Lac operon

Az Escherichia coli többféle szénforrást képes hasznosítani. A ritkábban előforduló diszaharidok lebontását végző enzimeket azonban a sejt nem szintetizálja olyankor, amikor az adott cukorféleség nincs jelen a tápközegben, vagy könnyebben hasznosítható szénforrás is rendelkezésre áll. A standard körülmények között növekvő baktériumok számára a glükóz jelenti az elsődleges szénforrást, hiányában azonban a sejt képes laktózt is feldolgozni, azt galaktózzá és glükózzá bontva (5.7A. ábra). A folyamat hatékonyságát nagyban befolyásolja, hogy a baktérium termeli-e a laktóz transzportjához és bontásához szükséges specifikus fehérjéket. Utóbbiak szintézise közös (laktóz függő) szabályozás alatt van, vagyis egy operont képeznek.

Laktóz anyagcsere, IPTG, X-Gal

5.7. ábra: A laktóz anyagcsere és a lac operon viszgálatára használt szintetikus molekulák. (A) Glükóz hiányában a sejt laktózt kezd hasznosítani szénforrásként, amelyet első lépésben a β-galaktozidáz enzimje révén galaktózzá és glükózzá hasít. (B) A Lac-represszor gátlására használt szintetikus molekula, az izopropil-β-d-tiogalaktozid (IPTG). (C) A lac-operon működésének detektálására használt laktóz analóg X-Gal, melynek bomlása kék csapadékot hoz létre.

A laktóz felhasználásáért felelős úgynevezett lac operon genetikai azonosítása és elemzése François Jacob és Jacques Monod nevéhez fűződik. Ők voltak akik különböző mutánsok (pl. laktóz bontásra képtelen, illetve laktózt még glükóz jelenlétében is bontó törzsek) segítségével meghatározták, hogy az operon három fehérjét kódol: egy, a laktóz bontásáért felelős β-galaktozidázt (Z), egy laktóz transzportért felelős permeázt (Y) és egy transzacetilázt (A), amely egy acetil-CoA molekuláról képes az acetil csoportot a laktózra átvinni (5.8A. ábra). Az ezen fehérjéket kódoló gének meghibásodásai esetén az E. coli képtelennek bizonyult a laktóz feldolgozására.

A lac operon

5.8. ábra A lac operon felépítése és vázlatos működési elve. (A) Az operon három, a laktóz feldolgozásához nélkülözhetetlen kulcsenzimet kódol, ezek a β-galaktozidáz (Z), a permeáz (Y) és a transzacetiláz (A). Az operon megfelelő szabályozásához nélkülözhetetlen még a represszor, amelyet a lacI lókusz kódol, az ennek a megkütésére képes operátor régió (O), az operon promótere (P), amely tartalmazza az RNS polimeráz kódoló helyét, valamit az  aktivátor CAP fehérje kötőhelyét. (B) Alacsony glükóz és magas laktóz szint esetén a represszorhoz kötődő laktóz inaktiválja azt, mígy a glükóz hiányában termelődő cAMP a CAP-hoz kapcsolódva azt aktív konfromációba kapcsolja. Így megtörténik az operon indukciója, létrejönnek a fehérjék. (C,D) Alacsony laktóz szint esetén, függetlenül a CAP fehérje állapotától, a Lac represszor aktív lesz, kötődik az operátor régióhoz és fizikailag meggátolja a polimeráz kapcsolódását. (E) Magas laktóz és magas glükóz szint esetében, mind a represszor, mind a CAP fehérje inaktív marad, így a polimeráz, bár kötődik, csak alacsony szintű expresszióra lesz képes.

További kísérletek olyan mutációkat is azonosítottak, amelyekben a lac operon enzimjei folyamatosan termelődtek (konstitutív mutáció). Ezek a szabályozó mutációk tették lehetővé a lac represszort kódoló gén, a lacI meghatározását is (5.8A ábra).

A represszor laktóz (vagy egyéb laktózanalógok) (induktorok) hiányában az operon operátor régiójához kötődik, meggátolja az RNS-polimeráz kötődését a promoterhez, így a struktúrgének átírása nem történik meg (represszált állapot) (5.8B,D ábra). Laktóz vagy más induktor anyagok (pl. IPTG: izopropil-β-d-tiogalaktozid) a represszorhoz kapcsolódva, meggátolják annak kapcsolódását az operátorhoz, ezáltal lehetővé válik az RNS-polimeráz promoterhez való kötődése. Az mRNS-szintézis, majd az enzimszintézis is azonnal megindul (indukció), ha a tápközeg nem tartalmaz glükózt (5.8C ábra).

