Genetikai betegségek, mutációk

Az orvostudomány, a molekuláris biológia és a genetika ugrásszerű fejlődésével lehetővé vált, hogy  az örökletes betegségeket konkrét genetikai mutációkhoz társítsuk, ily módon klinikai fenotípushoz hozzá lehet rendelni a genotípust. Egy genetikai defektusnak számos oka lehet. A betegséget okozó genetikai mutáció érinthet csupán pár nukleotidot, ezek az úgynevezett „kis” léptékű változások; vagy lehet „nagy” léptékű, kromoszóma szinten is látható (vagy nem látható, de jelentős) rendellenesség is. A kis léptékű változások közé tartoznak a pontmutációk vagy SNP-k (Single Nucleotide Polymorphism, vagyis egy nukleotidot érintő polimorfizmus, 7.4. ábra). Megkülönböztetünk olyan SNP-ket, melyek egy-egy nukleotid kicserélődése révén jöttek létre, ezek a misszensz, szensz és nonszensz mutációk, illetve olyanokat, ahol egy bázis kiesik – ezt deléciónak – vagy beékelődik – ezt inzerciónak –  nevezik. Ha a fehérjekódoló gén valamely exonjában olyan pontmutáció következik be, melynek eredményeképp a transzlálódó fehérje egy aminosava megváltozik, akkor misszensz mutációról beszélünk. Attól függően, hogy az aminosav-csere hogyan befolyásolja a keletkezett fehérje térszerkezetét és kötőhelyeit a misszensz mutáció gyakran káros, néha neutrális (ha közel azonos fizikokémiai tulajdonságú aminosav épül be) vagy ritkén előnyös. Szensz vagy silent pontmutációnak azt nevezzük, ha olyan nukleotid szubsztitúció történik az exonban, amely nem befolyásolja a transzlációt. Vagyis a kódlötyögés miatt az átíródó aminosav, és ezáltal a kész fehérje szekvenciája is azonos marad. Ez a mutáció típus többnyire neutrális, de az izoakceptor tRNS-ek[10] esetleges nem egyenletes eloszlásából fakadóan előfordulhatnak enyhén káros vagy előnyös formái is. A nonszensz mutáció pedig azt jelenti, hogy a bázis kicserélődés stop kodont hoz létre az exonban. Így a mutáció pozícióján leáll a fehérje átírása, és nagy valószínűséggel nem-, vagy csak korlátozottan működőképes proteint kapunk. A nonszensz mutációk szinte minden esetben káros hatásúak. Az exonban történt deléció vagy inzerció (közös elnevezésük: in/del) hatására eltolódhat a leolvasási keret. Ezt frameshift (frame = keret, shift = eltolódás) mutációnak nevezzük. A kereteltolódással járó in/del típusú mutációk nagyarányban káros hatásúak, mivel a mutációt követően teljesen más aminosavak épülnek be, mint a vad típusú gén átírása esetén, valamint valószínűsíthető egy korai stop kodon megjelenése is. Ha az in/del mutáció három (vagy három többszöröse számú) nukleotidot érint, akkor nem tolódik el a leolvasási keret.

A egy-, vagy pár nukleotidot érintő mutációkkal ellentétben a kromoszóma szinten látható (vagy nem látható, de jelentős) elváltozásokat „nagy” léptékű mutációknak nevezzük. Ide tartozik az egész kromoszóma darabot érintő inzerció és deléció, az amplifikáció (egyes szakaszok többszöröződése), a transzlokáció (egy kromoszóma darab áthelyeződése), a kromoszóma törése és az aneuploidia (egész kromoszómák, vagy genomok többszöröződése) is. Ezen elváltozások általában drasztikus hatással vannak a fenotípusra nézve, és sokszor letálisak, de olykor akár fajképződéshez is vezetnek.

