1.2. A DNS „manipulálására” alkalmas enzimek felfedezése

Az örökítőanyag kémiai természetének, szerkezetének megismerése, valamint a genetikai kód megfejtése mellett a géntechnológia kialakulásához szükséges volt a DNS „manipulálására” alkalmas enzimek felfedezése is. Az egyik legfontosabb enzim a DNS szintéziséért felelős DNS-polimeráz, amit Arthur Kornberg (1918-2007) fedezett fel 1957-ben. Kornberg munkásságát 1959-ben Nobel-díjjal jutalmazták (Severo Ochoa-val megosztva, aki először bizonyította, hogy kémcsőben RNS-t is lehet szintetizálni)

1.7. ábra: Arthur Kornberg

Werner Arber (1929-) a bakteriális restrikciós-modifikációs rendszer vizsgálatával 1962-ben olyan enzimeket fedezett fel, melyek nélkül a rekombináns DNS technológia nem jöhetett volna létre. Arber a bakteriofágok gazdasejt specifitásának okait vizsgálta. Megfigyelte, hogy az E. coli K12 törzsben felszaporított bakteriofágok alacsony hatásfokkal fertőznek egy másik törzset, az E. coli B-t, és fordítva: a B törzsben-ben szaporított fágok rossz hatékonysággal fertőznek meg a K12-es törzset. Ha viszont megtörténik a keresztfertőzés az újonnan termelt fágok már jól szaporodnak az új gazdasejtben és alacsony hatásfokkal fertőzik az eredeti gazdasejtet, amiben korábban jól szaporodtak. Arber felfedezte, hogy a jelenség hátterében a DNS metilációja (modifikáció), és endonukleázok általi, metilációtól függő hasítása áll.

A restrikciós-modifikációs rendszernek tehát két eleme van: egy restrikciós endonukleáz és egy annak megfelelő, DNS-metiláz enzim. A restrikciós endonukleáz specifikusan felismer egy 4-8 bázisnyi DNS szekvenciát és hasítja a DNS mindkét szálát. A módosító metiláz ugyanebben a szekvenciában metilál egy adenint (az aminocsoporton), vagy egy citozint (az 5. szénen vagy az aminocsoporton). A restrikciós endonukleáz nem tudja elhasítani az így módosított szekvenciát. A két enzim együttesen van jelen a sejtben, és jelenlétük törzs-specifikus. A baktérium DNS-e a metiláznak köszönhetően állandóan metilált, tehát védve van a restrikciós endonukleáz működésével szemben. A külvilágból, pl. egy fágból származó DNS – feltéve hogy nem ugyanabból a baktérium törzsből érkezik – nincs metilálva ugyanezeknél a specifikus szekvenciáknál, ezért a restrikciós endonukleázok nagy valószínűséggel elhasítják és így lebomlik.

Az első restrikciós endonukleázt Hamilton Smith (1931-) és Daniel Nathans (1928-1999) izolálta az 1960-as évek végén. Nathans 1972-ben elsőként használta a restrikciós enzimeket genetikai térképezésre. (Az SV40 vírus restrikciós térképezését végezte.) Napjainkra már több ezer restrikciós enzimet ismerünk, melyek több száz különböző szekvencia specifikus elhasítását teszik lehetővé. Arber, Smith és Nathans a restrikciós endonukleázokkal végzett kutatásokért 1978-ban megkapta a Nobel-díjat.

Martin Gellert (1929-) fedezte fel a DNS-ligáz nevű enzimet 1967-ben, amely képes a DNS molekulák végeit foszfodiészter kötésekkel kovalensen összekapcsolni, ezzel megteremtve a lehetőségét a különböző forrásokból származó DNS molekulák egyesítésének, így a rekombináns DNS molekulák előállításának.

1.8. ábra: Werner Arber, Hamilton Smith és Daniel Nathans (HS arcképe: Creative Commons License, szerző: Jane Gitschie; DN arcképének forrása: National Library of Medicine)