1. fejezet - A géntechnológia történetének mérföldkövei

Tartalom

1.1. Az örökítőanyag felfedezésétől a genetikai kód megfejtéséig
1.1.1. A DNS felfedezése és a kólibaktérium leírása
1.1.2. A DNS örökítőanyag szerepének tisztázása
1.1.3. A DNS kettőshélix felfedezése, a genetikai kód megfejtése
1.2. A DNS „manipulálására” alkalmas enzimek felfedezése
1.3. A rekombináns DNS technika megjelenése
1.4. Hibridizáción alapuló technikák megjelenése
1.5. A szekvenálástól a genom korszakig és tovább
1.5.1. A polimeráz láncreakció felfedezése
1.5.2. Géntechnológiai eljárások magasabbrendű szervezetekben
1.6. További olvasnivaló a fejezethez

A géntechnológia születését megelőzte a DNS szerepének és szerkezetének megismerése, az öröklődés molekuláris mechanizmusainak feltárása. Ezért az alábbi történeti áttekintést a DNS felfedezésénél kezdjük, s a nukleinsav biokémia mérföldköveinek (és a kulcs kísérletek) felvázolásán át jutunk el azoknak a módszereknek a leírásáig, amelyek lehetővé tették az első rekombináns DNS létrehozását. Áttekintjük a technológia fejlődését jelző fő módszertani újításokat, azt a fejlődést, ami az egyes gének vizsgálatától elvezetett a genom projektekig és a nagy áteresztőképességű módszerek megjelenéséig.

1.1. Az örökítőanyag felfedezésétől a genetikai kód megfejtéséig

1.1.1. A DNS felfedezése és a kólibaktérium leírása

A géntechnológia kialakulásához, a rekombináns DNS technikák megjelenéséhez vezető úton az első fontos lépést Friedrich Miescher (1844-1895) tette meg 1869-ben a DNS felfedezésével. Miescher a leukociták kémiai összetételét vizsgálta. A sejtmagokból egy savban oldhatatlan, viszont lúgban oldódó, magas foszfor tartalommal jellemezhető anyagot sikerült elkülönítenie, ami a fehérjékkel ellentétben hőkezelés hatására nem csapódott ki az oldatból. Később ugyanezt az anyagot sikerült izolálnia úgy is, hogy pepszines kezeléssel lebontotta a mintában található fehérjéket. A fehérjéktől eltérő összetétel és viselkedés, valamint a proteáz kezeléssel szembeni rezisztencia arra mutattak, hogy Miescher egy új, korábban ismeretlen anyagot talált. Ezt a sejtmagokra jellemző anyagot „nukleinnek” nevezte el.

1.1. ábra: Friedrich Miescher

Theodor Escherich (1857-1911), német gyermekorvos és mikrobiológus a bélrendszer baktériumflóráját vizsgálva számos addig ismeretlen baktériumot azonosított, közöttük egy Gram-negatív, fakultatív anaerob baktériumot, melynek a „Bacterium coli commune” nevet adta. Eredményeit 1886-ban publikálta. A halála után Escherichia coli nevet kapott baktérium napjainkra a géntechnológiai kutatások és a géntechnológiai ipar egyik legfontosabb eszközévé vált, melyben könnyű tenyészthetősége, gyors osztódása (ideális körülmények között 20 percenként osztódik), egyszerű genetikai manipulálhatósága játszottak szerepet.

1.2. ábra: Theodor Escherich arcképe és az Escherichia coli elektronmikroszkópos képe (mérete 2 x 0,5 mm)