A pontmutációk típusai

7.4. ábra: A pontmutációk típusai

A mutációk detektálása

A mutációk kimutatásához két alapvető megközelítést használhatunk: vagy közvetlenül (pl. szekvenálással) mutatjuk ki az elváltozást, vagy ismert markerek segítségével közvetett kimutatást alkalmazunk. Egy mutáció legbiztosabb, ám költséges kimutatása a szekvenálás. Ha gazdaságosabb módszert, vagy előzetes eredményt szeretnénk, akkor az ismert markerek kimutatására irányuló teszteket kell végeznünk. Markernek hívjuk a genom azon pontjait, amelyeket valamilyen módon azonosítani tudunk. Ilyen ismert markerek lehetnek a genom térképezési pontjai, vagyis az STS-ek (Sequence Tagged Site, azaz szekvenciával megjelölt helyek), melyeket általában PCR (Polimerase Chain Reaction, polimeráz láncreakció) segítségével mutathatók ki. Az STS egy viszonylag rövid (200-500 bázispár hosszú), ismert lokalizációval és bázissorrenddel rendelkező szakasz, amely a genomban csak egyszer fordul elő. Markerként használhatók az EST-k (Expressed Sequence Tag, jelölt átíródott szekvencia) is, melyek cDNS klón segítségével meghatározott részszekvenciák. Az EST-k egy adott mRNS jelenlétéről, egy gén működéséről, egy fehérjekódoló DNS szakaszról adhatnak információt. Ezek mellett számos egyéb marker típus létezik, közéjük sorolhatjuk pl. a különböző hosszúságú mikroszatellitákat is. Ahhoz, hogy a markerek segítségével genetikai elváltozásokat kutassunk, nem feltétlenül kell ismernünk magát az esetleg mutációt szenvedett gént vagy a hatásmechanizmusát. Ha egy betegség kapcsán felmerül a genetikai mutáció gyanúja, akkor különböző molekuláris technikákkal győződhetünk meg arról, hogy mely génben és milyen mutáció történt.

Egy genetikai betegség kimutatásához a következő lépéseken célszerű végigmenni: bioinformatikai rész: a vonatkozó szakirodalom feldolgozása, az érintett gén és a konkrét mutáció azonosítása, a megfelelő teszt kiválasztása; laboratóriumi teszt: a kimutatás végrehajtása, minőség-ellenőrzés. A továbbiakban a konkrét kimutatási technikákról lesz szó.

RFLP

Az RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, restrikciós fragment hossz polimorfizmus) a hagyományos mutáció kimutató technikák közé tartozik. Lényege, hogy a vad típusú és az ismeretlen DNS-t emésztik egy (vagy több) restrikciós endonukleáz enzimmel. A restrikciós endonukleázok a bakteriális „immunrendszer” részét képezik, és bizonyos 4-8 bázispár hosszúságú, palindrom[11] szekvenciájú DNS szakaszokat nagy pontossággal ismernek fel és hasítanak el. Ezeken a szakaszokon a DNS mindkét láncát hasítják. A baktériumokban betöltött biológiai szerepük a sejtidegen DNS (például a baktériumot megtámadó bakteriofág DNS-e) felismerése és megsemmisítése. Felfedezésük (W. Arber, H. Smith és D. Nathans: 1978-as Nobel-díj) tette lehetővé a géntechnológia megszületését. Az egyes restrikciós enzimek felismerő (és hasító) specifitása különbözik, vagyis más-más szekvenciájú DNS szakaszokat ismernek fel. Több száz különböző baktériumokból származó és kereskedelmi forgalomban is kapható restrikciós enzim létezik, melyek felhasználása messze túlmutat az RFLP eljáráson, például a génsebészet nélkülözhetetlen kellékei.

Az RFLP-vel történő mutáció-kimutatás akkor alkalmazható, ha a mutáció egy restrikciós endonukleáz hasítóhelyén van, ebben az esetben az adott enzim a mutáció helyén nem képes hasítani. Emiatt – a vad típushoz képest – megváltoznak a fragment-hosszak, ami jól látszik az emésztő enzimes kezelés után elvégzett gélelektroforézisen. A módszer tehát olyan SNP-k, inzerciók, deléciók kimutatására alkalmas, melyek érintik az alkalmazott restrikciós enzimek hasítási helyeit. Az RFLP hátrányai közé tartozik, hogy a kis fragmentek elválasztása miatt radioaktív jelölést kell alkalmazni, ami rákkeltő hatású, valamint, hogy csak akkor használhatjuk, ha ismerjük a szekvenciát és mutációt.

Az EcoRI nevű, Escherichia coliból kivont restrikciós enzim a kettős szálú DNS-t minden olyan ponton hasítja, ahol a 5'-GAATTC-3' szekvencia (nem metilált formában) előfordul. Az 5. ábrán egy olyan mutáció RFLP-vel történő kimutatása látható, ahol az EcoRI második hasítóhelyén történt egy pontmutáció, ezáltal az enzim itt nem képes hasítani, így két rövidebb helyett egy hosszabb szakaszt mutat a gélelektroforézis.

