Egy különös plazmid – a pKD46

A plazmidok replikációjához olykor szükség van olyan fehérjére is, amit maga a plazmid kódol, azaz a plazmid felelős a saját replikációjáért. A pKD46 egy olyan plazmid, aminek a replikáza (repA 101) egy hőérzékeny mutáns, ami 30 °C-on jól működik, ám 37 °C-on működésképtelen. (Ilyesfajta plazmidokra olyan kutatásokhoz lehet szükség, amikor csak átmenetileg van szükség arra, hogy a plazmid jelen legyen a baktériumokban, és ha elvégezte a feladatát, akkor szeretnénk eltűntetni. Mint látni fogjuk, pusztán a szelekció elvonásával ez nem túl hatékony folyamat.) A fentiek alapján tehát a pKD46 alkalmas arra, hogy a hőmérséklet emelésével teljesen meggátoljuk a replikációját, ezáltal csak a hígulás és a plazmid eltűnése felé irányuló folyamatok lesznek jelen a populációban. A pKD46 egyébként egy alacsony kópiaszámú plazmid, ami szintén könnyíti az eliminációját (kevesebb példánytól kell megszabadulni).

6.19. Ábra A pKD46 sematikus ábrája.

A pKD46 eliminációja szelekció megvonásával és restriktív hőmérséklettel

A kísérlethez három baktériumkultúrát használunk. Az egyik pKD46 plazmidot tartalmaz (6.19. ábra), és a plazmid szelekciós markerének megfelelően ampicillin tartalmú folyékony tápoldatban volt növesztve, 30 °C-on. A második ugyanezt a plazmidot tartalmazza, de egy nagy mértékű (100000-szeres) hígítás után 16 órán át szelekció nélkül növesztettük 30°C-on. A harmadik pedig szintén szelekciómentes oldatban nőtt, de 37 °C-on. A 100000-szeres hígítás elméletben azt jelenti, hogy egyenletes megkettőződést feltételezve (ami persze nem igaz) log2 100000 = kb. 16 osztódáson mennek keresztül a sejtek, azaz várhatóan már kimutathatóak lesznek olyan sejtek, amelyek elveszítették a plazmidot. (Felmerülhet a kérdés, hogy miért nincs ampicillines kultúra 37°C-on növesztve. Egyszerűen azért, mert a plazmid replikációja olyan erősen gátolt, hogy a baktériumok nem képesek új plazmidot létrehozni, azaz ha mindig el is felezik az addigi „készletüket”, akkor is néhány osztódás után már csak olyan sejtek lesznek, amikben egyetlen plazmid van. Ezen a ponton pedig már nem keletkezhet új sejt, azaz nem tudják teljesen benépesíteni a folyadékkultúrát.) A kísérlet során baktériumsejteket fogunk megszámolni a plazmidot tartalmazó és nem tartalmazó sejtek CFU/ml értékét fogjuk meghatározni.

A CFU meghatározás

A CFU, vagyis korrekten használva CFU/ml a baktériumszuszpenzióban található baktériumok számát (colony forming unit) jellemző érték, azaz a baktériumok „koncentrációja”. Azt mutatja meg, hogy 1 ml oldatban hány élő, kolóniaképzésre alkalmas baktériumsejt van. Ehhez a vizsgált mintából egy ismert térfogatú csöppet (pl. 10 ul-t) LB lemezre csöppentünk, és növesztés után megszámoljuk a keletkezett telepeket. Ha például 15 telepet kapunk 10 ul mintából, akkor a vizsgált minta 1 ml-ében 1500 baktérum volt, azaz 1500 CFU/ml a szuszpenzió töménysége. A gyakorlatban azonban sokkal nagyobb értékekkel dolgozunk, 108,109 CFU/ml is lehetséges, azaz egy 10 ul-es csöpp többmillió telepet adna. Ezt nem lehet megszámlálni, ezért hígítási sort kell készíteni, azaz a vizsgált mintát valahányszorosan (a legtöbbször 10-szeresen) hígítjuk, majd ezt is hígítjuk és így tovább addig, míg az utolsó csövekbe már várhatóan nem kerül egyetlen sejt sem. A hígítási sor minden tagjából kicseppentünk egy ismert térfogatot az LB lemezre, és másnap valamelyik csöpp helyén megszámolható mennyiségű telepet kapunk. A telepeket leszámoljuk, és mivel tudjuk, hogy a hígítási sor hanyadik tagja adott annyi telepet, ezért ki tudjuk számolni az eredeti CFU/ml értéket. Fentebb már láttuk, hogy az első csöpp már eleve 100-szoros hígítást jelent (15 telep = 15*100=1500 CFU/ml), tehát a tényleges CFU/ml érték így számolható:

CFU/ml = T*10(x+1)

ahol T a telepek száma, x pedig a hígítási sorban az adott folt sorszáma. Ha tehát az első folton volt 15 telep, akkor T = 15, x=1, azaz CFU/ml = 15*10(1+1) = 1500. Ha viszont 5 telepet kapunk a hatodik csepp helyén, akkor az érték 5*10(6+1) = 50 000 000.

Ez az eljárás természetesen nem teljesen pontos, valójában inkább nagyságrendi becslést ad az eredeti CFU/ml értékre, hiszen a hígításoknál számos pontatlanság történhet. Ugyanezen okból érdemes egy mintából több párhuzamos mérést végezni.

A kísérlet menete

A kísérlet során CFU/ml érték meghatározása a cél az eltérő lemezeken. Ehhez 10 tagú, 10-szeres hígítási sort készítünk mindhárom folyadékkultúrából, majd a három hígítási sort ampicillines és ampicillin mentes LB lemezre csöppentjük. Mindkét fajta lemezből kettőt készítünk (összesen tehát négyet), kettőt közülük 30°C-on, a másik kettőt 37°C-on termosztáljuk. Végül másnap a telepek megszámlálásával megállapítjuk a két kultúrában a baktériumok számát. A nem szelektáló lemezen meghatározott CFU érték a teljes baktérium-mennyiséget méri, hiszen a plazmidot tartalmazó és nem tartalmazó telepek is kinőnek rajtuk. A szelektív lemezen csak a plazmidot tartalmazó sejtek adnak telepet, vagyis az ampicillin rezisztens sejtek CFU/ml értékét mérjük. A 37°C-on ampicillines lemezen nem várunk növekedést, de előfordulhat a tömény baktériumok (tehát az első néhány csepp) esetén az, hogy baktériumkenetet kapunk, itt ugyanis még elég plazmid van az egyes sejtekben ahhoz, hogy néhány osztódás történhessen (de a plazmid nem replikálódik, csak eloszlik a sejtek közt). Ebben az esetben egyedi telepek nem lesznek.

A kísérlethez fejenként 9 db Eppendorf-csövet, LB tápfolyadékot, valamint mindenki a háromféle baktérium kultúra egyikét fogja használni (szintén Eppendorf-csőben kiosztva).

  1. Első lépésként az Eppendorf-csövekbe 180 ul folyékony LB-t mérünk szét. A csöveket 2-10-ig számozzuk, az 1-es cső maga a tömény baktériumkultúra. Nem kell jégen dolgozni.

  2. A tömény baktérium kultúrából 20 ul-t az első Eppendorf-csőbe mérünk. Elkeverjük, majd egy új pipettaheggyel a következő oldatba mérünk a már hígított oldatból és így tovább, a 10. csőig (6.20. ábra).

    6.20. Ábra Hígítási sor elkészítése.

