 (piros kör) a vulva elősejtek membránjában (rózsaszín vonal) található LET-23 RTK receptorhoz (sárga vonal) kapcsolódik, azt dimerizálja (aktiválja). Az aktivált receptor aztán foszforiláció (P) révén egy sor citoplazmás jelátvivő molekulát aktivál (zöld és kék színnel jelölve), amelyek végül a LIN-1 transzkripciós faktort szabályozzák. Ha a LIN-1 aktiválódik, bejut a sejtmagba és ott a vulva kifejlődéshez szükséges gének expresszióját határozza meg. A nyilak aktivációt, a talpas nyilak gátlást jelölnek. lof: loss-of-function (funkcióvesztéses mutáció); GOF: gain-of-function (funkciónyeréses mutáció); Vul: Vulvaless (vulva nélküli) fenotípus; Muv: Multivulva (több vulva) fenotípus.

A jelátviteli rendszerekről általánosságban

Jelátviteli útvonalak és szerepük az egyedfejlődésben

Hogyan fejlődik ki a felnőtt test egy megtermékenyített petesejtből, a zigótából? Mi mondja meg sejteknek, hogy mikor osztódjanak és meddig éljenek? Hogyan tudják az újonnan keletkező sejtek, hogy az egyedfejlődés egy adott pillanatában és a test egy meghatározott pontján milyen sejttípussá kell differenciálódniuk? Milyen molekuláris mechanizmusok biztosítják a sejtek homeosztázisát (stabil működését) az állandóan változó körülmények között? E mechanizmusok hibás működése hogyan vezet patológiás folyamatokhoz? A felvetett kérdések biológiai megismerésünk frontvonalába tartoznak, orvosbiológiai vonatkozásuk jelentős. A fenti kérdésekre adandó válaszok, legalábbis részben, a differenciált génexpresszióban (génaktivitásban) keresendőek. Egy élőlény sejtjei ugyanis azonos génkészlettel rendelkeznek, de sejttípustól és fiziológiai állapottól függően ebből a készletből csak bizonyos géneket működtetnek. A génexpresszió – transzkripció – szabályozása tehát az egyedfejlődés egyik kulcsfontosságú molekuláris színtere. Ha meg tudnánk határozni az egyedfejlődés során keletkező egyedi sejtekben, hogy mely gének milyen mértékben fejeződnek ki, elviekben leírható lenne az egyedfejlődés genetikai programja. Ma még nem vagyunk erre technikailag képesek, és kétséges, hogy valaha is egyáltalán képesek leszünk. Amit ma ismerünk azonban, az sem kevés: a génexpressziót specifikus transzkripciós faktorok szabályozzák, amelyek viszont meghatározott jelátviteli (szabályozó) útvonalak hatására aktiválódnak. Ezeket az útvonalakat genetikai útvonalaknak is nevezik.

A jelátviteli útvonalak központi szerepet játszanak az egyedfejlődés szabályozásában. Lehetővé teszik a sejtsors meghatározást, a szöveti mintázatképződést és a szervek, testtájak elrendeződését. Olyan egyedfejlődés szempontból kulcsfontosságú – ún. „mester” – gének, mint pl. a Hox gének is jelátviteli pályák hatására expresszálódnak, és hatásuk gyakran jelátviteli komponensek transzkripciós szabályozásában nyilvánul meg. A jelátviteli rendszereknek alapvető szerepük van továbbá a sejtek működésének szabályozásában. Aktivitásuk befolyásolja a makromolekulák turnoverét (pl. a fehérjék szintézisét és lebontását), és ezen keresztül a sejtek növekedését, osztódását és túlélését (4.18. ábra). A jelátviteli útvonalak abnormális működése emberben súlyos fejlődési rendellenességek, valamint számos patológiás elváltozás (pl. különböző ráktípusok, neurodegeneratív folyamatok, intracelluláris patogének által okozott fertőzések, diabétesz stb.) kialakulásával kapcsolható össze.

4.18. Ábra. Jelátviteli rendszerek állati sejtekre gyakorolt hatása. A sejtek felszínén lévő specifikus receptorok (nincsenek ábrázolva) teszik lehetővé, hogy a sejtek válaszolni tudjanak a külvilágból érkező (extracelluláris) jelekre. Ezek hatására túlélnek (működnek), osztódnak, differenciálódnak vagy elpusztulnak.