RFLP

7.5. ábra: RFLP: a) A vad típusú DNS lánc (DNS 1), három EcoRI hasítóhellyel, és a második EcoRI hasítóhelyen mutációt szenvedett DNS lánc (DNS 2). b) A két DNS lánc EcoRI-es emésztés utáni gélelektroforézisének eredménye.[12]

PCR

A PCR (Polymerase Chain Reaction, polimeráz láncreakció) (Kary Mullis és Michael Smith, 1993-as Nobel díj) egy olyan molekuláris biológiai technológia, melynek célja egy előre definiált (target) DNS szakasz enzimatikus amplifikációja (sokszorozása). A target DNS szakasz általában nem hosszabb 10 000 bázisnál, lehet egy gén, génrészlet vagy nem kódoló régió is.

A PCR reakció-elegybe a következők kellenek: templát DNS (pl. egy sejt maganyaga), nagy feleslegben primerek, Taq polimeráz enzim, dNTP mix és puffer-oldat. A templát DNS tartalmazza a sokszorozni kívánt target szakaszt. A két primer olyan rövid DNS lánc, amely meghatározza a target DNS szakaszt, ugyanis a primerek szekvenciája azonos a sokszorozni kívánt DNS szakasz elejével (5' vég) és végével (3' vég). Feladatuk, hogy specifikusan hozzákötődjenek az egyszálú DNS megfelelő szakaszához – így ezen a szakaszon ismét kétszálú lesz a nukleotidlánc –, ami elengedhetetlen a Taq DNS-polimeráz enzim bekötődéséhez, vagyis a komplementer DNS szál felépüléséhez. A Taq DNS-polimeráz egy hőstabil enzim, melyet a hőforrásokban élő Thermus aquaticus baktériumból vontak ki, feladata a DNS másolása magas hőmérsékleten. A dNTP (dezoxiribonukleid trifoszfát) mix az új DNS szálak felépítéséhez szükséges ATP-t, TTP-t, GTP-t és CTP-t tartalmazza. A DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet a puffer-oldat biztosítja.

A reakció egy PCR készülékben zajlik, amely biztosítja a PCR folyamathoz szükséges változó hőmérsékleteket. Ugyanis a PCR reakció úgy zajlik, hogy a reakció-elegyet a készülék először 94-96°C-ra felmelegíti, ekkor a templát DNS-ek egyszálúsodnak, vagyis a hidrogénhidak felbomlása által denaturálódnak. Ezután az elegyet a készülék 45-60°C-ra hűti, hogy a primerek hozzá tudjanak kapcsolódni a nekik megfelelő target DNS szálakhoz. A kapcsolódási hőmérséklet a primerek szekvenciájától függ és általában 5°C-kal van a primerek olvadási hőmérséklete alatt. Ezt a lépést anellálásnak vagy kapcsolódási lépésnek nevezzük. Ha a hőmérséklet túl magas, a primerek nem kötődnek a templáthoz, ha túl alacsony, akkor a nem specifikus helyekre is bekötődnek, esetleg fals termékeket hozva létre. Ezek után újra emeli a hőmérsékletet, 72°C-ra. Ezen a hőfokon kezdi szintetizálni a templát DNS komplementer szálait a Taq polimeráz. A szintézis a kapcsolódott primernél kezdődik, és végigmegy a DNS-szálon. A lépés neve meghosszabbítás, ami a szintetizálás alatt álló DNS meghosszabbítására utal. A szintetizálás során a szülő nukleinsavszál templátként szolgál a leány lánc létrehozásához. A leány szál egy perc alatt kb. 1000 bázissal hosszabbodik. Ezután a készülék újra 96°C-ra melegíti az elegyet és a ciklus kezdődik elölről (7.6. ábra). Egy-egy ciklus pár percig tart. A legelső kör előtt a DNS-t általában hosszabb ideig denaturálják, hogy a templát DNS és a primerek esetleges kettős szálai is teljesen szétváljanak. Elméletileg minden ciklusban megduplázódik a target DNS molekulák száma. 25-30 ismétléssel már megfelelő mennyiségű, gélelekrtoforézissel is kimutatható DNS képződik. A PCR reakció annyira érzékeny, hogy extrém esetben akár egyetlen DNS molekulát is meg lehet sokszorozni vele. Ha egyetlen DNS szálból indulunk ki és 25-ször ismételjük a reakciót, akkor a végén 225, azaz 33 554 432, vagyis kb. 3,36×107 darab target DNS-ünk lesz. A PCR-termékek gélelektroforézis segítségével a méretük alapján azonosíthatóak. A termék mérete egy, szintén a gélbe injektált, ismert hosszúságú DNS-szakaszokat tartalmazó DNS-létrával összehasonlítva határozható meg.