  3. A hígítási sort hátulról (a leghígabbtól kezdve) kicsöppentjük a két lemezre úgy, hogy ne folyjanak össze. Amíg a hígabbtól a töményebb felé haladunk, nem kell pipettahegyet cserélnünk. (Ez azért van így, mert a hegyen esetlegesen maradó hígabb szennyeződés nem zavarja a töményebb oldatot, de ha töményebb szennyeződés marad a hegyen, az megzavarja a hígabbat. Például szemmel nem látható 0,1 ul töményebb oldat annyi baktériumot tartalmaz, mint 1 ul hígabb a következő lépésből, tehát 10% hibát csinál. Ha véletlenül két lépéssel fentebbről hozunk szennyeződést, az óriási hibát jelenthet.)  Egy lemezen több hígítási sor is elfér.

  4. A lemezeket láng mellett félig nyitva száradni hagyjuk, míg a cseppek oda nem száradnak. Ezután a a lemezek felét 37°C-on, a másik felét 30°C-on termosztáljuk másnapig.

Mit várunk?

A kísérletben azt szeretnénk kimutatni, hogy a plazmid kényszerített eliminációja és a pusztán a szelekció hiányából adódó eliminációja közt milyen különbség van.

Várhatóan az ampicillinben 30°C-on növesztett sejtek az ampicillines lemezen és a nem szelektáló LB lemezen (30 és 37°C-on) is ugyanannyi telepet adnak, tehát az összes sejt száma megegyezik a rezisztens sejtek számával, mivel az összes sejtben van plazmid.

A nem szelektív környezetben növesztett sejtek egy része elveszti a plazmidot, emiatt ennek a szuszpenziónak a mérésekor talán eltérést fogunk tapasztalni a szeletív és a nem szelektív lemezeken számolható telepszámok között, de csak ha a veszteség elég nagy. A nem szelektáló lemezen várhatóan ugyanannyi sejt lesz, mint a másik esetben, hiszen a teljes baktériumszámot az LB tápanyagtartalma és a növesztés körülményei befolyásolják – ez kb. 109 nagyságrendbe esik majd A szelektív lemezen és a nem szelektív lemezen számolható telepek aránya fogja megmutatni, hogy mennyi volt a plazmidot megtartó sejtek aránya a teljes populációhoz képest.

A restriktív hőmérsékleten növesztett sejteknél azt várjuk, hogy kb. 1000-szeres (vagy akár 10000-szeres) különbség legyen a két lemez között, hiszen itt csak azokat a baktériumokat kapjuk vissza, melyek az 1:50000-szeres hígításban eredetileg levő plazmid mennyiséget tartalmazták. Alább a kísérlet általunk kapott eredménye látható:

Az NCBI nyitólapja.

6.21. Ábra Baktérium tenyészetek szelektív táptalajon. A fenti két képen a jobb oldali lemez az LB, a bal oldali az ampicillines LB, a felső két lemez 30°C-on, az alsó kettő 37°C-on volt növesztve.

Az összes lemezen a felső harmadban az eredetileg ampicillines LB folyadékban, 30°C-on növesztett sejtek láthatóak. A középső harmad az LB folyadékban, 30°C-on növesztett sejteket mutatja. Az alsó harmadban a 37°C-on LB folyadékban növesztett baktériumok láthatóak.

Jól látszik, hogy a jobb alsó lemezen a felső és a középső szekcióban három tömör baktériumfolt van, de nincsenek telepek. Ennek, ahogy fentebb említettük, az az oka, hogy amíg a baktériumcsepp elég tömény, addig a jelen lévő plazmid mennyiség elég ahhoz, hogy a sejtek növekedjenek, és pár osztódás is elég egy látványos baktériumfolt kialakulásához. Amikor a hígítás elér egy kritikus szintet, akkor a meglévő plazmidok már nem elegendőek a túléléshez, így itt hirtelen, átmenet nélkül kapunk 0 telepet. Ugyanezen lemez alsó harmadában még ilyen folt sincs, mert itt még a legtöményebb sejtszuszpenzióban sincs elegendő plazmid ahhoz, hogy a folt kialakuljon.

