3. fejezet - DNS módosító enzimek és felhasználásuk

Tartalom

3.1. DNS-polimerázok
3.1.1. A DNS-polimeráz I és a Klenow-fragmentum
3.1.2. T4 DNS-polimeráz
3.1.3. T7 DNS-polimeráz
3.1.4. Hőstabil DNS-polimerázok
3.1.5. Reverz transzkriptáz
3.2. Nukleázok
3.2.1. Restrikciós endonukleázok
3.2.2. Egyéb nukleázok
3.3. DNS-ligázok
3.4. Végmódosító enzimek
3.4.1. Terminális transzferáz
3.4.2. Alkalikus foszfatáz
3.4.3. T4 polinukleotid-kináz
3.5. További olvasnivaló a fejezethez

A manapság rutinszerűen alkalmazott biotechnológiai és molekuláris biológiai eljárások jelentős része a DNS módosítását célozza. Ezeknek a módszereknek a kialakítása az 1970-es években kezdődött, amikor a kutatók elkezdték a DNS manipulálására szolgáló enzimeket tisztított formában előállítani és vizsgálni. Később ezeket az enzimeket, amelyek a természetben a rekombináció, replikáció és hibajavítás folyamataiban vesznek részt, sikeresen használták a DNS molekuláról történő másolatok készítésére, a DNS szétvágására vagy éppen összeragasztására. A módszerek fejlesztése lehetővé tette, hogy megszülessen a rekombináns DNS technológia, vagyis különböző DNS szakaszok „újrakombinálására“, összeépítésére nyílt lehetőség plazmidok és más eredetű DNS fragmentumok (pl. kromoszómák darabjainak) felhasználásával. Mindez megteremtette a DNS klónozásának lehetőségét is (ld. 2. és 4.2. fejezet). Ehhez elegendő egy gént vagy más DNS fragmentumot plazmidba vagy egyéb hordozóba (vektor) építeni, majd megfelelő gazdaszervezetbe juttatni, és ott a rekombináns DNS replikálódni képes.

A DNS módosítására szolgáló enzimeknek négy nagy csoportját különböztethetjük meg.

3.1. DNS-polimerázok

Számtalan molekuláris biológiai módszerhez elengedhetetlen a DNS-polimerázok alkalmazása, gondoljunk akár csak a PCR-re (Polymerase Chain Reaction; ld. 6 . fejezet) vagy a DNS szekvenálásra (ld. 5. fejezet). Általánosságban DNS-polimeráznak nevezzük azokat az enzimeket, amelyek képesek DNS szintézisére dezoxiribonukleozid-trifoszfát (dNTP) építőkövek (aktivált monomerek) felhasználásával. Ezen belül megkülönböztethetjük a templát-függő DNS-polimerázokat, amelyek egy „minta“, templát DNS vagy RNS alapján, annak másolatát készítik el, valamint léteznek templát-független DNS-polimerázok is (ilyen enzim pl. a terminális dezoxinukleotid-transzferáz).

A DNS-polimerázok multifunkciós enzimek, amelyek a szintézis mellett képesek a DNS láncvégeinek hidrolízisére is. Míg a szintézis szigorúan egy irányban, az 5-végtől a 3’-vég irányában zajlik, a lebontás a lánc mindkét vége felől megvalósulhat, az adott polimeráz aktivitásától függően. Az egyszerűbb tárgyalhatóság érdekében érdemes megismerkedni a DNS molekula kapcsán a direkcionalitás fogalmával.

A molekuláris biológiában direkcionalitásnak, vagy egyszerűen iránynak nevezzük az egyszálú nukleinsavak hosszanti kémiai orientációját (a DNS, RNS, a fehérjeláncok direkcionális polimerek). A DNS szál végeinek elnevezése a nukleotidok cukorgyűrűjének konvencionális számozásából ered (ld. 3.1. ábra), ily módon egyértelműen meghatározható a szál 5’- (ejtsd: öt-vessző) és 3’- (három-vessző) vége. Amennyiben egy hosszú DNS szakasz régióit szeretnénk megkülönböztetni, beszélhetünk „upstream“ (felfelé irányuló) szakaszokról, amelyek az 5’-véghez esnek közelebb, illetve „downstream“ (lefelé irányuló) szakaszokról a 3’-véghez közelebb. A templát-függő DNS-polimerázok azon tulajdonsága, hogy új foszfodiészter kötés kialakítására csak a 3’-hidroxil csoporttal képesek, meghatározza a szintézis 5’→3’ irányát.

