Komplementáció

A klasszikus genetika egyik fontos eszköze a mutánsok előállítása és vizsgálata. Azonos fenotípust mutató mutánsokról a komplementációs (más néven cisz-transz) teszttel határozhatjuk meg, hogy azonos vagy különböző génekben történtek-e a mutációk. Az egy génen belüli a mutációk egymás allélikus változatai. Fontos megjegyezni, hogy komplementációs vizsgálatot csak recesszív mutációkkal, allélekkel tudunk végezni.

A komplementációs analízis lényege, hogy megállapítjuk a heterozigóták fenotípusát. Könnyű belátni, hogy ha a két mutáció cisz helyzetben helyezkedik el, akkor (1. és 2. ábrák) akár azonos akár különböző génekben történt a mutáció vad fenotípust tapasztalunk, hiszen az egyik kromoszómáról vad típusú géntermék keletkezik. A számunkra fontos információt a transz heterozigóták fenotípusa rejti. Ha a két mutáció azonos génben található a transz heterozigóta fenotípusa mutáns lesz, mindkét kromoszómáról hibás géntermék keletkezik. Ha a mutációk két különböző gént érintettek, a transzheterozigóta vad fenotípusú lesz, mindkét génből lesz vad allél az élőlényben.

Komplementáció vizsgálat nem allélikus mutációknál

5.1. ábra Komplementáció vizsgálat nem allélikus mutációk esetén Vad fenotípus alakul ki a heterozigótákban, ha a két mutáció különböző génekben található. Amikor cisz helyzetben találhatóak a mutációk az egyik kromoszómáról csak hibás fehérjetermék keletkezik mindkét génről (A, B), a másik kromoszómáról azonban mindkét génről vad típusú fehérje íródik át. Recesszív mutációk esetében tehát az élőlény vad fenotípusú lesz. Transz helyzetben szintén termelődik vad típusú fehérjetermék mindkét génről.

Vagyis megfordítva, ha létrehozzuk a transz heterozigótát és az vad fenotípust mutat, a vizsgált mutációk két génben lokalizáltak, ha mutáns fenotípusú egyetlen gén allélikus változatatai.

Komplementáció vizsgálat allélikus mutációknál

5.2. ábra Komplementáció vizsgálat allélikus mutációk esetén. Ha a mutációk azonos génben találhatóak eltérő fenotípust kapunk cisz és transz heterozigóták esetében. Amikor cisz helyzetben találhatóak a mutációk az egyik kromoszómáról az érintett génről (A) hibás fehérjetermék keletkezik, a másik kromoszómáról azonban vad típusú fehérje íródik át. Recesszív mutációk esetében tehát az élőlény vad fenotípusú lesz. Transz helyzetben azonban az A génről minkét kromoszóma mutáns allélt tartalmaz, vagyis csak mutáns fehérje keletkezik, az élőlény fenotípusa mutáns lesz.

Miért alakulhat ki két gén mutációja esetén azonos fenotípus? A legegyszerűbb eset, ha a gének termékei egy útvonalon működnek, akár bioszintetikus, akár jelátviteli útvonal esetében. Bioszintetikus útvonal közül képzeljünk el egy útvonalat, melynek végterméke a lila pigment mely a növény virágjában megtalálható. Ha több fehér virágszínű növényt találunk a komplementációs analízissel megállapíthatjuk, hogy egy vagy több génben történt-e a mutáció (5.3. ábra). Ha két fehér virágú növény keresztezünk és az első generációban (F1) lila színű virágokat kapunk, a mutáció különböző génekben történt, ha az első generációban minden növény fehér virágú, azonos génben történt a mutáció. A bioszintetikus utaknál csak akkor kapunk azonos fenotípust különböző gének esetében, ha az előanyagból kialakuló köztes termék színtelen, illetve általánosabban, ha a köztes terméknek nincs önálló fenotípusa . Vegyük észre, ugyanezen mutációkkal végzett vizsgálat során, ha F1 után megvizsgálnánk F2 generációt is 9:7 hasadási arányt kapnánk, vagyis komplementer öröklésmenetet.