A jelátviteli rendszerek – eltérően a biokémiai útvonalaktól, amelyekben a szubsztrát konverzió valamilyen biológiai termék közvetlen előállítását eredményezi; ilyen pl. a triptofán szintézisben résztvevő enzimek biokémiai útvonala – alapvetően egy adott biológiai információt processzálnak (4.19. ábra). Az üzenet (jel) továbbítása fehérjék aktiválásán (on állapot) vagy gátlásán (off állapot) keresztül valósul meg (4.20. ábra). A jelátvitel végső hatása gyakran differenciált génexpressziós változást eredményez (a genomban kódolt gének egy részének aktivitását). Ezért is nevezik a jelátviteli rendszereket, pontosabban a rendszerek komponenseit kódoló gének hierarchikus láncolatát, másképpen genetikai útvonalaknak.

4.19. Ábra. Egy intracelluláris jelátviteli rendszer modellje. Az útvonal egy ligandum (sárga) révén aktiválódik, amely a fogadó sejt felszínén található receptorhoz (lila) specifikusan képes kötődni. A ligandum-receptor kötődés hatására a receptor aktiválódik. Az így keletkezett biológiai üzenet intracelluláris jelátvivő fehérjék (zöld) kaszkádján keresztül jut el a célfehérjékhez (kék), amelyek végül módosítják a sejt viselkedését. A génexpresszió megváltozása teszi lehetővé az egyedfejlődéshez szükséges sejtes differenciációt (sejtsors meghatározást). Az egyszerűség kedvéért az útvonal csak aktiválási kölcsönhatásokat – nyilak – tartalmaz.

4.20. Ábra. Biológiai jel keletkezése és továbbítása egy jelátviteli kaszkádban. Jelen példában a sejtmembránba ágyazott inaktív receptor (lila) a ligandum (sárga) kötődés hatására dimerizálódik, majd citoplazmatikus doménje foszforilálódik (P). Az így aktiválódott receptor komplex aztán képes aktiválni egy citoplazmatikus jeltovábbítót (zöld): a receptor foszforilálja az inaktív jeltovábbító molekulát. A folyamatban az ATP szolgáltatja a foszfát csoportot és az energiát. Így működnek pl. a receptor tirozin kinázok (RTK), amelyek adott célfehérjék tirozin oldalláncait képesek foszforilálni. Ligandumaik között növekedési faktorokat (growth factors) találunk.

A génexpressziós változást végső soron transzkripciós faktorok közvetítik. Egyedfejlődési szempontból azok a transzkripciós faktorok jelentősek, amelyek jelátviteli kaszkádok hatására aktiválódnak. Biológiai funkciójuk lenyűgözően változatos, az egyedfejlődés különböző lépéseit (sejtsors meghatározás, sejtosztódás, az osztódás sík irányának meghatározása, sejtpusztulás, szöveti mintázatképződés, stb.) kontrollálják. Természetesen ezek a funkciók a transzkripciós faktorok által szabályozott célgének működésén keresztül valósulnak meg.

Főbb jelátviteli rendszerek

A jelátvitel (vagy szignál transzdukció) biológiai jelentése: információs anyagcsere (information metabolism), pontosabban az információ anyagcseréje. Azt a molekuláris eseménysort jelenti, amely során a sejt érzékeli és processzálja (feldolgozza és közvetíti) a környezetből érkező információt. A jelátviteli rendszereket sokféleképpen osztályozzák. Egyrészt lehet a környezetből érkező jel minősége alapján csoportosítani; ez alapján megkülönböztetünk juxtacrine, paracrine és endocrine jelátviteli rendszereket. A juxtacrine rendszerben a ligandumot kibocsátó és a receptort tartalmazó sejtek közvetlenül érintkeznek egymással. Ebben az esetben tehát a ligandum is a sejtmembránban van kihorgonyozva. Ilyen rendszer pl. a Notch jelátviteli útvonal (4.21. ábra).

4.21. Ábra. Juxtacrine, paracrine és endocrine jelátviteli rendszerek. Bal oldali panel: juxtacrine jelátviteli rendszer – Notch útvonal. Delta: ligandum; Notch: receptor; CLS: transzkripciós faktor. A receptor-ligandum kötődés hatására a receptor citoplazmás doménje hasítódik, majd a magba jut, ahol egy transzkripciós faktort aktivál. Középső panel: paracrine jelátvitel – RTK/Ras útvonal. Ras: (monomerikus) GTP-kötő (G) fehérje; GNRP: guanine nucleotide releasing factor; GAP: GTP-áz aktiváló fehérje; GTP: guanozin-trifoszfát; GDP: guanozin-difoszfát. Jobb oldali panel: endocrine jelátviteli rendszer – egy nukleáris receptor modellje.