A PCR reakció menetének összefoglalása:

  1. T↑, denaturálás: egyszálúsodnak a DNS-ek

  2. T↓, anellálás: a primerek hozzákapcsolódnak a target szakaszokhoz

  3. T↑, meghosszabbítás: a Taq polimeráz szintetizálja a komplementer szálat

  4. vissza az 1. pontra (25-30 ismétlés)

A hagyományos PCR reakció menete

7.6. ábra: A hagyományos PCR reakció menete[13]

PCR primer tervezés

A primerek olyan rövid, egyszálú DNS darabok, melyek megegyeznek az amplifikálni kívánt templát DNS szakasz elejével és végével. E szakaszok kiválasztásánál (vagyis a primerek tervezésénél) több szempontot figyelembe kell venni, hogy a PCR reakció megfelelően menjen végbe:

  • Olvadási hőmérséklet: A primerek olvadáspontjának vagy olvadási hőmérsékletének (Tm, melting = olvadás) közel (°C-ra pontosan) azonosnak kell lennie. Olvadási hőmérséklet az a hőfok, ahol a primerek fele a DNS-hez kötötten, fele pedig az elegyben szabadon van. Ez a hőmérséklet ideális esetben 60°C körül mozog. Ha a két primer olvadási hőmérséklete nem egyezik meg, előfordulhat, hogy bizonyos hőmérsékleten az egyik primer már hozzáköt a templát DNS-hez, a másik pedig még nem. Ha viszont addig csökkentjük a hőmérsékletet, amíg a másik primer is hozzáköthet a templáthoz, akkor az egyik primer már nem specifikus helyekre is betapad. Ugyanis az olvadáspontjánál alacsonyabb hőmérsékleten a DNS képes nem-specifikusan is kötődni. A primerek olvadáspontja a hosszuktól és a G-C arányuktól függ.

  • Hossz: A megfelelő specificitás miatt a primerek ideális hossza 18-25 bázis. Egy kb. 20 bázis hosszú szakaszról már elmondható, hogy egyedi szekvencia, a genomban nincs több vele azonos régió (kivéve, ha ismétlődő szakaszt tartalmaz). Ha a primerek lényegesen rövidebbek, akkor nem lesznek elég specifikusak, vagyis előfordulhat, hogy nem csak egyetlen helyre tudnak bekötni. Ha a targethez képest elég közel több helyre is be tud kötni a primer, akkor az fals termékek jöhetnek létre. Ha a DNS egy távolabbi szakaszára is bekötődik a primerünk, akkor nem képződik annyi megsokszorozott DNS szál, amennyi elméletileg lehetséges lenne (minden ciklusban megduplázva a számukat), mert ez a kötés elvonja a reakciótól a primereket.

  • G-C arány: A G-C arány a DNS-ben lévő G és C bázisok A-T-hez viszonyított arányát jelenti. Minél több, egymással háromszoros hidrogénkötést kialakító G és C bázis található egy DNS szakaszon, annál magasabb lesz az olvadáspontja. Ugyanis a háromszoros hidrogénhidak magasabb hőmérsékleten válnak szét, mint az A és T között kialakuló kettős hidrogénkötések. Ha a primer kb. 20 bázis hosszúságú és 50% a G-C arány benne, akkor kb. az ideális, 60°C lesz az olvadáspontja. Ha azon a DNS szakaszon, ahova a primert tervezzük túl nagy a G-C arány, akkor jobb kicsit máshová tolni a primert, mint csökkenteni a primer hosszát. Ugyanis a rövidebb primer kevésbé specifikus. Ha az adott szakaszon alacsony a G-C arány, akkor viszont megtehetjük, hogy kicsit növeljük a primer hosszát, ám ezzel növeljük a komplementaritási problémák esélyét is. A jó primer elején több a G és C bázis, mert ezek segítségével jobban oda tud kötni a templáthoz; a végén pedig több az A és T, amihez viszont a Taq polimeráz enzim kötődik szívesebben.

