Példák öröklődő betegségekre

Az V véralvadási faktor Leiden-mutációja

A V (ötös) faktor (F5) a véralvadási kaszkád egyik fehérjéje, mely mind a belső- (intrinsic), mind a külső (extrinsic) úton beindult véralvadási láncban szerepet játszik. Ha a X faktor aktiválja az V faktort, akkor az beindítja a protrombin trombinná való alakulását, ami trombus képződéshez vezet. Hogy a trombus képződés kellő időben leálljon az aktivált V faktort az aktivált C fehérje (APC) hasítja.

Az V faktor trombofília, melyet a hollandiai Leiden városából írták le először, egy genetikai eredetű véralvadási zavar. A véralvadási zavar kiváltó oka, hogy az aktivált V faktor ellenáll az aktivált C fehérje hasításnak (7.18. ábra). Az alvadást elősegítő faktorok bomlásának lassulása következtében a betegeknek fokozottan alvadékony a vére, így trombózisra – azaz vérrögképződés okozta érelzáródásra – hajlamosak. A kórképet előidéző Leiden-mutáció egy G→A misszensz pontmutáció az V faktor génjének 10. exonjában, amely Arg→Gln cserét eredményez az érett fehérje 506. aminosav pozícióján.  A mutációt szenvedett aminosav pont a C fehérje hasítóhelyeinek egyikén található, így ezen a ponton a fehérje képtelen az V faktort bontani. Ezáltal a Leiden- mutációs V faktor bontása tízszerte lassabban megy végbe, mint a normál, vad típusú V faktor esetében. Ezért az V faktor mennyisége növekszik a keringésben. Így a magasabb trombin szint és egyéb aktivált koagulációs faktorok miatt előáll egy enyhe hiperkoagulábilis állapot. A betegnek pedig nagyobb valószínűséggel lesz mélyvénás trombózisa.

Az V véralvadási faktor szerepe a véralvadásban

7.18. ábra: Az V véralvadási faktor szerepe a véralvadásban. Jelölések: fekete nyíl: aktiválás, piros vional: inaktiválás, TM: trombomodulin, APC: aktivált protein C, PL: foszfolipid[20]

A Leiden-mutáció valószínűleg a XV. századi Európában jelent meg először. Elterjedésében segíthetett, hogy a középkorban még szelekciós előnyt is jelenthetett: az akkoriban nem ritka véres összecsapásokban, háborúkban a gyors véralvadás életet menthetett. Az Oszmán Birodalommal folytatott véres ütközetekre gondolva nem csoda, hogy a gén Magyarországon is gyakori, a mai magyar népesség 5-6%-a hordozza.

A Leiden-mutáció autoszómálisan, recesszíven öröklődik[21]. Heterozigócia esetén – a vad típusú homozigótákhoz képest – 6-8-szor nagyobb a trombózisveszély. A Leiden-allélra homozigótáknál a trombózis veszély nyolcvanszor(!) magasabb, mint a vad típusú homozigótáknál. Mivel a Leiden-allél előfordulása elég gyakori a magyarországi populációkban – az öröklés lehetőségeinek kiértékeléséhez – a beteg egyén szűrése mellett, szükséges lehet a szülők tesztelése is. A trombózis veszélyt tovább növelheti a terhesség illetve a fogamzásgátlók alkalmazása is. A génhiba jelenleg nem gyógyítható. Leiden-mutáció esetén élethosszig tartó véralvadásgátló kezelésre lehet szükség.

A Leiden-mutáció kimutatása

Ha az embernek volt korábban mélyvénás trombózisa, embóliája vagy a családjában több trombózisos eset is előfordult, indokolt egy Leiden-mutációt kimutató tesztet csináltatnia. A mutációt genetikai és biokémiai tesztekkel is ki lehet mutatni. Biokémiai teszt segítségével kimutatható a nagyobb APC rezisztencia szint, de ezt egyéb mutációk is okozhatják. Genetikai teszttel pedig a konkrét mutáció is beazonosítható, így lehetővé válik a genetikai tanácsadás.

Az V faktor génje az ember 1. kromoszómájának q karján, a 23-as régiójában található. A kimutatásokat vérből vett mintából végzik, vagyis a komplett V faktor génnel dolgoznak, nem az mRNS-sel. Genetikai tesztet végezhetünk például RFLP-vel. Ugyanis a Leiden mutáció pont elrontja az V faktor génjében található MnlI restrikciós enzim[22] hasítóhelyét. A MnlI egy érdekes restrikciós enzim, négy nukleotidot ismer fel: a CCTC-t vagy a GAGG-t, és ettől 7 bázispárra hasítja a DNS-t. A Leiden-mutáció pont egy MnlI felismerőhelyen található. Ha mutáns a gén, akkor MnlI emésztés után ez a hasítóhely egyben marad (7.19. ábra). Így a mutáció meglétét vagy hiányát a restrikciós enzimmel történő kezelés utáni gélelekrtoforézis egyértelműen mutatja.

