A gyakorlat célja

A gyakorlaton minden hallgató egy plazmid keveréket transzformál hősokk eljárással E. coli DH5α sejtekbe. A keverékben az alábbi plazmidok vannak:

Plazmid neve

szelektálható marker

nem szelektálható marker

pLG338

Kanamicin rezisztencia (KmR)

-

pLGlacZ

Kanamicin rezisztencia (KmR)

lacZ

pEM7/zeo

Ampicillin  és Zeocin  rezisztencia (AmpR, ZeoR)

-

pEM7gus

Ampicillin  és Zeocin  rezisztencia (AmpR, ZeoR)

gus

pEGFP

Ampicillin rezisztencia (AmpR)

gfp

A transzformánsokat mindenki az alábbi lemezek egyikére keni ki (a lemezek összetétele a fejezet végén megtalálható):

Ezeken a lemezeken a következő gyakorlati alkalommal szelektálható és nem szelektálható markereket kell felismerni.

Demókísérletként egy elektroporálást is bemutatunk, amit a gyakorlat vezetője ugyanezzel a plazmid keverékkel végez. Szintén demókísérletként létrehozunk egy lítikus és egy lizogén fágtenyészetet.

A transzformálási gyakorlat menete

  1. A gyakorlatvezető a csoport létszámának megfelelő kompetens sejtet oszt ki. Fontos, hogy a sejtek közvetlenül a gyakorlat kezdete előtt kerüljenek ki a -70 °C-os hűtőből. A sejtek 10 percig állnak jégen, ezután lehet elkezdeni a DNS-t hozzáadni. Ezalatt az idő alatt szükség esetén meg lehet ismerkedni a használt eszközökkel, valamint mindenki megjelöli a saját csövét, úgy, hogy közben ne vegye ki a jégről.Minden asztalon két pipetta van, egy „nagy” és egy „kicsi”. A „nagy” 40 és 200 μl közti mennyiséget tud kimérni (ez rá is van írva), és a gyakorlaton csak 200 μl kimérésére fogjuk használni, amit a gyakorlatvezető már beállított (ha valaki szerint a pipettája nem jól van beállítva, akkor szóljon, de kérjük, ne állítsa el). Erre a pipettára a sárga színű pipettahegy való. A „kicsi” pipetta lehet 1-10 μl-es, amire a kicsi fehér hegy való, vagy 2-20 μl-es, amire a „nagy” pipettával megegyező sárga hegy való. Mind a kettőt 2 μl mennyiség kimérésére fogjuk használni, amit szintén előre beállítunk. Alább a képen látható, hogy a hegyben hogyan néz ki a 2 μl mennyiség (6.9. ábra).

    6.9. Ábra Pipetta hegybe felszívott oldat.

    A saját csövünket jégen tartva ellátjuk a monogrammunkal:

    6.10. Ábra Jégen történő inkubáció.

  2. A 10 perc leteltével a „kicsi” pipetta segítségével mindenki hozzáad 2 μl-t a DNS keverékből. Ha a DNS a pipettahegyben többnek látszik, mint ami a fenti képen a 2 μl, akkor tegyük vissza a csőbe és ellenőrizzük, hogy a jó pipettát vettük-e fel. Fontos:

    1. gyorsan dolgozzunk,

    2. ne az alján fogjuk meg az Eppendorf csövet, mert ezzel idő előtt felmelegítenénk a sejteket, ami a kompetencia elvesztéséhez vezet.

    3. a sejteket egészen az utolsó pillanatig jégen kell tartani (vagyis akkor kivenni, amikor a DNS-t már felvettük a pipettával), és a DNS hozzáadása és egy gyors keverés után azonnal vissza is kell rakni jégre (6.10. ábra). Az elhasznált hegyeket az asztalon levő gyűjtőkbe helyezzük el.

      6.11. Ábra Az Eppendorf cső megfelelő és hibás tartása.

  3. Amikor mindenki végzett, 30 percig jégen állnak a sejtek. (Nem probléma, hogy egyes csövek hosszabban állnak jégen, az utolsó DNS beméréstől kell kezdeni a fél óra mérését.) Ez alatt az idő alatt a DNS molekulák a sejtek felszínéhez tapadnak.