  • Komplementaritás: A primerek szekvenciái nem lehetnek egymás vagy önmaguk komplementerei (7.7. ábra). 3' komplementaritásnak nevezzük, ha két primer a 3' végein képez dimért (párosodott DNS szálat). Mivel a Taq polimeráz az ilyen primer dimérhez is hozzá tud kötni, ezért fals termék keletkezik. Továbbá a dimér képzés elvonja a primereket a reakciótól, így a normál termék is kevesebb lesz. 5' komplementaritásnak azt hívjuk, amikor a primer pár az 5' végein képes összetapadni. Az 5' komplementaritás esetében nem keletkezik fals termék, de a primereket a dimér szintén elvonja a reakciótól. További veszélyeket rejt az önkomplementaritás, amikor az egyik primer másodlagos szerkezetet alakít ki önmagában, pl. ha a primer elején lévő bázisok komplementerei a végén lévő bázisoknak, akkor a két vég összetapad. Ha egy önkomplementer primerben maradnak szabadon egyszálú részek is, akkor fals termék keletkezhet (mivel ekkor az egyszálú szakasz egy rövidebb primerként viselkedik, ami sok helyre beköthet a templát DNS-en). Továbbá az önkomplementaritás szintén elvonja a primereket a reakciótól, így kevesebb valós termék keletkezik.

Primer-tervezés és a komplementaritási problémák

7.7. ábra: Primer-tervezés és a komplementaritási problémák: a) A két primer kötőhelye; b) 3' komplementaritás; c) 5' komplementaritás; d) önkomplementaritás, a kapcsos zárójel azt a szakaszt jelöli, ami egy rövidebb primerként viselkedve sok helyre beköthet a templát DNS-en

  • Bázis ismétlődés: További kritérium, hogy a primerben ne legyen sok azonos bázis egymás után, mert a komplementer helyekre betapadva „megcsúszhat” a primer, ami által eltérő hosszúságú DNS szálak keletkezhetnek.

Összefoglalva a primer-tervezés lényegét: a target DNS szakasz elején és végén két olyan 18-25 bázis hosszúságú szakaszt kell találni, amelyekre a fenti feltételek mind teljesülnek. Hogy ezt a bonyolult műveletet ne kézzel, illetve szemmel kelljen megoldani, többféle primer-tervező szoftver áll a kutatók rendelkezésére.

A PCR reakció kontroll kísérletei

Mivel a PCR egy rendkívül érzékeny reakció (extrém esetben akár egyetlen DNS molekulát is meg lehet vele sokszorozni, vagyis ki lehet mutatni), ezért a reakció során nagyon körültekintően kell eljárni, és steril körülmények között dolgozni. A sterilitást többnyire a munkaterület UV fénnyel történő besugárzásával érik el. Az UV fény hatására a DNS-ben timin-dimérek keletkeznek[14], melyek a PCR reakció folyamán megállítják a DNS polimeráz enzimet. Vagyis azokat a DNS szálakat, melyeken timin-dimérek vannak nem sokszorozza a PCR reakció.

Hogy megbizonyosodhassunk arról, hogy a PCR reakció rendben végbemegy, a szóban forgó amplifikáción kívül egy pozitív kontroll kísérletet is el kell végeznünk. A pozitív kontroll PCR-t úgy állítjuk össze, hogy mindenképp teszünk bele egy olyan DNS templátot, melyet biztosan amplifikál az elegyben lévő primer pár és polimeráz enzim. Ezt a pozitív kontroll DNS templátot a primerekkel együtt lehet kapni. A pozitív kontroll amplifikációs termékei jelzik a rendszer megfelelő működését. Ha a pozitív kontroll kísérlet végén nem kapunk DNS termékeket, akkor valami hiba van a PCR reakcióban, pl.: megromlott a Taq polimeráz enzim, nem működött megfelelően a PCR készülék vagy kihagytunk valamit a reakció elegyből.

Hogy a steril körülmények felől megbizonyosodjunk egy negatív kontroll PCR reakciót is össze kell állítanunk. A negatív kontroll reakció elegyéhez hozzáadunk minden – a PCR reakcióhoz szükséges – összetevőt, kivéve a DNS templátot. Ha a negatív kontroll kísérlet végén is kapunk megsokszorozott DNS terméket, akkor valamilyen úton DNS szennyezés került a reakció elegybe (pl. valamelyik eszköz vagy reagens szennyezett volt).

