3.2. Nukleázok

Számos nukleázt használnak rutinszerűen a mindennapos molekuláris biológiai laboratóriumi gyakorlatban. A legtöbb nukleázt két csoportra lehet osztani:

3.2.1. Restrikciós endonukleázok

A restrikciós endonukleázok baktériumokban, archeákban, és egyes vírusokban megtalálható enzimek, és a restrikciós-modifikációs rendszer komponensei (ld. 1.2. fejezet).

A restrikciós endonukleázok (vagy röviden restrikciós enzimek) specifikus helyeket ismernek fel a DNS molekulán, majd a DNS mindkét szálát átvágva képesek azt elhasítani (foszfodiészter kötéseket hidrolizálnak). Elnevezésüknek külön nómenklatúrája van. A HindIII enzim nevének magyarázata, hogy a Haemophilus influenzae baktérium d szerotípusából harmadikként izolálták. Hasonlóképpen képezhető az EcoRI enzim neve is: az Escherichia coliRY13 törzséből elsőként izolálták.

Egy random bázissorrendű DNS-t tekintve a statisztikai hasítási gyakoriság attól függ, hogy milyen hosszú az enzim felismerési szekvenciája. Ha az emésztőenzim felismerő helye 4 bázispárt tartalmaz, akkor, mivel minden egyes bázispár helyén négyféle variáció (A, T, G, C) lehetséges, 44 = 256 bázispáronként számíthatunk hasítóhelyre. Ha a felismerő hely 6 nukleotid hosszúságú, a hasítás valószínűsége 1/4096-ra módosul (46 = 4096). A valóságban a DNS szekvenciája nem véletlenszerű, ezért a hasítóhelyek eloszlása sem teljesen követi a fentieket. Vannak restrikciós endonukleázok, amelyek felismerőhelye megegyezik, de hasítóhelyük különböző, ezeket neoskizomereknek nevezik. Azokat az enzimeket, amelyeknél mind a felismerő, mind a hasítóhely egyforma, izoskizomereknek hívják.

A restrikciós enzimek leggyakoribb felhasználási területe a molekuláris klónozás (ld. 2. és 4.2. fejezetek), valamint a DNS fizikai térképezése (ld. 9.1.1. fejezet) és az ahhoz kapcsolódó területek (pl. diagnosztika, bűnügyi orvosszakértői vizsgálatok). A restrikciós endonukleázokat hagyományosan négy csoportba osztják a felismert szekvencia, a hasítóhely, az alegység kompozíció és a kofaktor szükséglet szerint.

3.2.1.1. I-es típusú restrikciós endonukleázok

Multifunkciós fehérjék restrikciós és metil-transzferáz aktivitással rendelkeznek. Komplex, három alegységből felépülő szerkezetük van, Mg2+ szükséges a működésükhöz, valamint kofaktoruk még az ATP és az S-adenozil-L-metionin (AdoMet) is. Hasítóhelyük a felismerési helytől távol (több ezer bázispárnyira) helyezkedik el. Korábban úgy gondolták, hogy az I-es típusú enzimek ritkák, azonban a teljes genomok vizsgálatából kiderült, hogy valójában nagy számban találhatók meg. Bár a szervezet biokémiai folyamataiban fontos szerepük van, gyakorlati hasznosíthatóságuk kicsi, mert nem szigorúan meghatározott a hasítás pozíciója a felismerő helyhez képest.

3.2.1.2. II-es típusú restrikciós endonukleázok

Változatos szerkezetű enzimek, csak restrikciós funkcióval rendelkeznek (a metiltranszferáz komponenst külön gén kódolja). A működésükhöz Mg2+-ot igényelnek. Hasítóhelyük a felismerő helyben vagy annak közvetlen közelében található. Ebbe a családba tartozik a restrikciós endonukleázok túlnyomó többsége, eddig körülbelül 4000 ilyen típusú enzimet írtak le. A felismerőhely általában 4-8 bázispár hosszúságú, és jellemzően palindrom szekvencia. A palindrom kifejezés azt jelenti, hogy a DNS bázissorrendje előre és hátrafelé olvasva (a két, komplementer láncra vonatkoztatva) ugyanaz. Például a KpnI nevű enzim felismerő helye az 5’-GGTACC-3’ szekvencia. Ennek a komplementer párja 3’→5’ irányban CCATGG, ami visszafelé olvasva éppen GGTACC.

A restrikciós enzimek hasítóhelye eredményezhet ragadós véget vagy tompa véget. Előbbinél a hasítás ereményeként az egyik szálon rövid túlnyúló vég jön létre, például az említett KpnI az ötödik nukleotid után hasít (GGTAC/C), és így ragadós véget eredményez, 3’-túlnyúló véggel (ld. 3.4. ábra). Ezzel szemben a SmaI enzim, amelynek felismerő helye a CCCGGG szekvencia, a harmadik nukleotid után hasítva (CCC/GGG) tompa véget hoz létre. A restrikciós enzimek egyik legismertebbje, az EcoRI a GAATTC szekvenciát ismeri fel és az első nukleotid után hasítja (G/AATTC), ezáltal 5’-túlnyúló vég jön létre (ez a gyakoribb túlnyúló vég típus).