A paracrine jelátviteli rendszerben a jelkibocsátó sejt az extracelluláris térbe szekretálja a ligandumot. A ligandum egy koncentráció grádiens mentén aktiválja a közelben elhelyezkedő kompetens, tehát a ligandumra specifikus receptorral rendelkező jelfogadó sejteket. Tipikus paracrine rendszer az RTK/Ras jelátviteli útvonal (4.21. ábra). Az endocrine jelátviteli rendszerben az endokrin sejtek által termelt ligandum – hormon – a véráramon keresztül jut el a test távolabbi pontjaira, ahol a megfelelő receptorral rendelkező célsejteket aktiválja. Ide tartoznak a nukleáris hormon receptor útvonalak (4.21. ábra). A hidrofób molekulák (pl. szteroid és thiroid hormonok, retinoidok, D vitamin) átjutnak a sejtmembránon, majd hozzákötődnek intracelluláris receptoraikhoz. Az így aktivált receptorok aztán specifikus DNS szekvenciákhoz kötődve szabályozzák a célgének expresszióját.

Egy másik csoportosítási szempont a sejtfelszíni receptorok funkcióját veszi alapul. E megközelítés alapján a jelátviteli rendszerek osztályozását az 1. táblázat mutatja.

Ezeknek a jelátviteli rendszereknek az egyedfejlődési és fiziológiai jelentőségét mutatja többek között a következő tény: a C. elegans genomban található gének (~19.700) mintegy 11%-a (~2200) jelátviteli komponenst kódol.

Jelátviteli rendszerek genetikai logikája

Az egyedi jelátviteli rendszerek komponensei funkcionálisan lineáris „útvonalakba” rendeződnek. Hogy egy adott útvonalban melyik komponens található elöl (upstream) és melyik hátul (downstream), azaz ki szabályoz és kit szabályoznak, episztázis (kettős mutáns) elemzéssel lehet hatékonyan feltárni. A jelátviteli rendszerek genetikai logikájának bemutatása előtt – mintegy ellenpéldaként – a biokémiai útvonalak szabályozási logikáját tekintsük át.

Egy biokémiai útvonalban a komponensek adott szubsztrátok átalakítását végzik. Olyan ez, mint egy autó összeszerelő üzem, ahol a futószalagon készülő termékhez minden munkás (enzim) hozzátesz valamit (22. és 23. ábrák).

4.22. ábra. Egy autó összeszerelő üzem, mint a biokémiai útvonal modellje. Az enzimeket munkások, a szubsztrát konverziót egy-egy munkaállomás reprezentálják. A végtermék egy kész „alkatrész” vagy maga az összeszerelt autó.

4.23. ábra. A triptofán bioszintézis biokémiai útvonala. A kiindulási szubsztrát a korizminsav, amely számos átalakulási lépésen keresztül L-triptofánná alakul. Az egyes átalakulási lépéseket enzimek katalizálják, amelyeket gének trpE, trpD, …, trpA kódolnak.

Vegyünk egy hipotetikus biokémiai útvonalat, amelyben 2 enzim („A” és „B”) végzi a szubsztrátok (X és Y) átalakítását (4.24. ábra). Az „A” enzim katalizálja az X-ből Y-ba, a „B” enzim az Y-ból Z-be történő konverziót. A végtermék Z, amely pl. egy festékanyagot, tehát egy színt határoz meg. Ez a szín példánkban legyen a fekete. Az X szubsztrát piros, az Y szubsztrát pedig barna színt határozzon meg. Az „A” enzimet kódoló a gén funkcióvesztéses (lf) mutációja felfüggeszti az X konverzióját: a homozigóta a mutáns egyedek (a-/a-) piros színűek lesznek (csak X színanyag lesz a sejtekben, mert nem tud Y-ná konvertálódni és természetesen Z-vé sem). A „B” enzimet kódoló b gén lf mutációja meggátolja az Y konverzióját Z-vé. A homozigóta b mutánsok (b-/b-) barna színűek lesznek (zömében Y lesz a sejtekben, mert az X-ből Y-ba történő konverziót az A enzim lehetővé teszi). Az ab kettős mutánsokban (a-/a-; b-/b-) sem az X-ből Y-ba, sem Y-ból Z-be történő konverzió nem megy végbe.

