6. fejezet - A mikrobiális genetika – II. rész

Dr. Horváth Péter egyetemi tanársegéd

ELTE TTK Biológiai Intézet, Genetikai Tanszék

Tartalom

A markerek
Szelektálhatóság: fontos kritérium
Néhány ismert modellrendszer
Baktérium modellek és genomjuk
Plazmidok
A plazmid vektorok
A λ fág – a fágok egyik legismertebb modellszervezete
Géntranszfer
A horizontális géntranszfer típusai baktériumokban
A gyakorlat célja
A transzformálási gyakorlat menete
Demókísérlet: elektroporálás
Demókísérlet: lítikus és lizogén fágtenyészet létrehozása
Egy különös plazmid – a pKD46
A pKD46 eliminációja szelekció megvonásával és restriktív hőmérséklettel
A CFU meghatározás
A kísérlet menete
Anyagok

A mikrobiális genetika gyűjtő fogalom, bizonyos szempontból ide tartozik minden olyan ága a genetika tudományának, ami egysejtű eukariótákkal (pl. gombák, algák), prokariótákkal és vírusokkal foglalkozik. Éppen ezért nem beszélhetünk egységes mikrobiális genetikáról, hiszen ezeknek a szervezeteknek a felépítése, működése jelentősen eltér egymástól.

A gyakorlat során a bakteriális rendszerekre, illetve a hozzájuk erősen kapcsolódó bakteriofágokra és plazmidokra koncentrálunk. A baktériumok, mint modellszervezetek számos előnnyel bírnak (gyorsan szaporodnak, egyszerűen manipulálhatóak, de a segítségükkel levont következtetések sok esetben a magasabb rendű élőlényekre is igazak), ezért viszonylag régóta használják őket genetikai vizsgálatok céljára.

A baktériumok tehát genetikai szempontból az alábbi tulajdonságokkal bírnak:

A markerek

A marker egy olyan genetikai elem, aminek jelenléte vagy hiánya valamilyen látható fenotípust okoz, így lehetővé teszi, hogy a markert hordozó szervezetet megkülönböztessük a nem hordozótól. A fent felsorolt okokból a mikrobiális rendszerek különösen alkalmasak arra, hogy markerekkel jelölhetőek legyenek, és nagyon sokféle marker áll rendelkezésünkre baktériumok esetében.

A marker bármilyen genetikai elem lehet, ami által megkülönböztethetővé válik két szervezet. Például ha egy génnek két allélje van, melyek közül az egyik kék festék termelését idézi elő, a másik nem, és a két allél közt csupán egy pontmutáció a különbség, akkor valójában ez a pontmutáció is tekinthető markernek, hiszen látjuk a jelenlétét/hiányát. Ilyen mutáció nem csak fehérjekódoló régiót érinthet. A jegyzet során markergénekről fog szó esni, azaz olyan markerekről, melyeknél egy egész gén jelenléte vagy hiánya okozza a különbséget.

A markereket tehát alapvetően arra használjuk, hogy megkülönböztessünk élőlényeket egymástól. Például előfordulhat, hogy két az E. coli baktérium két törzse közt összesen annyi különbség van, hogy az egyikből hiányzik a lacZ gén. Ha valahogy ezt a különbséget láthatóvá tudjuk tenni, akkor a lacZ egy markergén, melynek segítségével el tudjuk különíteni a két törzset. Ha nem tudjuk láthatóvá tenni, akkor nem tekintjük markernek. (Az, hogy valami markergén-e, egy kicsit mesterséges megközelítés. Ha egy nem-marker génről felfedezik, hogy valamilyen színreakcióért felelős egy bizonyos anyag jelenlétében, akkor attól fogva azt a gént markergénnek fogják tekinteni. Ugyanarról a génről beszélünk, az egyetlen ami változott, az a tudásunk az adott génről, vagyis hogy képesek vagyunk-e láthatóvá tenni.)