Ha a tápközeg glükózt tartlamaz az a katabolit-represszió jelensége révén gátolja a lac operon átíródását. Glükóz hiányában a sejtben megindul a  cAMP szintézis és az így létrejövő molekulás a katabolit aktivátor fehérjéhez (Catabolite Activator Protein – CAP) kapcsolódhatnak. A cAMP-CAP komplex transzkripciós aktivátorként működik, ami elősegíti az RNS-polimeráz promóterhez való kötődését, és a mRNS-szintézis megindulását. Aktív CAP hiányában még laktóz jelenlétében is csak gyengén lesz képes átíródni az operon – a baktérium így szabályozza, hogy a preferált szénforrás (glükóz) jelenléte esetében ne termelődjenek fölöslegesen azok az enzimek, amelyek az alternatív szénforrás (laktóz) feldolgozásához szükségesek.

Jacob és Monod a lac operon részletes mutációs analízise során még néhány említést érdemlő allélt izolált: az egyik az IS, a represszor egy konstitutív aktív mutációja, amelynek eredményeként a LacI folyamatosan, laktóz jelenlétében is aktív formában van jelen. Ennek az oka feltehetőleg a laktóz kötő régió megváltozása, amelynek következményeként a represszor nem képes megkötni az indukátor molekulát (5.9C ábra), így annak jelenléte nem tudja kiváltani az inaktivációhoz szükséges konformáció változást. Szintén fontos az Id allél, amely domináns negatívként viselkedik, vagyis ha jelen is van egy vad típusú I allél a rendszerben (lásd parciális diploidok, alább), az arról termelődő LacI molekulákat is működésképtelenné teszi az LacId jelenléte. (Ennek oka a feltételezések szerint abban kereshető, hogy a LacI tetramer formájában fejti ki hatását (9A és B ábrák), és egyetlen LacId jelenléte a tetramer többi tagjában inaktiválást okozó konformáció változásokat indukál (5.9D ábra).)

A LacI szerkezete, mutációi

5.9. ábra A lac represszor (LacI) szerkezete, működése és jellegzetes LacI mutánsok. (A) A fehérje háromdimenziós szerkezetén jól megfigyelhető a tetramer jelleg. (B) Vad típusú fehérjékben a tetramer laktóz (vagy laktóz analóg) hiányában aktív, DNS kötő konfromációt vesz fel. Ha laktózt, vagy IPTG-t juttatunk a rendszerbe, az bekötődése révén a tetramer alegységeit inkatív konformációba kényszeríti. (C) Az IS allél által kódolt konstitutívan aktív represszor forma indukátor jelenlétében sem lesz működésképtelen, feltehetően azért, mert az indukátor nem tud a mutáns fehérjéhez kötődni. (D) A domináns negatív LacId monomer jelenlétében a vad típusú monomerek is inaktív konfromációt vesznek fel, az induktor jelenlététől függetlenül.  (Az EMBL-EBI képe alapján.)

A gyakorlaton négy eltérő E. coli törzs fenotípusát vizsgáljuk meg különböző indikátor, differenciáló táptalajokra szélesztve. A felhasznált törzsek egy deléciót hordoznak a kromoszómájukon, a lac régióban, de egy olyan konjugációs F’ plazmidot tartalmaz, amelyen megtalálhatóak a lac gének. A vad típusú kontroll törzs mellett használt kísérleti törzsek más-más lac mutációval rendelkeznek. A törzseket X-Gal, X-Gal/IPTG, MacConkey, Tetrazolium és Tergitol-7 táptalajokra fogjuk széleszteni, amelyek közös jellemzője, hogy az operon működése esetében valamilyen színreakcióval jelzik az aktív β-galaktozidáz gén jelenlétét.

Indikátor táptalajok:

MacConkey: A MacConkey agar  olyan táptalaj, amelyben epesavak gátolják a nem  enterobaktériumok szaporodását (szelektív) és az intenzíven laktózt fermentáló törzs - savasítva a környezetét - piros színű lesz, a jelen lévõ fenolvörös pH indikátor miatt. A teszt más cukrok esetében is felhasználható.

Indikátor táptalajok

5.10. ábra A gyakorlaton használt lemez-típusok. Részletes magyarázat a szövegben. A bal oldalon mindig egy vad típusú törzs látható, jobbra pedig egy β-galaktozidáz deficiens.