A Leiden-mutáció helyén nem hasít az MnlI restrikciós enzim

7.19. ábra: A Leiden-mutáció helyén nem hasít az MnlI restrikciós enzim: A piros csíkokkal jelölt adenin a Leiden-mutáció (a vad típusban guanin lenne). A bordó nyíllal jelölt hely lenne a vad típusban az MnlI restrikciós enzim felismerő helye, kis bordó háromszöggel jelölt pedig a hasító helye.

Az V faktor Leiden mutációjának kimutatása allélspecifikus PCR reakcióval

A genetikai teszttel történő Leiden-mutáció kimutatásának másik lehetséges módja az allél specifikus PCR. Hogy a reakcióhoz primereket tervezzünk, meg kell találjuk a mutáció pontos helyét az V faktor génjében. A mutáció az érett fehérje 506. aminosavát érinti, mely pozíción a vad típusra jellemző arginin helyett a Leiden-mutánsban glutamin található. Kodonok szintjén az arginint kódoló CGA-ból lesz glutamint kódoló CAA, vagyis a mutáció a második kodon pozíciót érinti.

A mutáció az V faktor génjének 10. exonjában található. Hogy megtudjuk, pontosan hányadik pozíción előbb célszerű az mRNS-ben megkeresnünk, hiszen ezt könnyebben össze tudjuk illeszteni a fehérje szinten rendelkezésünkre álló pozícionális információval. (Az NCBI OMIM adatbázisban megadott 1691. mRNS pozíció történeti okokból kifolyólag hibás. Vagyis egy régebben bekerült szekvencia pozíciójára vonatkozik, ám akkor még nem tudták pontosan, hogy hol kezdődik az átíródás.[23]) Mivel az NCBI adatbankban lévő mRNS-nek nevezett szekvenciák az egész átíródó régiót tartalmazzák, ezért a GenBank-ben található NM_000130-ös számú mRNS rekord alapján következőképpen tudjuk kiszámolni a mutáció pozícióját:

230 + (505 × 3) + 1 = 1746

A képletben a 230 az érett peptid kezdete (nukleinsavban megadva). Az 505 a mutáció előtti utolsó aminosav helye, ezt a tripletek miatt szorozzuk hárommal. A +1 pedig a 2. kodonpozíció miatt szükséges. A Leiden mutáció tehát az 1746. mRNS pozíción található.

Ha kimásoljuk az 1727-1746. pozícióig terjedő régiót – megjegyezve, hogy ennek a 20 hosszú oligonukleotid régiónak pont a végén található a Leiden-mutáció esetleges helye – és ezt az oligonukleotidot megpróbáljuk azonosítani (illeszteni) az emberi genomban található génszekvencián, akkor megtudhatjuk, hogy a Leiden-mutáció az V faktor génjében a 36722. pozíciót érintheti (lásd 7.20. ábra).

Leiden-mutáció az V faktor génjében

7.20. ábra:  Leiden-mutáció az V faktor génjében

Ezek után primereket kell tervezni az allélspecifikus PCR-hez erre a génrégióra. Az egyik primert úgy tervezzük, hogy a 36722. pozíció a primer 3' végén legyen (az 5' végen nem lenne annyira specifikus). Ebből a primerből kell egy vad és egy Leiden-mutáns típus is. A másik primer ettől tetszőleges, 150-1000 bázisnyira helyezkedik el. Az allélspecifikus PCR-t először a vad típusú, majd a mutáns primerrel (és azonos párjukkal) végezzük el. Az eredményt gélre visszük (7.21. ábra). Ha csak a vad típusú primerrel kaptunk eredményt, akkor a vizsgált személy erre a betegségre nézve egészséges volt; ha csak a mutáns primerrel, akkor homozigóta Leiden-mutáns; ha pedig mindkét primerrel, akkor heterozigóta.