Virágszín öröklődés

5.3. ábra Egy virág színének öröklődése. Egy kék/lila virágú növény esetében három független, fehér virágszínű mutánst találtak. A fehér virágú növények keresztezéséből egyik esetben fehér virágú növényeket kaptunk. Ebben a keresztezésben a mutációk nem komplementálták egymást, tehát azonos génekben találhatóak. A másik keresztezés eredményeként vad/lila/kék virágú utódokat kaptunk. Ebben az esetben a mutációk komplementálták egymást, a mutációk különböző génekben találhatóak. A feltételezett bioszintetikus útvonalon tehát két enzim található, melyek mutációi azonos (fehér) fenotípusú virágokat alakítanak ki. A komplementációs analízis önmagában nem alkalmas arra, hogy eldöntse mely enzim működik korábban az útvonalon.

Másik lehetőség, ha nem két különböző lépés enzimei szenvednek mutációt, hanem valamely lépést egy heterodimer katalizál és a fehérjekomplex bármely tagjának mutációja esetében az nem működőképes.

Jelátviteli útvonalak között is találhatunk példát: emlékezzünk csak a C. elegans fejezetben megismert vulva fejlődés útvonalára. Több gén mutációja is vulvanélküli (vulvaless) fenotípust alakíthat ki, illetve természetesen egy-egy génnek is több mutáns allélja ismert.

A közös útvonalon kívül is elképzelhető, hogy két gén terméke azonos fenotípus kialakításában játszon szerepet. Gondoljunk csak arra, hogy a C. elegans genomjában száznál több unc gén ismert, amelyek mindegyikének mutációja mozgásképtelen állatokat eredményez. Az állatok igen eltérő okokból lehetnek bénultak, például: miozin mutációja, idegrendszerfejlődés szabályozása vagy ingerületátvivő anyagok hiánya.

Végül lássunk egy humán példát is. Az alábbi családfa a siketség öröklődését mutatja be. Látható, hogy a siketséget recesszív allélek alakítják ki, azonban a különböző gének mutációjára homozigóta siketek házasságából halló gyermekek születnek (5.4. ábra).

Siketség öröklődése

5.4. ábra A siketség öröklése. A vizsgált házaspár mindkét tagja siket. A siketség esetükben recesszív módon öröklődött (a szüleik, az ábrán az egyes generáció, hallók voltak). Gyermekeik mind hallók, ebből következtethetünk arra, hogy a szülők eltérő gének mutációi miatt voltak siketek.

T4 fág komplementációs vizsgálata

A gyakorlat során Seymour Benzer híres komplementációs analízisét mutatjuk be. Benzer elegáns kísérleteihez, melyben a gén fogalmát szerette volna pontosítani, a T4 fágot választotta alanyul. A T4 fág egy az E. colit elpusztítani (lízálni) képes vírus (5.5. ábra).

T4 bakteriofág

5.5. ábra A T4 bakteriofág. (A) Jól megfigyelhető a fágok struktúrája: a DNS-t tartalmazó feji rész (kapszid), a rövid nyaki rész, és a hosszú, rugalmas talprész, a jellegzetes fehérjeszálakkal. (B) T4 fágok baktérium sejtet fertőznek. (Források: http://www-physics.ucsd.edu/~des/Viral_DNA_Packaging.html és Wikipédia)

A T4 fág mutánsokat vizsgálva találtak olyanokat mely a szokásosnál nagyobb tarfoltot (plakk) képeztek baktériumpázsiton. Ezeket a mutánsokat feltételezhetően gyorsabban pusztítják el a baktériumokat, mint vad fágok, ezért gyorsan lizálónak nevezték el, amelynek rövidítése az angol rapid lysis kifejezésből az r lett.

Az r mutánsok a T4 fág genomjának három lókuszára térképeződtek (rI, rII, rIII). Benzer ezek közül az rII-t kiválasztva szerette volna megvizsgálni, hogy funkcionálisan egy vagy több egység található-e a lókuszon. A komplementációs vizsgálatokhoz ezek a mutánsok különösen alkalmasak, mert E. coli K12(λ) törzsét nem képesek elpusztítani csak a B jelű törzset. Ezek a mutánsok kondícionális mutánsoknak tekinthetőek, a K12 törzs jelenti a restriktív körülményt, a B törzs a permisszív környezetet.

