2.3. Molekuláris klónok kialakítása

A DNS klónozás in vivo szakasza a rekombináns DNS gazdasejtbe juttatása és felszaporítása. A DNS sejtekbe juttatására többek között a bakteriális transzformáció jelenségét lehet kihasználni (további génbeviteli eljárások leírása a 4.3. fejezetben olvasható). Egy baktérium sejt általában csak egyetlen rekombináns DNS-t vesz fel. Mivel a transzformáció hatásfoka alacsony, szükségünk van valamilyen szelekciós eljárása. A vektor tartalmaz egy antibiotikum elleni védelmet biztosító gént (antibiotikum rezisztencia gén), amely megfelelően választott körülmények között szelektív túlélést tesz lehetővé a rekombináns DNS-t hordozó sejtek számára. A transzformálás után a sejteket olyan, antibiotikumot tartalmazó, szelektáló táptalajra helyezzük, ahol csak a rekombináns plazmidot (és így az adott antibiotikumra rezisztenciát biztosító gént) tartalmazó sejtek képesek szaporodni. Minden sejtből egy kolónia keletkezik (amely genetikailag azonos sejtekből, klónokból áll). Sok ezer ilyen, a kromoszóma különböző darabját tartalmazó kolónia együttesen egy genomiális könyvtárat reprezentál (ld. 8.2. fejezet). Egy-egy kolónián belül azonos rekombináns DNS-t tartalmazó sejtek vannak, melyeket tovább lehet szaporítani, és a klónozott DNS-t izolálni lehet. A folyamat sémáját a 2.3. ábra mutatja be.

A molekuláris klónozás elvi vázlata

2.3. ábra: A molekuláris klónozás elvi vázlata. A rekombináns DNS-t transzformációval juttatjuk az E. coli gazdasejtbe, ahol az a baktériumsejt kromoszómájától (amit nem ábrázoltunk) függetlenül replikálódik és több kópiában lesz jelen az utódsejtekben, ezzel is hozzájárulva a DNS klón felszaporításához (amplifikáció). A különböző inszerteket tartalmazó baktériumok egyedi klónok. A kromoszóma egészét darabokban tartalmazó E.coli klónok összessége a genomiális könyvtár (ld. 8.2. fejezet). A rekombináns DNS a sejtekből tiszta formában egyszerűen kinyerhető (ld. 4.1.1. fejezet).