Tetrazolium: A tetrazolium lemez olyan gazdag táptalaj, amely trifenil-tetrazolim-kloridot és  a megfelelő cukrot is tartalmazza. A tetrazoliumot oldhatatlan formazánná (oldhatatlan, piros pigmentté) redukálják a baktériumok. Az extra cukrot (pl. laktóz) intenzíven fermentálni és ezáltal savasítani képes kolóniáknál azonban a formazán csapadék-képződés, így a színképződés is elmarad.

Tergitol 7: Összetételében hasonlít a tetrazolium lemezhez, de brómtimolkéket is tartalmaz. A cukrot fermentáló E. coli telepek sárgák, középen narancssárga maggal. A nem fermentáló telepek pirosak, a táptalaj körülöttük kékké válik.

X-Gal: Az X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) indikátor festék a beta-galaktozidáz aktivitást jelzi. Nagyon érzékeny, a laktóz  hasznosításra még nem képes (nincs növekedés laktóz minimál táptalajon) törzsek is halványkék telepeket formálhatnak. Általában az IPTG-vel kombinálva használjuk – utóbbi előnye, hogy bár potens induktor, a β-galaktozidáz nem mondja, így koncentrációja a táptalajban kvázi konstansnak vehető.

Törzsek

Minden törzs kromoszómáján deléció található a lac régióban, az F’ után az F episzómán található géneket tüntettük fel.

genotípus

Fontos tulajdonság

CSH100

 ara Δ (gpt-lac)5  F’lacproA+B+

(IQPL8 mutációt tartalmaz a lac régióban)

I+P-Z+

CSH101

ara Δ (gpt-lac)5  F’lacproA+B+

(mutációk I-, Z-)

I-P+Z-

CSH140

ara Δ (gpt-lac)5  F’lacproA+B+

(mutáció I-)

I-P+Z+

CSH141

ara Δ (gpt-lac)5  F’lacproA+B+

I+P+Z+

A kísérleti rendszerünk választ fog adni arra, hogy melyik törzs(ek) képes(ek) az aktív laktózfermentációra. (Az X-Gal/IPTG rendszer esetében az eredményeket az alábbi ábra foglalja össze.)

A gyakorlat menete

A gyakorlat során vizsgált törzseket „mester”-lemezeken bocsátjuk a csoport rendelkezésére. Ezekről kell átoltani őket az indikátor táptalajokat tartlamzó Petri csészékbe. Az átoltáshoz a Petri csészék felületét négy részre osztjuk, majd a törzseket steril fogpiszkálókkal önálló telepekké szélesztjük a táptalaj egy-egy negyedében. A lemezeket 37°C-on inkubáljuk egy éjszakán át, majd 4°C-on tároljuk.

lac mutánsok X-Gal/IPTG lemezen

5.11. ábra A lac mutáns törzsek fenotípusa X-Gal/IPTG tartalmú közegben. (A) A vad típusúnak tekinthető I+P+Z+ (CSH141) törzs IPTG jelenlétében (balra) β-galaktozidázt szintetizál, ami az X-Gal színreakciót okozó lebomlását katalizálja, ezért a telepek kék színűek. IPTG hiányában (jobbra) a represszor meggátolja a β-galaktozidáz átírását, így a színreakció elmarad, a telepek fehérek lesznek. (B) A represszor mutációja esetében (I+P+Z+ - CSH140), az enzim az indukátor jelenlététől függetlenül termelődk, így mindig kék telepeket kapunk. (C) A β-galaktozidáz mutációja episztatikus a szupresszor mutációjára (I-P+Z-), az X-Gal bomlásának hiányában mindig fehér telepeket kapunk. (D) A promóter mutációja esetében (I+P-Z+) a polimeráz elvileg nem tud kötni az enzim promóteréhez még a represszor szupresszált állapotában sem, így azt várjuk hogy az IPTG jelenlététől függetlenül fehér telepeket kapjunk. A valóságban a promótermutáció nem egy tökéletes null-allélt hoz létre, a polimeráz alacsony affinitással, de tud kötni, így minimális mennyiségű enzim létrejön. Ennek megfelelően a telepek indukátor hiányában halványkékek.

Feladatmegolás

Bár a bakteriális sejtek eredendően haploid organizmusok, az F episzóma segítségével stabil parciális diploid egyedek hozhatók létre: olyan sejtek, amelyekben a kromoszómán található lac operon mellett egy második operon található az F’ plazmidon. Ebben a rendszerben lehetőség nyílik arra, hogy különböző lac mutánsok komplementációs analízisét elvégezzük (nagyon hasonló logika alapján, mint amit az előző, fágokról szóló alfejezetben láttunk).