  4. 2 percre 42 °C-os termosztátba helyezzük a sejteket. A torlódás elkerülése érdekében 5 másodperces eltolással következnek egymás után a hallgatók. FONTOS: Addig nem szabad kivenni a sejteket a jégről, amíg nem fértünk oda a készülékhez (6.11. ábra).

  5. A 2 perc leteltével a csöveket ismét jégre kell helyezni. (Ugyanúgy 5 másodperces eltolással lehet kivenni a sejteket, abban a sorrendben, ahogy a termosztátba kerültek.) Amikor az utolsót kivették, 4 percig állnak a sejtek jégen. Ez idő alatt meg lehet gyújtani a Bunsen-égők őrlángját.

  6. A 4 perc leteltével az előkészített kémcsőből 200 μl LB tápoldatot adunk a sejtekhez. A művelet előtt és után a kémcső száját leégetjük. A tiszta munka érdekében a tápoldatot úgy vesszük ki a kémcsőből, hogy a kémcsövet addig döntjük, míg a folyadék elér a pipettahegyig, és nem a pipettát dugjuk le a kémcső aljára.

    6.12. Ábra A kémcső helyes és hibás tartása.

  7. A mintákat 40 percre az előkészített 37 °C –os termosztátba helyezzük.

  8. Minden hallgató kap egy lemezt a csoport számára előkészített lemezek közül, erre kell széleszteni. A lemezekre ráírjuk a nevünket, és a csoport számát. (Tanács: célszerű a lemeznek arra a felére írni, amiben a táptalaj van, mert egy esetleges felborulás vagy egyéb baleset során a lemezek fedele – a rajtuk levő felirattal együtt – összekeveredhet.) A lemezeket később is a táptalajjal felfelé tároljuk, hogy a képződő pára ne a baktériumokra csapódjon le, hanem a Petri-csésze fedelébe (6.12. ábra).

    6.12. Ábra A Petri csésze feliratozása.

    A szélesztés úgy történik, hogy az alkoholban álló szélesztő pálcáról leégetjük az alkoholt, ezzel sterilizáljuk, majd a lemez felszínére letesszük, hogy lehűljön. Ezután a transzformált baktériumból 200 μl-t a lemezre csöppentünk, és a pálca segítségével körkörös mozdulatokkal elkenjük.

  9. A lemezeket 37 °C-on növesztjük másnapig, és a következő gyakorlatig hűtőben tartjuk.

  10. A következő héten elemezzük a lemezen látottakat.

    6.13. Ábra A MacConkey + Kanamicin + Laktóz agaron a kanamicin tartalom miatt a pLG338 és a pLGLacZ nevű vektorokat tartalmazó baktériumok. A lemezen jól elkülönülnek a laktóz hasznosítására képes (pLGLacZ tartalmú) baktérium telepek, melyek vörösebbek a többi baktériumnál.

    6.14. Ábra Az LB + Kanamicin + XGal lemezen az előzőhöz hasonlóan a pLG338 és a pLGLacZ vektorokkal transzformált baktériumok. Itt a laktóz hasznosítására képes (pLGLacZ tartalmú) baktérium telepek azok, melyek az X-Gal bontása során kék festéket termelnek. Ez a lemez ugyanazt a különbségtételt Ez a lemez ugyanazt a különbségtételt teszi lehetővé, mint a fenti MacConkey lemez, de az elve teljesen más.

    6.15. Ábra Az LB + Ampicillin + Zeocin + X Gluc agaron a zeocin és ampicillin rezisztenciát adó pEM7/Zeo és pEM7gus vektorok hordozói élnek túl. Itt a kék telepek a pEM7gus vektort jelzik.

    6.16. Ábra Az LB + Ampicillin táplemezen a pEM7/Zeo és pEM7gus valamint a pEGFP vektort tartalmazó baktériumok nőnek. UV fénnyel történő megvilágítással jól látszik, hogy melyek tartalmazzák a pEGFP vektorról termelődő GFP fehérjét. A másik két vektor egymástól ezen a lemezen nem elkülöníthető.