Benzer eredményei azt mutatták, hogy két funkcionális egység (gén) található az rII lókuszon belül, melyeket elnevezett rIIA-nak és rIIB-nek. Benzer nem a gén kifejezést használta a funkcionális egység megnevezésére, hanem megalkotta cisztron fogalmát. A cisztron, vagy komplementációs csoport az a funkcionális egység, amelyen belül a mutációk transz helyzetben nem komplementálják egymást. A cisztron kifejezés mára kikopott az általános használatból, tulajdonképpen a gén szinonímájaként alkalmazhatjuk.

Hogyan lehet komplementációs vizsgálatot végezni haploid organizmusokkal, mint amilyenekk a bakteriofágok és baktériumok? Baktériumok esetében a lac operon fejezetben megismert parciális diploid előállítási módszerekkel. Fágok esetében a koinfektálás jelenti a megoldást. Koinfekció esetén egyetlen baktérium sejtet két eltérő genomú fággal fertőzünk meg egyszerre. Az rII lókusz vizsgálatakor a konifekciót E. coli K12(λ) törzsén végezzük, ha a mutációk képesek egymást komplementálni (különböző génekben, cisztronokban találhatóak) feltisztulást tapasztalunk, ha nem komplementálják egymást nem látunk feltisztulást (5.6. ábra).

Komplementáció vizsgálat T4 fág rII lókuszán

5.6. ábra Komplementációs vizsgálat T4 fág rII lókuszában. Escherichia coli sejteket koinfektálunk két különböző mutáns rII fággal. Ha mindkét mutáció azonos génben található (rIIA), a fágok nem képesek a baktériumot, elpusztítani, lizálni, újabb fágok nem szabadulnak ki a baktérium sejtből, tehát nem keletkezik tarfolt. A második esetben, jobb oldalon, a mutációk különböző génekben találhatóak, komplementálni képesek egymást. A baktérium sejtet a fágok lizálják és újabb fágok keletkeznek, melyek aztán tarfoltot alakítanak ki a baktériumpázsiton.

A koinfekciió esetén lehetőség van az eltérő genomú fágok közti rekombináció vizsgálatára is. Gondoljuk végig a rekombináció és komplementáció közti különbséget az rII lókusz esetében! Rekombináció után új genotípusú fág utódok keletkeznének, míg komplementáció után csak az eredeti (szülői) genotípusú fágok jönnek létre. A fenti ábrán tehát a két mutáció közti rekombináció esetén létrejöhet vad genotípusú utód fág, illetve a két mutációt cisz helyzetben tartalmazó, kettős mutáns fág is.

Benzer nem elégedett meg a komplementációs vizsgálatokkal. Elvégezte az rII lókusz finomtérképezését is. Pont mutánsok, deléciós mutánsok térképezésével igazolta, hogy a gén nem oszthatatlan egység, (mint azt korábban a gyöngy modellben feltételezték), mutáció és a rekombináció egysége a bázispár.

T4 rII bakteriofág-mutánsok komplementációjának vizsgálata

Felhasznált anyagok, eszközök

  • NA táptalajok

  • NAF (félfolyékony Nutrient agar)

  • Escherichia coli K12(λ) és B törzsének tenyészete

  • hat, különböző T4 rII mutáns

  • automata pipetta

A gyakorlat menete

A gyakorlat során 6 darab rII mutánssal végzünk komplementációs vizsgálatot. Meghatározzuk, melyek tartoznak azonos cisztronba. A vizsgálat sorrán cseppentéses vizsgálatot végzünk. Ebben a kísérletben tehát nem egyedi plakkokat fogunk látni, hanem a fágok felcseppentési helyén a feltisztulás jelzi a baktériumok lízisét.

