2.2. Rekombináns DNS létrehozása

A molekuláris klónozás in vitro szakaszában alakítjuk ki a rekombináns DNS-t. A hordozó DNS leggyakrabban egy cirkuláris plazmid vektor (a plazmidok extrakromoszomális elemek, a baktériumsejtekben önállóan replikálódó ún. replikonok, ld. 7.2. fejezet), míg a vizsgálandó DNS lehet egy eukarióta kromoszóma. Példaként egy olyan klónozási stratégiát mutatunk be, ahol az inszertet a kromoszómából két különböző restrikciós enzimmel hasítjuk ki. Ha a vektor DNS-t ugyanazon két restrikciós endonukleázzal hasítjuk és a tisztított hasítási termékeket összekeverjük, a DNS-ligáz a kémcsőben lezajló reakció során gyakorlatilag csak ezt a kétféle eredetű DNS-t képes egymáshoz kapcsolni, ezáltal rekombináns DNS jön létre, mint azt a 2.2. ábra mutatja. Ez a direkcionális vagy irányított klónozás, amit részletesen a 4.2. fejezetben ismertetünk.

Rekombináns DNS létrehozása

2.2. ábra: Rekombináns DNS létrehozása irányított klónozással. A plazmid vektort és a kromoszomális DNS-t is ugyanazzal a kétféle restrikciós enzimmel hasítjuk. Az egyik végén "ragadós" (EcoRI), a másik végén "tompa" végű (DraI) DNS molekulákat a DNS-ligáz kovalens összekapcsolja, ezzel létrejön a rekombináns DNS.