Demókísérlet: elektroporálás

Az elektroporálás (latinos formában írva: elektroporáció) olyan transzformációs eljárás, melynek során a DNS-t egy nagyfeszültségű elektromos impulzus segítségével juttatjuk a sejtbe. A sejteket itt is elő kell készíteni, de ellentétben a kémiai kompetens sejt Ca2+ és Mg2+ ionos kezelésével, az elektroporáláshoz teljesen ionmentes közegre van szükség, hogy az oldat ne vezesse az elektromosságot. A hozzáadott DNS is ionmentes közegben kell, hogy legyen (6.17. ábra).

A transzformáláshoz szükség van még egy elektroporátor készülékre, és egy elektroporációs küvettára. A készülék a megfelelő mértékű elektromos töltés előállításáért felel, a küvetta falai pedig, mivel fémből vannak, voltaképpen a két elektródaként szolgálnak.

6.17. Ábra Az elektroporátor készülék képe, valamint a kísérlet elvi felépítése.

A kísérlet menete:

  1. Jégben lehűtjük az elektroporációs küvettát és beállítjuk a készüléket. Az általunk használt készülék gyári beállításokat tartalmaz különböző baktériumokhoz és különböző küvettákhoz. Az E. coli transzformálása 1 milliméteres résvastagságú küvettában az EC1 nevű programmal történik.

  2. A baktériumokhoz hozzáadjuk a 2 μl DNS oldatot, megkeverjük és gyorsan jégre helyezzük.

  3. 5 perc várakozás után a sejteket átpipettázzuk a küvettába. Ügyelni kell arra, hogy a csepp a küvetta alján legyen, mindkét falához hozzáérjen és buborék mentes legyen.

  4. A küvettát behelyezzük a készülékbe, ügyelve, hogy a fém lemezek a készülék elektródjaival érintkezzenek, majd megnyomjuk a „PULSE” gombot.

  5. A készülék rövid elektromos impulzusa után a sejtekhez azonnal 1 ml LB tápoldatot adunk, majd egy eppendorf-csőben kb 40-50 percig 37°C-on állni hagyjuk őket.

  6. 200 μl-nyit kiszélesztünk belőle, és másnapig 37°C-os inkubátorban növesztjük a sejteket.

Demókísérlet: lítikus és lizogén fágtenyészet létrehozása

A kísérlet célja a lizogén és lítikus fág által képzett tarfoltok különbségének bemutatása, azaz a „tiszta” és „zavaros” tarfoltok létrehozása. A kísérlet során nem a korábban bemutatott E. coli - λ fág rendszert használjuk, hanem a Rhizobium meliloti baktériumot és annak fágját, a 16-3 fágot. A 16-3 fágnak ismert egy olyan mutánsa, melynek C represszora hőérzékeny, 37 °C fölött nem működik, azaz 37°C fölött a fág képtelen a lizogén utat fenntartani. 37 °C alatt annak megfelelően választ a két út közül, ahogy a vad típus is tenné: amíg kevés fág jut egy baktériumra, addig a lítikus út zajlik le, ha túl nagy a fágok száma a baktériumokhoz képest, akkor a lizogén utat választja. A kísérlet során nagy fágtartalmú oldatot cseppentünk két táplemezen baktérium mezőre, majd az egyik lemezt 30 °C-on, a másikat 37 °C-on inkubáljuk. Az utóbbi lemezen a lítikus út által létrehozott tiszta tarfoltot tapasztaljuk, azaz mivel minden baktérium elpusztul, át lehet látni a lemezen. Az alacsony hőmérsékleten növesztett lemezen is látszik a fág nyoma, mivel a fágok a baktériumok egy részét elpusztítják, azonban itt növekedést tapasztalunk a fertőzött helyeken is.

A kísérlet menete:

  1. Megolvasztott YTA fedő táptalajt („top agart”) 50 °C-ra termosztálunk. A top agar alacsonyabb agar tartalmának köszönhetően alacsonyabb hőmérsékleten is folyékony.