Szelektálhatóság: fontos kritérium

A markereknek alapvetően két nagy csoportja van: a szelektálható és a nem szelektálható marker. Szelektálható markerről akkor beszélünk, ha a marker hiánya egy adott környezetben lehetetlenné teszi az adott élőlény, esetünkben baktérium növekedését, és ezáltal csak azok a sejtek élnek túl, amelyek rendelkeznek az adott markergénnel. Ilyen szelektáló környezet lehet például egy antibiotikum jelenléte vagy egy adott aminosav hiánya a táptalajban, ezekben az esetekben a szelektív marker gén az adott antibiotikum rezisztenciagénje, vagy az adott, hiányzó aminosav termelését lehetővé tevő gén. Természetesen a szelektálható marker csak a megfelelő környezetben számít előnynek, egyébként a fölösleges többlet DNS inkább hátrányt jelent, így a baktérium könnyen elvesztheti azt, ha nem szelektív (azaz például antibiotikum-mentes) tápközegbe helyezzük. A gyakorlaton használt szelektálható markerek az ampicillin, a zeocin és a kanamicin nevű antibiotikumok rezisztencia génjei.

Nem szelektálható markerről akkor beszélünk, ha valamilyen látható különbség van a markert tartalmazó és nem tartalmazó baktériumok között, de ez nincs hatással a baktérium növekedésére. Ez általában valamilyen színreakciót jelent. A mindennapi genetikai munka során leggyakrabban használatos és a legismertebb nem szelektálható marker a lacZ gén, ami a természetben a laktóz felhasználásáért felelős enzim. A laktóz egyik analógja, amit az enzim képes bontani, az X Gal, azaz teljes nevén 5-bromo-4-kloro-3-indolil--D-galaktopiranozid, mely az enzim hiányában színtelen, jelenlétében azonban egy kék bomlásterméket eredményez. Azaz lényegében a laktóz bontásának képességét követjük nyomon egy másik, látható reakció által. A gyakorlaton használni fogunk X-Gal-t, és X-Gluc-ot (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D- glükuronsav), ami hasonlóan működik, de egy másik enzim, a GUS jelenléte esetén keletkezik kék termék. Szintén nem szelektálható marker a GFP (green fluorescent protein), ami UV fénnyel megvilágítva zölden fluoreszkáló telepeket eredményez.

Az egyes szénhidrátok bontásának képessége más módon is mérhető. A MacConkey agar – amit szintén használni fogunk – egy olyan indikátort (neutrálvörös) tartalmaz, ami savas környezetben vörösebb lesz. A táptalajba kevert szénhidrátot (például laktózt) csak azok a baktériumok tudják hasznosítani, amelyek ezt a képességet a plazmiddal felvették, így ezen baktériumok a szénhidrát bontás során termelt savak miatt kivörösödnek, míg a többi baktérium udvara kifehéredik, illetve maga a telep is világosabb lesz.

Lehetséges-e, hogy egy marker szelektálható és nem szelektálható is legyen? Természetesen elképzelhető, a környezettől függ. Például ha egy táptalaj nem csak laktózt tartalmaz tápanyagként, akkor a laktóz felhasználásának képessége csak egy lehetőség, de a többi baktérium is képes megélni a lemezen – így működik a MacConkey agar. Ha azonban kizárólag laktózt tartalmaz a táptalaj, akkor ez a képesség máris szelektálhatóvá lép elő.

Markerek több módon juthatnak a baktériumba. Előfordulhat, hogy spontán mutációval kialakul az adott marker, például számos antibiotikum-rezisztenciamarkert írtak le, ami így alakult ki. Ezen kívül a baktériumok nagymértékben képesek a sejten kívülről, úgynevezett horizontális géntranszferrel génekhez jutni, mely folyamatokról később lesz szó. A horizontális géntranszfer során a gének (köztük markergének) képesek a környezetből vagy más külső forrásból a baktériumsejtbe jutni. Arról, hogy egy baktérium rendelkezik-e eleve egy markerrel, az adott baktériummal való munka előtt meg kell győződni.