A DNS irányultsága

3.1. ábra: A DNS molekula irányultsága, 5’- és 3’-vége. A) A guanin nukleotid a dezoxiribóz gyűrű számozásával, aminek alapján meghatározható a DNS lánc 5’- és 3’-vége. B) A DNS molekula kémiai szerkezete, külön jelölve a DNS felépítésében résztvevő dezoxiribonukleotidokat (részlet).

A lánc bontása kapcsán kétféle aktivitást különböztethetünk meg, amelyekkel külön-külön vagy együtt szintén mindegyik DNS-polimeráz rendelkezik.

  • 3’→5’-exonukleáz aktivitás: Az irány megjelölés arra utal, hogy az enzim a DNS szálon visszafelé haladva képes a már szintetizált nukleotidot eltávolítani. A polimeráz ezen tulajdonságát „proofreading“ vagy hibajavító aktivitásnak is nevezzük, mert ez biztosítja, hogy egy esetlegesen rosszul, nem a bázispárosodás szabályainak megfelelő nukleotid beépülés javítása megtörténjen.

  • 5’→3’-exonukleáz aktivitás: Kevesebb polimeráz rendelkezik ezzel az aktivitással, aminek során az enzim képes a láncon előre haladva az esetleg már ott található, a templáttal komplementer DNS szálat elbontani (ezt a „hasadás-elmozdulás“ kettős aktivitást nevezi a szakirodalom „nick transzláció“-nak, ld. 3.3. ábra). A természetben a DNS replikációja során van szükség erre a funkcióra.

A templát függő DNS-polimerázok működésének fontos jellemzője, hogy de novo szintézisre nem képesek. Új DNS szál szintéziséhez szükséges egy rövid kétszálú szakasz, és így az új szál szintézise egy már meglevő 3’-végről indulhat. A természetben az új szál szintézise mindig egy rövid RNS szakasszal, a primerrel indul. A biotechnológiai gyakorlatban primerként általában egy rövid szintetikus oligo-dezoxiribonukleotid (röviden oligonukleotid) molekulát használnak, ami a templát DNS-hez kapcsolódva biztosítja a szükséges kétszálú szakaszt (ld. 3.2. ábra). Ennek nagyon fontos gyakorlati jelentősége, hogy így a DNS polimerizáció kezdőpontja beállítható, vagyis bármilyen, hosszabb DNS szál szintetizálható a megfelelő helyre tervezett primer segítségével. (Mindez természetesen nem lenne lehetséges, ha a DNS polimerizáció véletlenszerű helyről indulna.)

A primerek jelentősége

3.2. ábra: A primerek jelentősége. A) A templát-függő DNS-polimerázok működéséhez kétszálú DNS-re van szükség, ami a templáttal komplementer rövid oligonukleotid, primer hozzáadásával biztosítható. B) A primer a bázissorrendjének megfelelő komplementer szakaszhoz hibridizálódik, ezzel meghatározva a DNS szintézis kezdőpontját.

3.1.1. A DNS-polimeráz I és a Klenow-fragmentum

A legkorábban felfedezett DNS-polimeráz, amelyet eredetileg Escherichia coli baktériumból izolált Arthur Kornberg, de minden prokariótában megtalálható. Fontos szerepe van a bakteriális genom replikációjában, eltávolítja az RNS primert a követő szálról és az Okazaki-fragmentumok összekötését végzi (ld. A biokémia és molekuláris biológia alapjai elméleti e-jegyzet ).

Négyféle enzimatikus aktivitással rendelkezik:

  • 5’→3’ DNS-függő DNS-polimeráz aktivitás

  • 3’→5’ exonukleáz aktivitás (proofreading aktivitás)

  • 5’→3’ exonukleáz aktivitás (RNS primer eltávolítása és kivágásos hibajavítás)

  • 5’→3’ RNS-függő DNS-polimeráz aktivitás (valószínűleg nincs biológiai jelentősége)

A molekuláris biológiai gyakorlatban a natív enzim hasadás-elmozdulás, angolul „nick-translation“ képességét használják ki (ld. 3.3. ábra). A természetben az RNS primerek eltávolítására és DNS-re cserélésre szolgál a folyamat. A laboratóriumban a kétszálú DNS-en mesterségesen, DN-áz kezeléssel „nick“-eket, bevágásokat ejtenek, majd a DNS-polimeráz I 5’→3’ exonukleáz és 5’→3’ polimeráz aktivitását kihasználva, a hasadástól indulva a DNS egy szakaszát kicserélik. Ennek során lehetőség van például radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt nukleotid analógok DNS láncba építésére.