1.1.2. A DNS örökítőanyag szerepének tisztázása

Frederick Griffith (1879-1941) brit bakteriológus, a tüdőgyulladást (pneumonia) okozó Streptococcus pneumoniae baktériumot vizsgálva 1928-ban felfedezte a transzformáció jelenségét. A baktérium két törzsét használta fel kísérletei során, melyeket a telepek morfológiája alapján tudott elkülöníteni: a „sima” törzs (S: smooth) és a „durva” törzs (R:, rough). Az S-törzs képes tüdőgyulladást okozni, míg az R-törzs nem. Egerekbe injektálva a baktériumokat az S-törzs esetén a kialakuló tüdőgyulladás az egér pusztulását okozza, míg az R-törzs esetén az egér túlél. Amikor Griffith hőkezeléssel elpusztította az S-törzsbe tartozó baktériumokat, majd egerekbe injektálta az így nyert anyagot, az egerek nem betegedtek meg. Ha azonban az elpusztított S-törzshöz élő R-törzsbe tartozó baktériumokat kevert, az egér megbetegedett és elpusztult, annak ellenére, hogy önmagában az R-törzs és az elölt S-törzs is ártalmatlannak bizonyult a korábbi kísérletekben. Az elpusztult egerek szervezetében mindkét törzs jelenlétét ki tudta mutatni. Az elpusztított baktériumokból kikerülő anyagok tehát „átalakították” valamilyen módon az ártalmatlan R-törzsbe tartozó baktériumokat, vagyis a fertőzés képessége átadódott. Griffith a jelenséget „transzformációnak” nevezte el.

(Ma már tudjuk, hogy az S-törzsbe tartozó baktériumok rendelkeznek egy poliszacharid burokkal, mely védelmet biztosít a gazdaszervezet immunrendszere ellen. Az R-törzs esetén ez hiányzik. A fertőzés képessége, vagyis a poliszacharid burok létrehozásához szükséges genetikai információ, a hőkezelés során épségben megmaradt, majd az R-törzs baktériumai által a külvilágból felvett DNS molekulák közvetítésével jutott át a korábban fertőzni nem képes sejtekbe.)

1.3. ábra: Frederick Griffith és Griffith transzformációs kísérlete (GNU Free Documentation License, szerző: Madeleine Price Ball)

A transzformációért felelős, vagyis a genetikai információt hordozó anyag kémiai természetének azonosítása Oswald Avery (1877-1955), Colin MacLeod (1909-1972) és Maclyn McCarty (1911-2005) munkájának köszönhető. Az 1944-ben publikált kísérletben Griffith kutatásaihoz hasonlóan ők is a Pneumococcus baktérium R- és S-törzseit használták. Az S-törzsből sikerült izolálniuk a transzformációért felelős anyagot. Különböző kémiai módszerekkel vizsgálva a preparátumot kimutatták, hogy az nagy valószínűséggel DNS-ből áll, és nem tartalmaz fehérjéket. (Akkoriban a fehérjéket tartották a genetikai információ hordozójának.) Ezt követően különböző enzim preparátumokkal kezelték az anyagot (pl. proteáz, RN-áz, DN-áz). Transzformációt csak akkor nem tapasztaltak, ha a preparátumnak DN-áz aktivitása volt. Egyéb enzimek viszont nem gátolták transzformációt.

1.4. ábra: Oswald Avery

Avery és munkatársai eredményeit akkoriban a tudományos közvélemény egy része kritikusan fogadta, mivel logikusabbnak tűnt a 20 féle aminosavból álló fehérjékről feltételezni, hogy örökítőanyagként funkcionálnak. A perdöntő kísérletet 1952-ben Alfred Hershey (1908-1997) és Martha Chase (1927-2003) hajtották végre, akik T2 bakteriofággal kísérleteztek. A fágrészecskékről ismert volt, hogy fehérje burokkal rendelkeznek, melynek belsejében DNS található. Kihasználva, hogy a fehérjealkotó aminosavak a DNS-sel ellentétben tartalmaznak ként, viszont nem tartalmaznak foszfort, Hershey és Chase szelektíven jelölhette radioaktív kén (35S) és foszfor (32P) izotópok felhasználásával a fehérjeburkot és a DNS-t. Ehhez olyan baktériumokon szaporították a fágokat, melyek vagy 35S, vagy 32P tartalmú táptalajon növekedtek. Az ilyen módon jelölt fágrészecskékkel azután olyan baktériumokat fertőztek, melyek jelöletlen táptalajon növekedtek. A 35S izotóp nagyrészt a baktériumsejteken kívül maradt, míg a 32P a sejtek belsejébe került, vagyis fertőzéskor a fág DNS bejutott a sejtekbe, míg a fehérjeburok elemei nem. Ráadásul a fertőzés után újonnan képződő fágrészecskék a 32P-t „megörökölték” a szülői generációtól, míg a 35S-t nem.

Eredményeik elismeréseképpen Hershey (Max Delbrück-kel és Salvador Luria-val megosztva, akik szintén bakteriofágokkal végzett kísérleteikben a replikáció és a mutáció problémakörét vizsgálták) 1969-ben fiziológiai és orvostudományi Nobel-díjat kapott.