A Leiden-mutáció kimutatása PCR-rel

7.21. ábra: A Leiden-mutáció kimutatása PCR-rel. A gélelekrtoforézis eredmény rajza: a) egészséges minta; b) Leiden homozigóta minta; c) heterozigóta minta. W: vad típusú primer; L: Leiden-mutációs primer

Primer tervezés a Leiden-mutáció allélspecifikus PCR-rel történő kimutatásához

  1. Internet böngésző programban nyissuk meg az NCBI oldalát: www.ncbi.nlm.nih.gov. Az NCBI GenBankban (Nucleotide) a coagulation factor V keresőszavak használatával és a Homo sapiens szűkítéssel (jobb oldalon: Top organisms) keressük meg a megfelelő mRNS és genomi DNS (gén) rekordokat, és és nyissuk meg őket külön lapokon:Homo sapiens coagulation factor V (proaccelerin, labile factor) (F5), mRNA; NM_000130Homo sapiens coagulation factor V (proaccelerin, labile factor) (F5), RefSeqGene on chromosome 1, NG_011806

  2. Az mRNS-ben keressük meg az 1746. nukleotidot, jelöljük ki ezt, és az előtte lévő 19 bázist. Az oligonukleotidot másoljuk be egy text file-ba, és mentsük el Mut_place.fasta néven.

  3. A lementett Mut_place.fasta file-ból hozzunk létre fasta szekvencia formátumot, úgy hogy az elejére írjunk egy fejlécet: >Mut_place. Utána sortörés (enter), és mentsük le.

  4. A gén szekvenciát is mentsük le fasta formátumban (jobbra fent: Download → FASTA), VFactor_gene.fasta néven.

  5. Az EMBOSS bioinformatikai programcsomag segítségével keressük meg a génben azt a pozíciót, melyet a Leiden-mutáció érinthet: Nyissuk meg az EMBOSS online verzióját pl. a emboss.bioinformatics.nl honlapon. A bal oldali menüben található ALIGNMENT LOCAL csoportból kattintsunk a wordmatch-re. 1. szekvenciának töltsük fel a  Mut_place.fasta-t, 2-nak a VFactor_gene.fasta-t. A kereső szó hosszát (Word size) állítsuk 20-ra. Az illesztés formájának (Alignment format) az old EMBOSS format-ot válasszuk. Nyomjuk meg a run wordmatch gombot. A kapott eredményből látszik, hogy a genomi szekvenciában a 36722. nukleotid a Leiden mutáció helye.

  6. Nyissuk meg a Primer3Plus on-line primer-tervező programot a www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi webhelyről és töltsük be a VFactor_gene.fasta szekvenciát (7.22. ábra).

    1. Bal oldali primernek adjuk meg a CAGATCCCTGGACAGGCG szekvenciát (Pick left primer or use left primer below). Melynek az utolsó bázisa esik majd a gén 36722. nukleotidjára.

    2. Az általános beállítások (General Settings) fülnél írjunk be egy nagyobb – gélelekrtoforézissel könnyebben kimutatható – termék méretet (Product Size Ranges: 501-600). A primer-tervezés elindításához nyomjuk meg a Pick Primers gombot (zöld gomb, jobb oldalon felül).

    3. A kapott alternatív eredmények közül a program a legjobbat jeleníti meg a lap tetején. Nézzük meg, hogy a két primer olvadáspontja mennyire tér el egymástól, illetve, hogy a megadott baloldali primer megfelelő-e. Az oldalt legörgetve a szoftver kékkel kiemelve jelzi a szekvenciában a bal- és sárgával a jobb primer helyét. További megfelelő primereket  és statisztikát a lap alján találunk.

    4. Ctrl+C billentyűkkel másoljuk ki a jobb primer szekvenciáját (Right Primer 1) a vágólapra. A < Back gombbal menjünk vissza, és menjünk a főablakba (Main). Ctrl+V-vel illesszük be a jobb primer szekvenciáját a jobb primer helyére (Pick right primer or use right primer below (5'->3' on opposite strand)). Ctrl+C-vel másoljuk ki a bal primer szekvenciáját a Ctrl+F-fel előhívott böngésző-keresőablakba, és üssünk entert. Hogy a Leiden-mutációnak megfelelő primerek olvadási hőmérsékletét is megtudjuk, a gén szekvenciában megtalált oligonukleotid első bázisát és a bal primer első bázisát változtassuk G-ről, A-ra és nyomjuk meg a  Pick Primers gombot.