Míg a fenti példában az enzim 5’→3’ exonukleáz aktivitását lehet kihasználni, azoknál az alkalmazásoknál, ahol kizárólag a polimeráz aktivitásra lenne szükség (mint például a szekvenálás), nem szerencsés, hogy az enzim képes az újonnan szintetizált DNS láncot lebontani. Az enzim további vizsgálatakor kiderült, hogy proteolitikus hasítása két fragmentumot (76 kDa és 36 kDa) eredményez, amelyek közül az egyik, a felfedezőjéről Klenow-fragmentumnak nevezett darab rendelkezik mind a polimeráz, mind a proofreading aktivitással, de hiányzik belőle az 5’→3’ exonukleáz aktivitás. A Klenow-fragmentumot manapság rekombináns módon, E. coli sejtekben termelik. A Klenow-fragmentum felhasználható a Sanger-féle didezoxi szekvenálásban (ld. 5. fejezet), valamint restrikciós endonukleázok ragadós végének feltöltésére, illetve 3’-túlnyúló végek lebontására (tompa vagy „blunt-end“ vég kialakítására).

Nick transzláció (hasadás-elmozdulás)

3.3. ábra: Nick transzláció (hasadás-elmozdulás). A DNS-polimeráz I enzim az 5’→3’ irányú polimeráz aktivitás mellett 5’→3’ irányú exonukleáz aktivitással is rendelkezik, és ezek kombinációja teszi lehetővé a hasadás-elmozdulást. A laboratóriumi gyakorlatban jelölt nukleotidok beépítésére használható a jelenség. Elsőként a dezoxiribonukleáz I (DN-áz I) enzimmel kis bevágásokat (nick) ejtenek a DNS szálain. Ezután a DNS-polimeráz I a bevágástól indulva a sorban következő nukleotidokat kivágja, és a reakcióelegyhez adott jelölt nukleotidokat építi be. A reakció eredményeként kapott DNS szálon a nick elmozdul előre felé addig a pontig, ahol a DNS-polimeráz I leválik a DNS láncról. A lánc folytonossága ligálással állítható helyre.

3.1.2. T4 DNS-polimeráz

Kétféle enzimatikus aktivitással rendelkezik:

  • 5’→3’ DNS-függő DNS-polimeráz aktivitás

  • 3’→5’ exonukleáz aktivitás (proofreading aktivitás)

A T4 jelű E. coli bakteriofág genomjából származik. Több, mint 200-szor erősebb 3’→5’ exonukleáz aktivitással rendelkezik, mint a DNS-polimeráz I vagy a Klenow-fragmentum. Tompa vég kialakítására alkalmas, valamint a ligáz-független klónozásban is használják a vektor megfelelő ragadós végeinek kialakítására (ekkor dTTP hozzáadásával biztosítják, hogy a kívánt nukleotidig „vágja vissza“ az enzim a DNS megfelelő szálát) (ld. 4.2.5. fejezet).

3.1.3. T7 DNS-polimeráz

A T7 DNS-polimeráz in vivo a T7 bakteriofág DNS-ének gyors replikációjáért felelős. Az enzim két fehérje, a T7 bakteriofág „5-ös gén“ fehérjetermékének (80 kDa) és az E. coli tioredoxin fehérjéjének (12 kDa) komplexe.

Kétféle enzimatikus aktivitással rendelkezik:

  • 5’→3’ DNS-függő DNS-polimeráz aktivitás

  • 3’→5’ exonukleáz aktivitás (proofreading aktivitás)

A 3’→5’ exonukleáz aktivitása jelentős, körülbelül 1000-szerese a Klenow-fragmentuménak, ami egyben jelzi, hogy nagyon nagy hűségű (high fidelity) enzim, vagyis a DNS szintézis nagy pontossággal zajlik. Kiemelkedően magas az enzim processzivitása is, ami annyit jelent, hogy hosszú ideig a DNS szálon marad, és így képes akár több ezer nukleotid szintézisére. Szekvenálásra ez az enzim, bár magas processzivitása fontos előny, eredeti formájában nem alkalmas, mert a szekvenálás során elkerülendő bármifajta exonukleáz aktivitás, nehogy az enzim kivágja a láncterminációs nukleotidot. Ezért erre a célra az enzim egy módosított, Sequenase néven forgalmazott formáját használják, amelyből teljesen hiányzik az exonukláz aktivitás. A T7 DNS-polimerázt ezen kívül alkalmazzák helyspecifikus mutagenezis módszereknél is (ld. 11. fejezet).

