Y kromoszóma mikrodeléció kimutatása

Az Y kromoszóma mikrodeléció vizsgálatát minden azoospermiás beteg esetében, valamint a férfi infertilitása miatt in vitro fertilizációra jelentkező párok férfi tagjánál ajánlott elvégezni. A vizsgálat során szájnyálkahártyából vett mintából az AZFa, -b és -c régiók ismert szekvenciájú részeit amplifikálják multiplex PCR módszerrel. Az ismert szekvenciákat több független STS hely jelenti. Az STS-ek jelenléte vagy hiánya egyértelműen bizonyítja a vizsgált régió épségét vagy delécióját. A PCR eredmény alapján megállapítható, hogy van-e olyan Y kromoszóma mikrodeléció, mely a meddőséget megmagyarázza, illetve ha van, akkor melyik AZF régiót érinti. Vagyis, ha az amplifikáció sikertelen, igazolható az adott régiót érintő mikrodeléció. Attól függően, hogy a deléció milyen terjedelmű, és melyik AZF régióra esik, a hímivarsejtképződés különböző mértékben lehet károsodott, s ennek megfelelően különféle megoldások léteznek arra, hogy a meddőséget orvosolják. Ha deléció kimutatható, elkerülhetők a felesleges műtéti beavatkozások, gyógyszeres kezelések.

A multiplex PCR reakciót úgy tervezzük meg, hogy azzal kimutatható legyen az AZFa, -b és -c régó, az SRY (tesztisz meghatározó faktor) és a ZFX (Zink Finger protein) gén.  Az AZF régiókban a következő STS-eket vizsgálhatjuk: AZFa: SY84, SY86; AZFb: SY127, SY134; AZFc: SY254, SY255 (mindkettő a DAZ, Deleted in Azoospermia génben van). Ezen STS markerekkel, multiplex PCR segítségével a 3 régió valamelyikére szűkíthető a deléció és további STS markerek használhatók a régión belüli deléció térképezéséhez. Minden STS markerre primert tervezünk (vagy készen vesszük). Az SRY gén a három AZF régión kívül található, ezt belső DNS kontrollként alkalmazzuk, amely azt igazolja, hogy egyáltalán volt Y kromoszóma a mintában. A ZFX egy az X kromoszómára jellemző gén. Pozitív külső kontrollnak egy fertilis férfi DNS-ét analizáljuk. Negatív kontrollként pedig egy nő DNS-ét (melyen biztosan megtalálható a ZFX régió), illetve egy DNS nélküli mintát használunk. Egy minta akkor tekinthető pozitívnak egy adott STS-re nézve, ha a PCR termék – a rá jellemző méretnek megfelelő helyen – jelen van az agaróz gélen (7.24. ábra, 1. táblázat).

Y kromoszóma mikrodeléció két multiplex PCR vizsgálati eredményei

7.24. ábra: Y kromoszóma mikrodeléció két multiplex PCR vizsgálati eredményei: Minták: 1.: méret marker; 2.: víz; 3.: nő; 4.: egészséges férfi; 5.: férfi, hiányzó AZFb régióval; 6.: férfi, hiányzó AZFc régióval.[26] További magyarázatot lásd az 1. táblázatban.

1. táblázat: Magyarázat a 24. ábrához

Ábra

Régió

STS

hossz (NT)

I. a, II. a

ZFX

4

495

I. b, II. b

SRY

GDB: 309125

472

I. c

AZFc

sY254

400

I d

AZFa

sY84

320

I. e

AZFb

sY127

274

II. f

AZFa

sY86

326

II. g

AZFb

sY134

301

II. h

AZFc

sY255

126



[26] Az eredeti ábra forrása: Simoni M, Bakker E, Eurlings MC, Matthijs G, Moro E, Müller CR & Vogt PH (1999) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. Int. J. Androl.22: 292–299.