Ha a pozitív kontroll kísérletben sikerült a DNS-t megsokszorozni, a negatív kontrollban pedig nem, akkor a kimutatási PCR reakció eredményét is jogosan értékelhetjük valósnak.

Mutációk detektálása hagyományos PCR-rel

A hagyományos (vagyis az előzőekben tárgyalt) PCR reakció a target DNS amplifikációja által alkalmas lehet inzerció, deléció és pontmutáció kimutatására is. A kimutatás menete: az egyik primert a mutáció által érintett helyre, de a vad típusú DNS szakaszra tervezzük. Ha a PCR technikával történő kimutatásnak van megsokszorozott DNS terméke, akkor vad típusú, nem mutáns DNS volt a templátunk, ha nincs termék, akkor mutáns DNS volt a mintában. Hosszabb inzerciót és deléciót úgy is ki lehet mutatni, hogy a primereket az in/del szakasztól up- és downstream tervezzük. Ekkor minden esetben lesz DNS termék, de a PCR utáni gélelekrtoforézisben láthatóvá válik az amplifikált DNS-ek hossza. A hosszból pedig következtethetünk az inzercióra vagy delécióra.

STS-ek kimutatása már kész primerek állnak a kutatók rendelkezésére. Ha az adott PCR reakció nem adott eredményt, akkor a kimutatandó STS marker nincsen jelen a templát DNS-ben.

Speciális PCR technikák

Allélspecifikus PCR

Az allélspecifikus PCR homo- vagy heterozigóta állapotban lévő SNP-k kimutatására alkalmas (7.8. ábra). Az egyik primert arra a DNS szakaszra tervezzük, ahol az SNP van. Ebből a primerből készítünk egyet a vad (WT, wild type) és egyet a mutáns (M, mutatnt) típusra is, ahol e két primer között egyetlen nukleotidnyi eltérés lesz. Ezen kívül van még egy közös primer is, az SNP által nem érintett régióban. Minden DNS mintára két PCR reakciót kell kivitelezni, egyet a vad típusú + közös primer párral, és egyet a mutáns + közös primerpárral. Ha az amplifikált DNS-eket gélre visszük láthatóvá válik, hogy az egyed hordozza-e az adott SNP-t homo- vagy heterozigóta állapotban.

Allél specifikus PCR reakció

7.8. ábra: Allél specifikus PCR reakció: a) allélspecifikus primerek és a közös primerek;b) a gélelekrtoforézis eredménye

Multiplex PCR

Ha egy PCR reakcióban egyszerre több primerpárral dolgozunk, azt multiplex PCR-nek hívjuk. Segítségével egyszerre több DNS szakasz is amplifikálható adott templátról. Fontos, hogy a szakaszok hossza eltérő legyen. Ha több target DNS szakaszt is sikerül sokszorozni, akkor a gélen több sáv (band) lesz egymás alatt. A multiplex PCR nagyon gondos primer-tervezést igénylő feladat, hiszen itt nem csak kettő, hanem az összes primerre egyszerre kell, hogy igaz legyen, az azonos Tm, a komplementaritások hiánya és a többi kritérium.

Real-time PCR

A real-time vagy valós idejű PCR reakció lényege, hogy az eredmények a reakcióval egy időben, folyamatosan követhetők és nem csak a PCR reakció utáni gélelektroforézisből derül majd ki, hogy sikerült-e az adott amplifikáció. A real-time PCR-nél a fragmensek DNS olvadáspont elemzéssel válnak azonosíthatóvá. Ugyanis a DNS olvadáspontja arányos a nukleotid összetétellel (vagyis a G-C aránnyal) és a DNS hosszával. A real-time PCR reakcióhoz szükség van egy olyan festékre vagy próbára, amely jelzi, hogy éppen mennyi DNS szál van a reakció elegyben.

Az egyik ilyen jelölő a SYBR® green nevű festékanyag, ami – mint az etídium bromid – interkalálódik („beleül”) a duplaszálú DNS-be (ds vagyis doubble stranded DNS). Egyszálú DNS-hez (ss vagyis single stranded DNS) nem köt és nem is világít. Duplaszálú DNS-be kötődve, monokróm fénnyel indukálva világít, vagyis 530 nm-s hullámhosszú fényt emittál (7.9. ábra). Az ebből keletkező mérhető fluoreszcens jel nagysága a PCR folyamán szaporodó dsDNS mennyiségével arányosan növekszik.