Ragadós és tompa végek

3.4. ábra: Ragadós és tompa végek. A restrikciós enzimek hasításának terméke lehet ragadós végű (sticky end) vagy tompa végű (blunt end) DNS. A) A KpnI enzim ragadós végeket hoz létre, mert a palindrom hasítóhelyet aszimmetrikusan vágja szét. A kapott ragadós végek könnyen ligálhatók. B) A SmaI enzim a hasítóhely közepén vág, ezért nem keletkezik túlnyúló vég.

A II-es típusú enzimek meghatározott helyen hasítják a DNS-t, így az emésztés reprodukálható és a keletkezett termékek szekvenciája pontosan meghatározott lesz. Ma már több ezer ilyen enzimet ismerünk (>3000 enzim, >250 felismerőhellyel 750 baktérium törzsből) és sok száz kapható kereskedelmi forgalomban. A II-es típusú endonukleázok legtöbbje homodimer szerkezetű (ld. 3.5. ábra), amely szerkezeti tulajdonság egyrészt összecseng a felismerőhely szimmetrikus szerkezetével, másrészt a két azonos DNS-kötőhely (bivalencia) erősebb DNS kötődést tesz lehetővé.

Az EcoRI restrikciós enzim térszerkezete

3.5. ábra: Az EcoRI restrikciós enzim térszerkezete. A II-es típusú restrikciós endonukleázok egyik tipikus képviselője az EcoRI enzim. Homodimer szerkezetű, egyenként 31 kDa méretű alegységekből áll. Mindkét alegység tartalmaz egy hurok régiót, amelyek körbeölelik a DNS-t (narancssárga). Az ábrán látható, hogy a DNS aszimmetrikus elhasadása révén ragadós végek jönnek létre. Az enzim kristályosítása mangán-ionok jelenlétében történt (lila gömbök), amelyek a natív enzimben megtalálható magnézium-ionok helyét foglalják el.

Később több alkategóriáját állították fel ennek az enzimcsaládnak, ahová azok az enzimek tartoznak, amelyek jellegzetes tulajdonságaikban különböznek a tipikus II-es típusú endonukleázoktól. A II.M típusú enzimek például képesek metilált DNS felismerésére és elhasítására is. Ilyen a DpnI nevű restrikciós endonukleáz, amelyet helyspecifikus mutagenezisnél használnak a templát DNS elbontására (ld. 11.2.2. fejezet). A II.M típusú enzimek meghatározott helyen hasítják a DNS-t, a DpnI hasítólye például GA/TC. A IV-es típusú restrikciós endonukleázoknak is metilált DNS a szubsztrátja, azonban a II.M típustól eltérően nem specifikus helyen hasítanak.

3.2.1.3. III-as típusú restrikciós endonukleázok

Nagyméretű, két alegységből felépülő fehérjék (hidrolizáló alegység és metiláló alegység). Szintén Mg2+-függő enzimek, kofaktoruk az ATP, az S-adenozil-L-metionin segíti a metil transzfer reakciót, de nem feltétlen szükséges a működésükhöz. Hasítóhelyük a felismerési hely közelében (átlalában 25-27 bázispárnyira) található, nem palindrom. Akárcsak az I-es típusú enzimek, itt is két szekvencia részből áll a felismerő hely, és az enzim képes a DNS szál transzlokációjára. A hasítás az egyik felismerő hely közelében történik.

3.2.1.4. IV-es típusú restrikciós endonukleázok:

Módosított, általában metilált DNS-t ismernek fel és hasítanak, specifitásuk alacsony. Nem a restrikciós-modifikációs rendszer részei.

3.2.2. Egyéb nukleázok

3.2.2.1. S1-nukleáz

Az Aspergillus oryzae gombából származó S1-nukleáz olyan endonukleáz, amelyik egyszálú DNS-t vagy RNS-t képes lebontani. Az enzim ötször aktívabb DNS-en, mint RNS-en. Kétszálú polinukleotid is lehet az S1-nukleáz szubsztrátja, ha tartalmaz egyszálú szakaszokat, ilyen lehet egy hurok régió vagy egy gap. Kofaktora a Zn2+, pH optimuma a savas tartományban, 4.0-4.3 között van. Felhasználható tompa vég kialakítására, illetve egyszálú DNS és RNS szelektív lebontására.

3.2.2.2. Dezoxiribonukleáz (DN-áz) I

A dezoxiribonukleáz I (DN-áz I), ellentétben a fentebb tárgyalt S1-nukleázzal, egy- és kétszálú DNS lebontására egyaránt képes. A 31 kDa méretű enzim négy izoenzim keveréke, és maximális aktivitást kalcium-, magnézium- vagy mangán-ion jelenlétében mutat. Specifitása és hatásmechanizmusa a jelen levő kofaktortól függ. Míg például Mg2+ jelenlétében a két szálat random helyeken hasítja, Mn2+ jelenlétében nagyjából egy helyen történik a hasítás, tompa vagy egy-két nukleotidnyi túlnyúló véget kialakítva. A molekuláris biológiai gyakorlatban sokrétűen felhasználható, például didezoxi- (Sanger-féle) szekvenáláskor véletlenszerű DNS fragmentumok kialakítására, vagy jelölt DNS létrehozására hasadás-elmozdulás (nick translation) technikával (ld. 3.3. ábra). Nagyon gyakran alkalmazzák fehérje vagy RNS preparátumok DNS-től való megtisztítására is.