1.5. ábra: Alfred Hershey és Martha Chase

1.1.3. A DNS kettőshélix felfedezése, a genetikai kód megfejtése

A géntechnológia szempontjából kulcsfontosságú esemény volt a DNS szerkezetének felfedezése, amely James D. Watson (1928-) és Francis H. C. Crick (1916 2004) nevéhez fűződik. Watson és Crick a DNS kettőshélix modelljét Maurice Wilkins (1916-2004) és Rosalind Franklin (1920-1958) röntgendiffrakciós adatai alapján állította fel 1953-ban. A modell helyesen feltételezte, hogy a DNS két, egymással ellentétes irányba futó szálat tartalmaz. Az Erwin Chargaff (1905-2002) által megfigyelt szabályok alapján (az adenin és a timin, továbbá a citozin és a guanin aránya megegyezik a DNS-ben) helyesen feltételezték azt is, hogy a szálak közötti kapcsolatot a bázisok között specifikus módon kialakuló hidrogén-kötések jelentik. Watson és Crick modellje rávilágított a DNS megkettőződésének mechanizmusára is: mivel bármelyik szál bázissorrendje egyértelműen meghatározza a másik szál bázissorrendjét, a két szál elválasztásával nem vész el információ. Az elválasztott szálak mintaként (templátként) szolgálhatnak új, komplementer szálak szintéziséhez. Így két új kettőshélixhez jutunk, melyeknek csak az egyik szála újonnan szintetizált. Ezt a mechanizmust szemikonzervatív replikációnak nevezzük.

Watson, Crick és Wilkins 1962-ben fiziológiai és orvostudományi Nobel-díjat kapott a DNS szerkezetének felfedezéséért. Rosalind Franklin, akinek a hozzájárulása az eredményekhez szintén kulcsfontosságú volt, sajnos nem részesülhetett ebben az elismerésben, ugyanis négy évvel korábban, 1958-ban elhunyt.

Watson és Crick arcképe, valamint a DNS kettőshélix modellje

1.6. ábra: A. James Watson (balra fent), Francis Crick (balra lent); Watson, Crick és a DNS kettőshélix modellje (jobbra fent); A Rosalind Franklin által készített DNS szál-diffrakciós felvétel, mely az egyik kulcsfontosságú bizonyíték volt a modell helyességét illetően (jobbra lent).

A DNS szerkezetének megismerésével azonban még mindig nyitva maradt egy nagyon fontos kérdés: milyen módon hasznosul a DNS molekulában tárolt genetikai információ a sejtekben, vagyis hogyan képes a DNS a fehérjeláncok szintézisét kódolni? Marshall Nirenberg (1927-2010) volt az első, aki sikereket ért el a genetikai kód megfejtése terén. Kísérleteihez E. coli sejtek citoplazmáját használta fel, melyben jelen volt a fehérjeszintézishez szükséges minden komponens. A mintához szintetikus RNS-t (poli-U) és a 20 fehérjealkotó aminosav közül egyet-egyet radioaktívan jelölve adott. Megfigyelte, hogy poli-U templát esetén csak a fenilalanin épül be a fehérjeláncba. További szintetikus RNS molekulákkal is elvégezte a kísérletet; ekkor más-más aminosavak épültek be. Har Gobind Khorana (1922-2011) rövid oligonukleotidok szintézisét kombinálta enzimatikus módszerekkel, így képes volt előállítani olyan RNS polimereket, melyekben kettő, három, illetve négy nukleotid egység ismétlődött. Ezeket – Nirenberg kísérleteihez hasonlóan – sejtmentes expressziós rendszerben tesztelte. Két nukleotid szabályos ismétlődése esetén a polipeptidláncba két féle aminosav épült be, szabályosan váltakozva. Három nukleotid esetén egyetlen aminosavból álló szabályos polimer jelent meg. Négy bázis szabályos ismétlődése négy aminosav szabályosan ismétlődő polimerét eredményezte. Mindez igazolta, hogy a genetikai kódban egy aminosavat három bázis definiál, továbbá, hogy a bázishármasok nem fednek át.

Nirenberg, Khorana és Holley (az utóbbi a tRNS-t fedezte fel) 1968-ban a genetikai kód megfejtéséért megkapta a Nobel-díjat.