A SYBR® green viselkedése egyszálú és duplaszálú DNS szekvenciával

7.9. ábra: A SYBR® green viselkedése egyszálú és duplaszálú DNS szekvenciával: a) egyszálú DNS mellett nem világít; b) duplaszálú DNS-be interkalálódva világít

A real-time PCR-rel történő termék DNS mennyiségének mérésének másik módja az úgynevezett a TaqMan próba, amely a hibridizációs próbák közé sorolható (7.10. ábra). A hibridizációs próbák lényege, hogy a két hagyományos primer mellett egy hibridizáló vagy próba primert is adunk a reakcióhoz. A hibridizáló primer a két eredeti primer között tapad a szimplaszálú DNS-en, a neki megfelelő szakaszra. A próba primer egyik végéhez egy fluorokróm, másik végéhez egy kioltó (quencher) molekulát kapcsolnak. Ezeket jelzéseknek hívjuk. Amikor a két jelzés közel helyezkedik el egymáshoz, vagyis ép a próba, akkor a fluorokróm által emittált fényt a kioltó képes elnyelni. Vagyis az ép próba primer nem világít. A 3’ végen módosított TaqMan próba primert a Taq polimeráz enzim nem képes meghosszabbítani, hanem 3’→5’ exonukleáz aktivitásával  nukleotidokra bontja azt. Ezek után a kioltó elég messze kerül a fluorokrómtól, így nem gátolja tovább annak működését. Ezért monokróm fénnyel történő besugárzás hatására bekövetkezik a fényreakció. A TaqMan próbás real-time PCR előnye, hogy nagyon specifikus.

A TaqMan próba menete

7.10. ábra: A TaqMan próba menete: R: a fluorokróm, Q: a kioltó a próba primeren; sárga gömb: a Taq polimeráz enzim. 1.: a TaqMan próba primer betapad a vele komplementer ssDNS-re. 2.: A Taq polimeráz eléri a próba helyét. 3.: A Taq polimeráz lebontja a próbát. 4.: A szabad fluorokrómfénygerjeszés hatására világít.[15]

SSCP

Az SSCP, Single Stranded Conformational Polymorphism, vagyis „egyszálú konformációs polimorfizmus” szintén egy SNP kimutatásra alkalmas technika (7.11. ábra). Alapja, hogy az egyszálú DNS-lánc már egyetlen nukleotid eltérés miatt is más konformációt vesz fel, mint a vad típusú párja. Az elválasztást natív (nem denaturáló) körülmények között végzik, gélelektroforézissel. A gélben a vad típusú és az mutációt tartalmazó egyszálú DNS-ek, a konformációs eltérések miatt, különböző sebességgel vándorolnak. Az SSCP technika az SNP-k kimutatása mellett alkalmazható kisebb inzerciók és deléciók detektálására is. Előnye, hogy nem kell feltétlenül előre ismerni a mutációt, valamint, hogy az hetero- és homozigóta állapotban is kimutatható. Az eljárás technikailag viszonylag egyszerű (ha nem kell radioaktív jelölést alkalmazni) és gazdaságos. Hátránya, hogy csak arról szolgáltat információt, hogy van-e mutáció, arról nem melyik gén, melyik pozíciójában.

Az SSCP menete

7.11. ábra: Az SSCP menete

Microarray

Egy másik, egyelőre meglehetősen költséges és nem túl megbízható, de egyszerre sok vizsgálatra lehetőséget adó módja az SNP-k kimutatásának a microarry vagy chip technológia. A microarray gyűjtőneve több párhuzamos kimutatásokon alapuló technikának, mint a DNS alapú génexpressziós chip és oligonukleotid chip, az immuno-precipitációs chip, és a fehérje chip. A módszer lényege, hogy egy kisméretű üveg vagy műanyag lapra (7.12. ábra) négyzetrácsos elrendezésben biológiai mintákat visznek föl, minden pontba mást. A fluoreszcensen megjelölt vizsgálni kívánt biológiai anyagot kölcsönhatásba hozzák a pontokkal, és detektálják, hogy mely pontokban jött létre kölcsönhatás.