4.24. Ábra. Egy biokémiai útvonalban az upstream komponens hat episztatikusan. A, Egy hipotetikus vad típusú rendszer, amelyben a végtermék (Z) határozza meg a fenotípust (fekete szín). „A” és „B” az útvonal két komponense. B, a egyszeres mutáns (a-) fenotípusa piros. Hiába van „B”, nincs szubsztrát (Y), amit átalakítson. C, b egyszeres mutáns (b-) fenotípusa barna. D, ab kettős mutáns fenotípusa piros. A fekete nyilak működő, a szürke nyilak nem működő folyamatokat jelölnek.

Mivel a folyamat az útvonal elején akad el, a kettős mutáns sejtekben csak kiindulási X szubsztrát lesz. Ezért az a-b- kettős mutánsok fenotípusa piros, vagyis megegyezik az a- egyszeres mutánsok fenotípusával. Egy biokémiai útvonalban tehát az upstream komponens mutáns fenotípusa nyilvánul meg (episztatikus) a kettős mutánsban.

Egy jelátviteli – genetikai – útvonalban nincs termékkészítés (hacsak a differenciált génexpressziót nem tekintjük terméknek), „csupán” információ (szabályozási jel) továbbítás történik. Az útvonal komponensei között kétféle kölcsönhatás létezhet: aktiválás vagy gátlás. Gátlás esetén a két egyszeres mutáns fenotípusa eltérő, legyen pl. X és Y. A megfelelő fenotípusokat kialakító géneket nevezzük a-nak és b-nek, az általuk kódolt fehérjéket „A”-nak és „B”-nek. Az a- egyszeres mutáns fenotípusa X, a b- egyszeres mutáns fenotípusa Y. Ha az a-b- kettős mutáns fenotípusa X, akkor az alábbi szabályozási kapcsolat írható fel:

Ez azt jelenti, hogy az „A” és „B” fehérjék egy útvonalban hatnak, és „B” gátolja az „A”-t. Más szavakkal, „A” episztatikus „B” felett, „közelebb” van a kivitelezéshez, vagyis a génszabályozáshoz. Egy jelátviteli útvonalban a downstream komponens mutáns fenotípusa nyilvánul meg (episztatikus) a kettős mutánsban. Miért is írható fel egy ilyen összefüggés? Vegyünk egy hipotetikus jelátviteli rendszert, amelyben két gén terméke ilyen relációt mutat, azaz a „B” fehérje gátolja az „A” fehérje működését (4.25. ábra).

4.25. Ábra. Egy jelátviteli útvonalban a downstream komponens hat episztatikusan. A, Vad típusú rendszerben a „B” gátolja az „A” aktivitását, de nem teljesen („kicsi A”). B, b- mutánsban nincs „B” fehérje (pont jelzi), így a gátlás hiányában az „A” hiperaktiválódik („nagy A”). Hiperaktív „A” Y fenotípusban nyilvánul meg. C, a- mutánsban nincs „A” fehérje (pont jelzi), ez X fenotípusban nyilvánul meg. D, a-b- kettős mutánsban nincs „B” és nincs „A” (két pont jelzi). Az „A” hiánya megint X fenotípusban nyilvánul meg. Az „A” és „B” fehérjék egy jelátviteli útvonal két tetszőleges komponense, „B” upstream, „A” downstream helyezkedik el az útvonalban. Az útvonal aktivitását „A” aktivitása határozza meg. A fekete nyilak és talpas nyilak működő, a szürke nyilak és talpas nyilak redukáltan működő folyamatokat jelölnek. A kétszer áthúzott talpas nyilak nem működő folyamatokat jelölnek.