Az alábbi táblázat mutatja, hogy milyen CFU/ml értékeket kaptunk az egyes lemezeken:

LB, 30°C-os lemez

Amp, 30°C-os lemez

LB, 37°C-os lemez

Amp, 37°C-os lemez

Eredetileg Amp, 30°C folyadék

7. csepp, kb 30 telep: 3*109

7. csepp, kb 30 telep: 3*109

7. csepp, kb 30 telep: 3*109

Nem bomlott telepekre.

Eredetileg LB, 30°C folyadék

7. csepp, kb 15 telep: 1,5*109

7. csepp, kb 15 telep: 1,5*109

7. csepp, kb 20 telep: 2*109

Nem bomlott telepekre.

Eredetileg LB, 37°C folyadék

7. csepp, kb 15 telep:1,5*109

4. csepp, kb 30 telep: 3*106

7. csepp, kb 25 telep: 2,5*109

Nem nőtt semmi.

Tapasztalatok: az ampicillinben és az LB-ben, 30°C-on növesztett kultúrák hasonlóan viselkedtek: ugyanakkora telepszámot kaptunk minden lemezen, kivéve a 37°C-on növesztett ampicillines lemezen, amin nem kaptunk telepet. (A kenetszerűen nőtt részt nem vesszük figyelembe a CFU/ml számításnál.) Ez azt jelenti, hogy még 1:50000 hígítás esetén sem kapunk számottevő plazmid eliminációt.

A kényszerített eliminációnál (37°C-on, LB folyadékkultúrában növesztve) az LB-n (akár 30, akár 37°C-on) kapott CFU/ml értékhez képest 3 nagyságrenddel kisebb értéket kapunk a melegen növesztett ampicillines lemezen, azaz a teljes baktériumpopuláció 1/1000 részében található meg a plazmid.

A kísérlet jól szemlélteti, hogy bár a plazmidok a megfelelő antibiotikumos környezeten kívül kis mértékű hátrányt jelenthetnek a gazdasejtre nézve, de pusztán a szelekciós nyomás elvétele (azaz az antibiotikum hiánya) nem elegendő ahhoz, hogy a populációban gyorsan csökkenni kezdjen a plazmid mennyisége.

Kapcsolódó számítások:

  1. A gyakorlathoz 106 titerű fágra van szükség. A hűtőben találunk egy csőnyi fágot. 1 ml folyadékban felhígítjuk ennek a fágoldatnak 1 μl-ét, majd egy baktérium lemezre kicseppentünk a hígított fágból 10 μl-t. Másnapra 25 különálló plakkot számolunk. Alkalmas-e az eredeti fágoldat a gyakorlat végrehajtására?

  2. Egy kompetens sejtről azt állítja a gyártó, hogy a sejt kompetenciája 108 CFU/μg. 10 ng DNS t transzformálunk, hány telepet várunk?

  3. Egy ismert, 107 CFU/μg kompetenciájú sejtbe transzformáluk ismeretlen töménységű DNS ből 1 μl-t. A transzformálás végén a sejtek és a tápoldat összes térfogata 500 μl. Három lemezre szélesztünk: az elsőre 5 μl-t, a másodikra 50 μl-t, a harmadikra a maradékot. Az első két lemezen kb 10 illetve 100 telep nőtt, a harmadikon megszámlálhatatlanul sok. Mennyi lehetett a DNS koncentrációja?

  4. Fágoldattal fertőzünk baktériumkultúrát. Azt szeretnénk elérni, hogy maximum a sejtek 5%-a fertőződjön egynél több fággal. Milyen MOI-t kell alkalmazni?

  5. Baktériumszuszpenzióból tízszeres hígítási sort készítünk, majd 10-10 μl-es cseppeket cseppentünk LB táptalajra. Két párhuzamos lemezt készítünk, az egyiken a 7. csepp 12 telepet ad, a 8. csepp és az azt követőek egyet sem, a másikon a 7. csepp 9 telepet, a 8. csepp 2 telepet ad, az azt követőek egyet sem. (Az első csepp a lemezeken a tömény baktérium-szuszpenzió.). Mennyi lehetett az eredeti oldat CFU/ml értéke?