A parciális diploidokban könnyen kimutatható, hogy a diffúzióra képes lac represszortransz helyzetben hat, vagyis péládul a kormoszómán termelődő LacI az episzómán levő operon működését is képes gátolni (12A és B ábrák).

A korábbiakban nem esett szó az egyik jellegzetes szabályozó mutációról, az úgynevezett konstitutív operátor (Oc) allélról. Ennek érdekessége, hogy nem közvetlenül a represszorban található, annak működését mégis alapvetően befolyásolja. Az Oc allélt hordozó mutánsok IPTG hiányában is jelentős mennyiségű enzimet termelnek, mert a represszor nem tud hozzákötni az operátorhoz (vagyis nem képes sztérikus gátlás révén az RNS polimeráz kötődését sem akadályozni). Ezt a típusú mutációt, amikor a genetikai változás a DNS-en a közelben található operon működését befolyásolja, cisz-dominanciának nevezzük (5.12D ábra).

lac mutációk komplementációs analízise

5.12. ábra Különböző lac mutációk komplementációs analízise X-Gal/IPTG lemezeken. (A) A lac represszor transz helyzetben hat: ha az egyik lac operon működőképes I allélt hordoz és működésképtelen Z-t, a másik pedig pont fordítva, a rendszer végső soron a vad fenotípust mutatja (komplementáció figyelhető meg): a működőképes represszor mindkét operon operátor régiójához képes kötni, vagyis mind a működő, mind a nem működő lacZ allél átíródását befolyásolja. (B) Az indukátorra (IPTG) érzéketlen, konstitutívan aktív IS allél jelenlétében a β-galakotzidáz termelése folyamatosan gátolt, így mindig fehér telepeket kapunk. (C) Ha csak az egyik operon hordozza a domináns negatív represszort kódoló Id allét, az elég ahhoz, hogy a represszort folyamatosan működésképtelen állapotban tartsa, indukátor hozzáadása nélkül is. Domináns negatív monomerek beépüléskor a tetramer, függetlenül hány vad típusú, nem-mutáns monomert tartalmaz, inaktív konformációt vesz fel. Ennek eredményeként a β-galaktozidáz termelés folyamatos, a telepek mindig kékek lesznek. (D) Az előbbihez hasonló fenotípust figyelhetünk meg a konstitutív operátor (Oc) allél jelenlétében: mivel az aktív represszorok sem tudnak ilyenkor az operátorhoz kötni, IPTG hiányában is bekövetkezik a lacZ átírása, vagyis jelen lesz az X-Gal hasításához szükséges β-galaktozidáz.

Példafeladatok

1. Határozza meg, hogy a következő táblázatban feltüntetett különböző genotípusú baktérium törzsek képesek-e β-galaktozidáz, illetve permeáz termelésére, indukálószer jelenlétében illetve hiányában!

Törzsek genotípusa

indukálószer nélkül

indukálószer jelenlétében

β-galaktozidáz

permeáz

β-galaktozidáz

permeáz

I+O+Z+Y+

I+O+Z-Y+

I+O+Z+Y-

I-O+Z+Y+

ISO+Z+Y+

I+OCZ+Y+

ISOCZ-Y+

I+OCZ+Y-

2. Határozza meg a következő parciális diploidok esetében, hogy temelnek-e β-galaktozidázt és permeázt! Képesek lennének-e ezek a törzsek laktózon, mint egyedüli energia/szén forráson növekedni?

Törzsek genotípusa

indukálószer nélkül

indukálószer jelenlétében

β-galaktozidáz

permeáz

β-galaktozidáz

permeáz

I+O+Z+Y+/ I+O+Z-Y-

I-O+Z+Y+/ I+O+Z-Y-

I+O+Z+Y+/ I-O+Z-Y-

I-O+Z+Y+/ I+O+Z-Y-

ISO+Z+Y+/ I-O+Z+Y+

I+OCZ-Y+/ I+O+Z+Y-

ISO+Z+Y+/ I+OCZ+Y+

3. Határozza meg a lac operon átírásának aktivitását (magas/alacsony/nincs), a represszor illetve a katabolikus aktivátor fehérje helyzetét az alábbi táblázatban meghatározott körülmények esetében!

laktóz

glükóz

operon aktivitás

(magas/alacsony/nincs)

represszor

(kötött/szabad)

CAP

(kötött/szabad)

nincs

nincs

van

nincs

nincs

van

van

van