Vad típusú rendszerekben gyakori, hogy mindkét fehérje bazális aktivitást mutat (vegyük észre, ezért létezhet két egyszeres mutáns fenotípus!). „B” aktivitása tehát gátolja az „A”-ét, de a gátlás nem teljes. (Egy ellenpélda az inzulin/IGF-1 útvonal, amelynek upstream komponensei teljesen represszálják az útvonal „végén” elhelyezkedő forkhead FoxO transzkripciós faktort, ezért a FoxO lf mutánsok közel vad fenotípusúak.) b- egyszeres mutánsokban nem érvényesül a „B” fehérje gátló funkciója, ezért „A” hiperaktiválódik. Valójában ez nyilvánul meg az Y mutáns fenotípusban. a- egyszeres mutánsokban „B” működik, és gátolná az „A”-t, de nincs mit gátolnia az a- mutáció miatt (nincs „A” fehérje). Ebben az esetben „A” funkciója teljesen eltűnik, így alakul ki az X mutáns fenotípus. Az Y fenotípust tehát „A” hiperaktiválódása, az X fenotípust „A” (teljes) hiánya okozza. Az a-b- kettős mutánsokban nincs meg a „B” gátló funkciója, de nincs ami hiperaktiválódjon, mert az „A” funkció is hiányzik. Mivel nincs „A”, ezért a fenotípus továbbra is X (4.25. ábra).

Összefoglalva, ha a- egyszeres mutáns fenotípusa X, b- egyszeres mutáns fenotípusa Y, és a-b- kettős mutáns fenotípusa X, akkor az „A” és „B” fehérjék egy útvonalban hatnak, melyben „B” gátolja az „A” aktivitását. „B” az útvonal upstream (gátló), „A” az útvonal downstream (gátolt) komponense. A b- mutáns fenotípus (Y) kifejeződése tehát az „A” funkciójának függvénye: a és b gének szintén genetikai interakciót mutatnak.

Aktiválási reláció esetén a két egyszeres mutáns fenotípusa megegyezik; b- egyszeres mutáns és a- egyszeres mutáns legyen pl. egyaránt X fenotípusú (a két fehérje funkciója egy irányba hat). Ebben az esetben nem lehet lf mutánsokkal (gén)sorrendet meghatározni. Helyette a kettős mutánsokban az egyik gén lf mutáns alléljét kombináljuk a másik gén funkciónyeréses (gf) alléljével (vagy más módon hiperaktivált, pl. túlexpresszált formájával) és vica versa. E kombinációkban is a megnyilvánuló (episztatikus) egyszeres mutáns (lf vagy gf) fenotípus határozza meg, melyik jelátviteli komponens van downstream az útvonalban.

Jelátviteli kapcsolatok

Az egyedi fő jelátviteli útvonalak száma viszonylag limitált (1. táblázat). Az általuk meghatározott sejttípusok azonban figyelemreméltó sokféleséget mutatnak. A C. elegans hermafrodita állat kifejlett testét például 959 különböző szomatikus sejt alkotja. Ezek mindegyike egyedi, külön elnevezéssel illetik, különböző funkciókra specializálódnak. Ha továbbá figyelembe vesszük a jelátviteli rendszerek nagyfokú konzerváltságát, akkor nyilvánvaló annak a kérdésnek a felvetése, hogyan fordítódnak le a meglehetősen általános jelátviteli üzenetek nagyszámú specifikus génexpressziós mintázattá.

A felvetett kérdésre adott válaszok nagyrészt a jelátviteli útvonalak szövevényes kapcsolatában keresendők. Jelátviteli kapcsolatok – signalling crosstalk – alapvetően három szinten valósulhatnak meg. Egyrészt az útvonalak „végén”, vagyis célgének szabályozó régiójában. A promóterek (az átíródó DNS szakaszokat szabályozó upstream régiók) ui. molekuláris komputerekként működnek; érzékelik és integrálják a bejövő jelátviteli impulzusokat, azaz meghatározzák a bejövő jelek minőségét és mennyiségét, és ennek függvényében állítják be a szabályozott gén expressziós szintjét egy sejtben. Mivel egyetlen célgén expressziós szintje elviekben tetszőlegesen sokféle lehet, ez a mechanizmus már önmagában is nagyszámú sejttípust tud meghatározni. Példaként a Drosophila even-skipped (eve) gén expresszióját említhetjük. Az eve először azokban a progenitor sejtekben expresszálódik, amelyekből a Drosophila dorzális izomzata fejlődik ki. Az eve expresszióját számos jelátviteli útvonal befolyásolja: a Ras, Dpp (Decapentaplegic) és Wg (Wingless) útvonalak kombinált aktivitása alakítja ki a megfelelő Eve szintet (4.26. ábra).