  2. Sűrű Rhizobium kultúrából 30 μl-t 3 ml top agarba pipettázunk, egy gyors mozdulattal összerázzuk, és egy YTA táplemezre öntjük. Körkörös („palacsintasütés-szerű”) mozdulattal egyenletes réteget képzünk. A lemezt résnyire nyitva láng mellé tesszük.

  3. Miután megszilárdult a top agar, 106 vagy magasabb titerű fágot cseppentünk rá, melyet tetszés szerint elkenhetünk nagyobb felszínen. Mindezt kétszer végrehajtjuk.

  4. A létrehozott lemezek egyikét 30°C-on, a másikat 37°C-on inkubáljuk másnapig. A kapott eredményeket értékeljük.

6.18. Ábra A bal oldali lemezen a tiszta tarfolt látható. Áteső fényben (fent) látszik, hogy sokkal világosabb, mint a jobb oldali zavaros tarfolt. Felülről megvilágítva látszik, hogy a környékhez képest egy réteggel alacsonyabb a folt, itt a fágok minden sejtet elpusztítottak. A zavaros tarfolt nem jól látszik ilyen szögből.

Kísérlet a gyakorlat második napján: plazmid elvesztése szelekció megszűntekor

A kísérlet célja, hogy demonstráljuk, hogy a szelekciós nyomás megszűnésével a plazmid is megszűnik előnyös lenni, ezért fokozatosan eltűnik a baktériumpopulációból. Ehhez tudni kell, hogy a baktériumok egymás közt versengenek, hiszen amelyik gyorsabban osztódik, annak az utódai értelemszerűen többségben lesznek a populációban. (És mi a versengés lényege, ha nem ez?) Az osztódás egyik limitáló tényezője a genom lemásolása lehet, így a baktériumok esetében gyakori a genom minimalizálása, akár kromoszómális régiók deléciója, akár a szükségtelen plazmidok elvesztése révén.

A plazmid kétféle módon „tűnhet el” a populációból. Az egyik, hogy a szükségtelen plazmidot  a baktérium mint tápanyagforrást hasznosítja, azaz lebontja, felhasználja, ennek során a plazmid DNS megszűnik létezni. A másik elméleti út a plazmid hígulása. Tegyük fel, hogy az osztódás előtt a plazmidot a sejt nem másolja le, de a már meglevő példányokat sem pusztítja el. Ekkor azok az osztódás során a két leánysejtbe kerülnek, körülbelül fele-fele arányban. Tehát egy nagy kópiaszámú plazmid esetén (például sejtenként 400 kópia), az osztódás után csak 200-200 kópiát fog tartalmazni a két utódsejt. Ekkor elméletileg a kilencedik osztódásra a sejtenkénti átlagos kópiaszám 1 alá esik, tehát biztosan megjelennek azok a baktériumok, melyek nem tartalmaznak egy kópiát sem, de valójában – mivel az eloszlás nem egyenletes –, már akkor is megjelenhetnek az „üres” sejtek, amikor az átlag még 1 fölött van. A plazmidok ebben az esetben nem bomlanak el, és csak az egyedi baktériumsejt elpusztulásakor kerülnek ki a populációból, azaz addig valójában csak az eredeti plazmidmennyiség van szétosztva a sejtek közt.

A valós kép azonban nem ez, mivel a plazmid replikációját a baktériumban semmi sem gátolja, tehát mindig vannak olyan sejtek (sőt, valószínűleg ezek vannak többségben), amik a plazmidot kisebb-nagyobb mértékben replikálják, bár ezzel szaporodási hátrányba kerülnek a replikációt valahogyan leállító vagy erősen lecsökkentő sejtekhez képest. Összességében tehát a plazmid fogyatkozása ellen és mellett egyaránt hatnak tényezők, melyek közösen határozzák meg a plazmid eloszlását illetve a plazmidmennyiség csökkenésének ütemét a populációban.

Ilyen módon a szelekciós nyomás alól kikerült plazmidok ugyan folyamatosan hígulva, de igen sokáig jelen lehetnek a populációban, és egy ismételt szelekció hatására a hordozó egyedek megint előnybe kerülnek, elszaporodhatnak a többi sejt rovására. Hasonló helyzetet fogunk modellezni a kísérletünkben.