2. fejezet - A géntechnológia alapja: molekuláris klónozás

Tartalom

2.1. In vitro rekombináció
2.2. Rekombináns DNS létrehozása
2.3. Molekuláris klónok kialakítása
2.4. További olvasnivaló a fejezethez

A rekombináns DNS technológia („génsebészet”, genetic engineering) eszköztára lehetővé teszi az élőlények egyes tulajdonságait meghatározó gének azonosítását, jellemzését és szabadon történő megváltoztatását. Megismerhetjük akár egy adott élőlény teljes genetikai állományának (genom) információtartalmát is, hiszen napjainkra a DNS szekvenálása rutinszerű feladattá vált. Feltárhatjuk a gének működését szabályozó régiókat. Célzottan, irányított mutációkat hozhatunk létre, sőt, akár teljes géneket is eltávolíthatunk az adott élőlényből, illetve módosított, mutáns géneket vihetünk be kísérleti élőlényekbe (reverz, azaz fordított irányú genetika). Ilyen módon megérthetjük az egyes gének, illetve az általuk kódolt fehérjék működését. A genetikai kód univerzális mivoltát kihasználva lehetséges géneket „átültetni” más organizmusokba, ahol megtörténhet a bevitt szekvencia transzkripciója és transzlációja. Az ilyen organizmusokat felhasználhatjuk arra, hogy a kódolt fehérjét nagy mennyiségben és tisztaságban állítsuk elő (heterológ fehérje expresszió). Ez a lehetőség az alapkutatások mellett (a termelődő fehérje működésének és szerkezetének vizsgálata) a biotechnológiai ipar illetve a gyógyszeripar szempontjából is kulcsfontosságú. Az expresszált fehérjét kódoló szekvenciát módosítva számunkra hasznos változatokat hozhatunk létre az adott fehérjéből. Akár az eredetitől eltérő funkciót, vagy aktivitást is „hozzárendelhetünk” ilyen módon egy fehérjéhez (fehérjemérnökség vagy protein engineering). Arra is lehetőségünk nyílhat, hogy saját sejtjeinkbe juttassunk be új genetikai információt bizonyos betegségek gyógyítása érdekében (génterápia).

Ahhoz, hogy a géntechnológiát ténylegesen alkalmazni lehessen, rekombináns DNS molekulákat kell előállítanunk. A rekombináns DNS egy hordozó DNS molekulából (vektor) és a vizsgálni kívánt DNS-ből (inszert) álló „hibrid” (kiméra) molekula, amelyet a kísérletekhez szükséges mennyiségben molekuláris klónozással állítunk elő.

rekombináns DNS = vektor DNS + inszert DNS

A molekuláris klónozás nem más, mint egy specifikus inszertet tartalmazó rekombináns DNS felszaporítása megfelelő gazdasejtben (E. coli). Ezeknek a sejteknek a klónjaiból (bakteriális kolóniák) izolálhatjuk a molekuláris klón rekombináns DNS-t. Létezik in vitro DNS szaporítási módszer is, a polimeráz láncreakció (PCR), azonban ezzel a módszerrel szigorúan véve nem molekuláris klónokat állítunk elő (ld. 6. fejezet).

2.1. In vitro rekombináció

A történeti összefoglalóból már kiderült, hogy a molekuláris klónozáshoz egyrészt fel kellett fedezni azokat az enzimeket, amelyekkel a DNS molekulát in vitro „szabni-varrni” lehet, másrészt találni kellett olyan DNS molekulákat, amelyeket vektorrá lehet alakítani (a vektorokkal szemben támasztott kritériumokról és a típusaikról részletesen a 7.1. fejezetben lesz szó). Végül az in vitro előállított rekombináns DNS-t egy gazdasejtbe kell juttatnunk (ld. 4.3. fejezet) és valamilyen úton-módon ki kell szelektálni azokat a sejteket, amelyekbe az általunk megtervezett rekombináns DNS került be.

A DNS „manipuláció”, a molekuláris klónozás in vitro szakaszának legfőbb eszközei a restrikciós endonukleázok és a DNS-ligáz enzim (a géntechnológiában használatos DNS-módosító enzimekkel részletesen a 3. fejezet foglalkozik).

A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) foszfodiészter kötést hidrolizáló enzimek. A baktériumokat az idegen DNS-ekkel szemben „védelmező” molekuláris rendszer (ld. 1.2. fejezet), a restrikció-modifikáció DNS bontó elemei, amelyek nagy számban és sokféleségben állnak a géntechnológus rendelkezésére. Az enzimek többsége középpontosan szimmetrikus, ún. „palindrom” szekvenciákat ismer fel. Amennyiben a DNS két szálának elhasítása egymással szemközti foszfodiészter-kötéseknél történik, úgynevezett tompa végek (blunt end) keletkeznek (pl. DraI, ld. 2.2. ábra). Ha azonban egymáshoz képest elcsúsztatva, néhány bázissal távolabb a felismerőhely szimmetriatengelyétől, úgy ragadós végek (sticky end) jönnek létre (pl. EcoRI, ld. 2.1. ábra). A DNS-ligáz enzim foszfodiészter kötés létrehozásával képes két DNS molekulát, vagy egy molekula két végét kovalensen összekapcsolni. Ha két különböző eredetű DNS molekulát EcoRI enzimmel hasítunk, majd összekeverünk, akkor a DNS-ligázin vitro rekombinációval létrehozhat hibrid, azaz rekombináns DNS molekulákat, mint azt a 2.1. ábra szemlélteti. A restrikciós endonukleázokkal részletesen a 3.2.1. fejezet foglalkozik.

In vitro rekombináció

2.1. ábra: In vitro rekombináció. Két különböző eredetű DNS hasítása EcoRI restrikciós endonukleázzal. A létrejövő DNS fragmentumok egymást felismerő ragadós végekkel rendelkeznek. Összekapcsolásuk DNS-ligáz segítségével történik. Amennyiben a két különböző eredetű DNS-vég kapcsolódik össze, in vitro rekombináció történik. Megjegyzendő, hogy egy DNS molekula két végén található ragadós végeket is összekapcsolhatja a DNS-ligáz. Ebben az esetben nem jön létre rekombináció, hanem pl. ha egy linearizált vektor DNS-ről van szó, az cirkularizálódik. Az ún. vektor „önzáródás” kiküszöbölhető, ha a hasított DNS 5’-végéről a foszfát-csoportokat foszfatáz enzimmel eltávolítjuk (ld. 3.4.2. fejezet)