Egy microarray lap

7.12. ábra: Egy microarray lap

DNS microarray-ek

A DNS chipeket alkalmazásának két fő területe: az egész sejtek, szövetek génexpressziós mintázatának megfigyelése, és a genetikai különbségek (pl. SNP-k, inzerciók, deléciók) kimutatása a teljes genomból. Mi most ez utóbbi kimutatásra térünk ki bővebben:

A DNS chipek a DNS hibridizációs technikák csúcsát jelentik, ugyanis egy egy-négyzetcentiméteres lapocskán akár több tízezer[16] – az egész genomra jellemző – SNP is vizsgálható egyszerre. A lapra szabályos rendben több tízezer különböző, mesterségesen szintetizált rövid, egyszálú DNS-t visznek fel. Egy pontban több példányban található meg ugyanaz az oligonukleotid szekvencia. A lemezkén a különböző oligonukleotidok több százezer pontban helyezkedhetnek el (7.13. ábra). Ha SNP-ket vizsgálnak, akkor az oligonukleotidok szekvenciái a populációra, fajra jellemző SNP-k komplementerei lesznek. Az oligonukletidok 25mer hosszúak, egy gént kb. 20 oligonukleotid reprezentál, egy SNP detektáláshoz kb. 40 oligonukleotid szükséges. A chipen minden oligonukleotid típus helyét (koordinátáit) pontosan ismerik. A vizsgálandó genomot megfelelő méretű DNS darabokra bontják, egyszálúsítják és fluoreszcens festékkel jelölik. A vizsgálandó mintát ráviszik a chip felszínére. Ahol a jelölt DNS megtalálja a komplementerét a chipen, oda hibridizál vagyis betapad. A nem hibridizált DNS-t lemossák a chip felszínéről (7.14. ábra). Lézer besugárzás után egy nagy-felbontású szkennerrel olvassák le a chipen lévő fluoreszcens mintázatot. Ezután pontosan megállapítható, hogy mely ponton lévő, vagyis milyen SNP-re jellemző helyre hibridizált a vizsgált minta, és felállítható az egyén SNP mintázata.

A DNS chip létrehozásának két alapvető módja létezik: az egyes oligonukleotidokat robot helyezi el a megfelelő pontra, vagy helyben szintetizálják a DNS szálakat. A helyben szintetizálás hasonlít a tintasugaras nyomtató technológiájára (7.15. ábra): a lemezre felvitt iniciátor molekulához ott tapad be a hozzáadott nukleotid, ahol azt előzőleg fénybesugárzás érte. A fénybesugárzás helyét pontokban kilyuggatott maszkkal kontrollálják.

Oligonukleotidok a DNS chipen

7.13. ábra: Oligonukleotidok a DNS chipen[17]

A jelölt DNS hibridizál a chipen lévő komplementerével

7.14. ábra: A jelölt DNS hibridizál a chipen lévő komplementerével[18]

A DNS chip előállítása helyben szintetizált oligonukleotidokkal

15. árba: A DNS chip előállítása helyben szintetizált oligonukleotidokkal[19]

Már egyetlen microarray kísérlet is olyan sok eredménnyel szolgál, hogy bioinformatikai módszerek nélkül szinte lehetetlen lenne kiértékelni. A kiértékeléshez használhatjuk a chip gyártója által árusított szoftvert vagy az R programnyelvre írt ingyenes Bioiconductor programot.

A microarray technológia elterjedését némiképp gátolja, hogy az eredmény – pl. a rengeteg egyszerre vizsgált tulajdonság miatt – nem minden esetben reprodukálható teljes mértékben.



[10] Izoakceptorok: két vagy több különböző antikodonú tRNS ugyanazt az aminosavat képes megkötni és hordozni.

[11] Olyan szó vagy mondatrészlet, amely visszafelé olvasva is ugyanaz, pl: „Géza, kék az ég”. Egy DNS szakasz akkor palindrom, ha a komplementer szálat olvasva is ugyanazt kapjuk.

[14] Gerjesztés hatására a DNS ugyanazon láncában egymás mellett elhelyezkedő két timin között kötések alakulnak ki.

[15] Az eredeti kép forrása: Ruhr-Universität Bochum

[16] SNP kimutatása chipen: Affymetrix 10K, 50K, 500K SNP genotyping kit: 10-, 50-, 500 ezer SNP kimutatása 2 db chipen

[17] Az eredeti kép forrása: Affymetrix

[18] Az eredeti kép forrása: Affymetrix

[19] Az eredeti kép forrása: Affymetrix