A mutáns fágok fenotípusát megvizsgáljuk E. coli K12(λ) és B baktériumtörzsön is. Ezt a két lemezt használjuk kontrollként a komplementációs vizsgálatokhoz, csoportonként elegendő egy-egy lemezt elkészíteni. A lemezekhez összemérünk:

1. tesztlemez

2. tesztlemez

0,2 ml E. coli K12(λ) szuszpenzió            

0,2 mlE. coli  B szuszpenzió

3 ml 45°C-os NAF

3 ml 45°C-os NAF

A baktéiumszuszpenziót is tartalmazó lágyagart(NAF) NA lemezekre öntjük és eloszlatjuk. A lemezeket 10 percig hagyjuk megszilárdulni. A tesztelendő T4 fág szuszpenziójából 5 μl-t cseppentsünk a teszt-lemez felszínére (ügyelve arra, hogy a pipettahegyet ne nyomjuk bele az agarba, és a csepp ne folyjon szét túl nagy területre). Ezt megismételjük az összes vizsgálandó fág-szuszpenzióval. A lemezeket 37°C-on inkubáljuk egy éjszakán át.

Komplementáció vizsgálatához páronként egy-egy NA lemezre a következő fedőagart öntik:

0,2 mlE. coli K12(λ) szuszpenzió

3 ml 45°C-os NAF

A lemezeket 10 percig hagyjuk megszilárdulni. A tesztelendő T4 fág kevert szuszpenziójából 5 μl-t cseppentsünk a teszt-lemez felszínére. Ezt megismételjük az összes vizsgálandó fág-keverékkel. A lemezeket 37°C-on inkubáljuk egy éjszakán át.

Feladat:

  1. Vizsgálja meg a lemezeket, hogy tapasztal-e tisztulást a felcseppentés helyén!

  2. Sorolja be az egyes fágtörzseket komplementációs csoportokba!

Példafeladatok

1. Tételezzük fel, hogy a fenilalanin bioszintézisét két enzim, pheA és pheB gének termékei végzik egy útvonalon. A enzim egy szubsztrátot (1) alakít át egy feltételezett köztes termékké (2). B enzim ezt a köztes terméket alakítja át fenilalaninná.

Öt fenilalanin auxotróf mutánst sikerült létrehoznunk (m1-m5). A mutánsok azonos fenotípusúak, nem képesek fenilalanint szintetizálni, tehát képtelenek olyan tápközegben növekedni, mely nem tartalmazz ezt az aminosavat. Mind az öt mutáció recesszív.

Különböző vizsgálatokkal meghatározták hogy az m1, m2 és m4-es mutációk a pheA, az m3 és m5 mutációk a pheB génben találhatók.

  1. Létrehozzunk egy parciális diploid baktérium törzset, amely m1-es és m2-es mutációkat hordoz (mindkét génre heterozigóta a törzs). Milyen fenotípusú lesz a parciális diploid baktériumunk?

  2. Létrehozzunk egy másik parciális diploid baktérium törzset, amely m1 és m3 mutációkat hordoz (heterozigóta). Milyen lesz ennek a törzsnek a fenotípusa?

  3. Az előző két kérdésre alapozva töltse ki a következő táblázatot! Tegyen + jelet, ha a törzs képes fenilalanint szintetizálni (vad fenotípus) és -  jelet, ha a törzs nem képes szintetizálni a fenilalanint (mutáns fenotípus)!

    m1

    m2

    m3

    m4

    m5

    m1

    m2

    m3

    m4

    m5

  4. Végül tételezzük fel, hogy létezik egy m6-os jelű mutáció, amely a pheA génben található, de domináns, vagyis a heterozigóták sem tudnak fenilalanint szintetizálni. Az előzőekben megadott módon töltse ki a következő táblázatot!

    m1

    m2

    m3

    m4

    m5

    m6

    m6

2, T4 fág rII régiójában mutáns fágok komplementációját vizsgálták meg. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza. Mely mutációk tartalmaztak azonos cisztronba? (+ = a két mutáció komplementálta egymást, - = a két mutáció nem komplementált)

a

b

c

d

e

f

a

-

+

-

+

-

-

b

-

+

-

+

+

c

-

+

-

-

d

-

+

+

e

-

-

f

-