A Primer3Plus szoftver kezelőfelülete

7.22. ábra: A Primer3Plus szoftver kezelőfelülete

Y kromoszóma mikrodeléció

A WHO[24] felmérése szerint a reproduktív korban lévő párok 15-20%-a meddőnek tekinthető, vagyis esetükben két évi próbálkozás után sem jön létre terhesség. A meddőség nem csak a nők betegsége,  az esetek kb. 40-50%-ában a férfi felelős a gyermektelenségért. A kutatók minden ilyen esetben megpróbálják meghatározni a spermium képzés rendellenességének okát. Fiziológiai okok hiányában felmerül a genetikai rendellenesség lehetősége. A nemi kromoszómák számbeli eltérésén kívül, az Y kromoszóma szerkezeti rendellenességei is okozhatják a zavart. Az Y kromoszóma nem  szerkezeti sajátosságából adódóan relatív gyakran fordulnak elő rajta hosszabb-rövidebb DNS szakaszt érintő deléciók. Amennyiben ezek a deléciók az úgynevezett AZF (AZF: Azoospermia[25] Faktor, 7.23. ábra) régiókra esnek, a hímivarsejt képzés zavart szenved. Az AZF régiókat AZFa, AZFb, AZFc és proximális AZFc vagy AZFd-nek nevezik, melyek az Y kromoszóma hosszú karján, a 23. ábrán látható módon helyezkednek el. A spermatogenezisben fontos szerepet játszó géneket (pl. a DAZ = Deleted in Azoospermia gén) tartalmazó a AZF régiók részleges, vagy teljes hiánya következtében a hímivarsejtek termelődése és érése különböző mértékben károsodik. Ugyan az itt található gének pontos szerepe még nem ismert, az infertilis (meddő) férfiak 7-15%-ban, míg az azoospermiás férfiak 70-80%-ban találtak deléciót valamely AZF régióban. Az AZFa régió deléciója esetén a páciensek 75 %-ánál Sertoli cell only szindróma, 25 %-ánál parciális érési gátlás figyelhető meg. Az ilyen betegek nem, vagy csak csökkent mértékben képesek egészséges spermiumokat létrehozni. Az AZFb és AZFc régiók deléciója esetén azoospermia vagy oligozoospermia (csökkent a spermium termelés) figyelhető meg. Az AZFd hiánya esetén az azoospermiától kezdve az abnormális morfológiával társuló normospermiás állapotig számos variáns kialakulhat. A több AZF régiót érintő deléciók súlyosabb tünetekkel járnak.

Az asszisztált reprodukciót igénybevevők betegeknél (vagyis a lombik-bébi programban résztvevőknél) a mutáció átörökíthető. A nem mozaikos Y kromoszóma mikrodeléciót hordozó férfiak fiai a mutációt az esetek 100%-ában öröklik. A párnak ajánlatos genetikai tanácsadáson részt venni. Az Y  mikrodeléciót hordozó apák, valamint a nem tisztázott okok miatt infertilis apák fiait is vizsgálni kell.

Az Y kromoszóma mikrodeléciói

7.23. ábra: Az Y kromoszóma mikrodeléciói



[20] Az eredeti kép forrása: NCBI, Coffee Break könyv Mutations and blood clots fejezete.

[21] Ha  a szülők egyike heterozigóta, akkor az utódok 50%-a heterozigóta. Ha a szülők egyike homozigóta, akkor az utódok 100%-a heterozigóta. Ha a szülők mindegyike heterozigóta, akkor 25% az esély, hogy a Leiden allélra homozigóta, 50%, hogy heterozigóta és 25%, hogy vad típusú homozigóta lesz az utód.

[22] Az enzim a Moraxella nonliquefaciens baktériumból származik.

[23] Korábban a cDNS könyvtárt (pl. májból) izolált mRNS-ből készítették reverz transzkripcióval. Ehhez az mRNS-en lévő poliA szignált használták. Az oligo dT primer hozzákapcsolódik a poliA farokhoz. Ezt a részt (kettős szálú szakasz (mRNS és oligo dT)) felismeri a reverz transzkriptáz és másol egy DNS szálat, amiből a cDNS lesz. De az enzim nem biztos, hogy elér az mRNS "elejére" (5' végéhez), mert lehet, hogy nincs elég ideje. Emiatt a cDNS 5' vége bizonytalan. Az a cDNS (mRNS), amivel eredetileg kiszámolták a Leiden-mutáció helyét nem tartalmazta a valódi mRNS elejét. Ez volt az eredeti NCBI GenBank rekord, melynek az elejétől számolva a mutáció az 1691. pozícióban volt. Később, a Humán Genom Program (és az mRNS-ek alaposabb vizsgálata) miatt kiderült, hogy az igazi mRNS 56 nukleotiddal hosszabb, mint az első idevágó GenBank rekord. A helyes változat (amelyiket most már a genom program és más kísérletek is megerősítettek) esetében a mutáció az 1746-os pozícióban van.

[24] World Health Organization

[25] Azoospermia: a spermium termelés hiánya.