4.26. Ábra. A génexpresszió kombinatorikus szabályozása. Az eve gén szabályozó (enhanszer) régiójához számos jelátviteli útvonal transzkripciós faktora (TF) (kép jobb oldalán felsorolva) kötődik specifikusan. A kötődő TF-ok minőségének és számának (hány kötőhely van) integrációja dönti el végső soron az eve expressziós szintjét egy adott sejtben. A kialakult Eve szint egy adott sejttípust határoz meg.

Az útvonal keresztbeszélgetések második szintje a génexpresszió feletti upstream szakasz. Az itt funkcionáló fehérjék (ligandumok, receptorok, kinázok, foszfatázok, scaffold fehérjék, stb.) képesek egy másik jelátviteli pálya komponensének aktivitását közvetlenül (pl. fizikai interakcióval) vagy közvetve (genetikai interakcióval) befolyásolni. Erre kitűnő példa a Ras monomerikus G-fehérje működése, amely – a kanonikus MAP kináz-kináz-kinázon túl – az inzulin/IGF-1 útvonalba tartozó foszfatidil-inozitol 3-kinázt (PI3-kináz) is aktiválhatja.

Végül a harmadik jelkommunikációs szintet azok a (cél)transzkripciós faktorok képezik, melyek miután aktiválódtak egy jelátviteli input hatására, egy másik jelátviteli pálya upstream komponensének expresszióját kontrollálják. Így jönnek létre a „lineáris” útvonal kapcsolatok.

A vulva szövet kifejlődése C. elegans-ban

A C. elegans vulva szövete (26 és 27. ábrák) 6 db [P(3-8).p] vulva elősejtből (VPC;  Vulval Precursor Cell) alakulhat ki az L3-L4 stádiumokban.

4.26. ábra. Egy C. elegans hermafrodita pásztázó elektronmikroszkópos képe. A piros nyíl mutatja a vulva szövet pozícióját az állat ventrális részén (az állat az oldalán fekszik).

4.27. ábra. A vulvaszövet kilakulásának anatómiája. Az L3 lárvastádiumban a gonadális horgony sejtből (AC) egy konzervált aktiváló jel érkezik (Ras szignál), amelynek hatására a 3 legközelebbi vulva prekurzor sejt VPC [P(5-7).p] sorozatosan osztódik és létrehozzák a kifejlett állat 22 sejtből álló vulva szövetét. Az összes többi VPC [P(3,4,8).p] egyszer osztódik, majd fuzionálnak a ventrális hipodermisszel.

A differenciációt a gonádban található horgony sejtből és a hipodermiszből érkerő jelek iniciálják. A kezdetben azonos fejlődési potenciájú VPC-k közül a három középső VPC [P(5-7).p] leszármazottai vesznek csak részt a vulva kialakításában. A horgony sejthez legközelebb található P6.p alakítja ki a vulva fő szövetét. Ez az elsődleges vulva sejtsors (1). A P6.p két szomszádja a P5.p és P7.p sejteket másféle hatás éri el, hatásukra másodlagos vulva sejtsors (2) irányba fejlődnek. Ezek utódsejtjei a vulva támasztó szövetét képzik. Ennek hiányában a vulva kilóg a testfalból, úgynevezett protruded vulva (Pvl) alakul ki. A többi VPC a hipodermiszbe olvad, ez a harmadlagos vulva sejtsors (3). Amennyiben a sejtek károsodnak a vulva szövetének kialakulása előtt a távolabbi VPC-ék képesek átvenni a hiányzó sejt szerepét (Sulston és Horvitz, 1977).

A vulva fejlődés rendellenességei többféle mutáns fenotípust eredményezhetnek. A VPC-k hiánya vagy a szignalizációs útvonalak hibája további fenotípusokat eredményeznek. A vulva teljes hiányát vulva hiányos (Vulvaless; Vul) fenotípusnak nevezzük (4.28. ábra). Vulva hiányában az állat képtelen lerakni a petéket, azok benne kelnek ki. A kikelő lárvák az „anya” nedveit fogyasztják, míg végül annak csak kutikulája marad, ekkor a kikelt lárvák kitörnek belőle. Ezt „egy zsák féregnek”, bag of worms fenotípusnak hívjuk. Érdekesség, hogy táplálék hiányában a vulva fejlődése gátolt, az anya így javítja az utódok túlélési esélyét. A Vul fenotípusú hermafroditák természetesen nem keresztezhetőek. Ezzel a fenotípussal ellentétes fenotípus, mikor több, akár az összes VPC elsődleges sejtsorsúvá válik. Ekkor 2-6 vulva is kialakulhat a testfalon. Ez a sokvulvás (Multivulva, Muv) fenotípus. A kialakult vulvák közül csak 1 funkcionális.