3.1.4. Hőstabil DNS-polimerázok

Bár már viszonylag korán, a 1960-as és 1970-es években izoláltak hőstabil DNS-polimerázokat, igazi jelentőségük a polimeráz láncreakció (PCR) elterjedésével (ld. 6.2.2. fejezet) mutatkozott meg, amihez magas hőmérsékleten is aktív enzimre van szükség.

3.1.4.1. Taq-polimeráz

Eredetileg a Yellowstone Nemzeti Parkban található hőforrásokban élő Thermus aquaticus nevű termofil baktériumból izolálta Thomas D. Brock 1965-ben (a baktérium nevéből származik a polimeráz neve, ugyanazt a logikát követve, mint a restrikciós endonukleázok elnevezése; ld. 3.2.1. ). Kiválóan használható PCR-hez, mert az enzim féléletideje még 95oC-on is 40 perc. Mivel nem rendelkezik 3’→5’ exonukleáz aktivitással, nem tartozik a nagy hűségű polimerázok közé. A hibagyakorisága ~10-4, de a pontos érték erősen függ az adott kísérleti elrendezéstől. 1 kb méretű célszekvenciát ~30 sec alatt másol le. Más, 3’→5’ exonukleáz aktivitás nélküli enzimekhez hasonlóan templát-független dezoxinukleotid-transzferáz aktivitással rendelkezik, aminek következtében (preferáltan) adenin nukleotidokat épít be a DNS 3’-végére. Ezt a tulajdonságát használják ki a TA klónozásnál (ld. 4.2.4. fejezet). A gyakorlatban manapság leginkább rutin PCR-hez, főként kolónia PCR-hez használják, amikor a cél a baktérium kolóniák közül azokat kiválasztani, amelyek egy adott klónt tartalmaznak. Ilyen esetben nem probléma egy-egy mutáció a PCR termékben.

3.1.4.2. Pfu-polimeráz

A hipertermofil Pyrococcus furiosus ősbaktériumból származó DNS-polimeráz. A Taq-polimeráznál jelentősen nagyobb hőstabilitással rendelkezik. Ezen kívül legfontosabb tulajdonsága, hogy rendelkezik proofreading aktivitással, ezért minden olyan alkalmazásra használható, ahol fontos a pontos másolás (átlagosan kb. 350-400 ezer bázispáronként épít be hibás nukleotidot). Valamivel lassabb, mint a Taq-polimeráz, 1-2 perc alatt amplifikál 1 kbp méretű DNS-t 72oC-on. Nagyon sok laboratóriumban a Pfu-t használják elsődleges DNS-polimerázként, mind PCR-hez, mind például helyspecifikus mutagenezishez.

3.1.4.3. Phusion-polimeráz

A Phusion-polimeráz egy proofreading aktivitásúPyrococcus-szerű polimeráz és egy DNS-kötő domén „fúziós“ (innen a név) terméke. Egyesíti magában a Taq- és a Pfu-polimerázok előnyeit. Rendkívül nagy másolási hűségű (fidelity) enzim, több, mint 2 millió bázispáronként épít be hibás nukleotidot. Ezen kívül kifejezetten gyors is, ami jelentősen csökkenti a PCR reakció idejét, valamint a sikeres PCR-hez gyakorlatilag nem szükséges optimalizáció sem. Alkalmas mind rutin, mind komplikált, például hosszú vagy nehéz templátokkal való munkára is. Egyetlen hátránya, hogy az említett polimerázok közül ez a legdrágább.

Néhány további, a PCR-hez használt polimeráz enzimet az 6.2.2. fejezetben ismertetünk.

3.1.5. Reverz transzkriptáz

RNS-függő DNS-polimerázok, amelyek a retorvírusok replikációs ciklusában játszanak szerepet. A retrovírusok genomja RNS-ből áll, amiről DNS másolat készül a gazdaszervezet fertőzése után. A laboratóriumi gyakorlatban reverz transzkriptázok használhatók mRNS molekulákról DNS másolat készítésére. Az így szintetizált, a templát mRNS-el komplementer szálat nevezik cDNS-nek. A cDNS templátként szolgálhat további PCR reakcióhoz. Az mRNS-ből kiinduló, és végül amplifikált DNS terméket eredményező reakciót RT-PCR-nek, reverz transzkripciós PCR-nek hívják (ld. 6.4.4. fejezet). (Az RT-PCR nem összekeverendő a valósidejű, real-time PCR-rel, aminek során a fluoreszcensen jelölt DNS amplifikációjának kvantitatív meghatározása történik.) A reverz transzkriptáz fontos felhasználási területe a cDNS könyvtárak készítése is (ld. 8.3. fejezet).