4.28. ábra. Különböző vulva fenotípusok. A vad típusú vulva a 3 középső VPC-ből [P(5-7).p] alakul ki. A Vul (Vulvaless) vulva az induktív jel (Ras szignál) hiánya következtében alakul ki; egyik VPC sem indukálódik vulva sejtsorssá. A Muv (Multivulva) fenotípus az induktív jel hiperaktiválódásának eredménye, melynek következtében a tartalék VPC-k [P(3,4,8)p] is aktiválódnak.

Első lépésként vizsgáljuk meg az útvonal egyszeres mutánsainak fenotípusát: lin-45, let-23, lin-1, let-60 és lin-15 egyszeres mutánsokat vizsgálunk. A Ras útvonal génjeinek mutációi Vul vagy Muv fenotípust eredményeznek (4.28. ábra). Figyeljük meg a lemezeket, hogy azokon előfordulnak-e „bag of worms” (Vul) vagy több apró kitüremkedő vulvákkal (Muv) rendelkező állatok? Jegyezzük fel a fenotípusokat:

Második lépésben vizsgáljuk meg a kettős mutánsok fenotípusát (ezekben mindig egy Muv egyszeres mutánst kombinálunk egy Vul egyszeres mutánssal). Sötéttel emeljük ki, melyik egyszeres mutáns fenotípusát látjuk a kettős mutánsban (egy állat nem lehet egyszerre Muv és Vul is !).

A kapott eredményeket az átláthatóság kedvéért a következő táblázatba rendezhetjük

Muv

Vul

lin-1

let-60

lin-15

lin-45

Muv

Vul

Vul

let-23

Muv

Muv

Vul

Most az episztázis analízis logikáját követve vázoljuk fel a Ras jelátviteli útvonalat. Vegyük figyelembe, hogy az ellentétes fenotípus a két komponens közötti gátlásra utal, és hogy a kettős mutáns fenotípusa az „downstream” komponens fenotípusát mutatja. Haladjunk sorban a kettős mutánsok vizsgálatával:

Pl. a lin-45; let-60 kettős mutáns fenotípusa Vul. Mivel az egyszeres mutánsok közül a lin-45 mutatja ezt a fenotípust, a két gén között a következő kapcsolatot írhatjuk fel:

Tehát a lin-45 van downstream, és az negatívan szabályozott (gátolt). A kapott eredmény nem jelenti, hogy a két gén között közvetlen kapcsolat van. Az episztázis eredményét nem befolyásolja, hogy szomszédos vagy távolabbi génekről van-e szó.

Végezzük el az analízist a többi kettősmutánssal is.

Végül állítsuk össze a teljes útvonalat:

Most korrigáljuk a kapott eredményt annak figyelembe vételével, hogy a let-60 egy „gain-of-function” (gf), azaz funkciónyeréses mutáns. Ez a fajta mutáció a gén túlműködését eredményezi. Ennek hatása, hogy a kapott fenotípus az ellentéte a gén „loss-of-function”, vagyis funkcióvesztéses mutánshoz képest. Tehát a let-60(lf) mutáns elvileg Muv fenotípusú. Ha két gén mutációja azonos fenotípust eredményez, a köztük lévő kapcsolat aktiváció.

Tehát a tényleges episztatikus (szabályozási) kapcsolat:

Ezeket a genetikai interakciókat episztázisnak nevezzük. Ide tartoznak a recesszív episztázis (hasadási arány 9:3:4 vagy 9:4:3 – vad:egyik egyszeres mutáns:másik egyszeres mutáns), amelyben a kettős mutáns fenotípusa beleolvad az egyik egyszeres mutáns fenotípus kategóriába (a gének recesszíven öröklődnek). A vulva elemzés példa egy tipikus recesszív episztázis. A domináns episztázis hasadási aránya 12:3:1 (domináns mutáns:vad:másik egyszeres mutáns). Itt az egyik gén öröklődése domináns. Ebben az esetben sem látható önálló kettős mutáns fenotípus kategória.