3.3. DNS-ligázok

A restrikciós endonuklázzal kezelt DNS fragmentumok újra összeköthetők kovalensen DNS-ligáz hozzáadásával. A ligáz típusától függően a reakció kofaktora ATP (eukarióták, vírusok és bakteriofágok) vagy NAD+ (baktériumok).

Az emlősökben a DNS-ligázok négy típusa fordul elő, szerepük van többek között az Okazaki-fragmentumok összekapcsolásában (DNS-ligáz I), illetve különböző hibajavító mechanizmusokban, mint például a nukleotid-kivágással járó DNS hibajavítás (DNS-ligáz III), vagy a kétszálú DNS törése és javítása (DNS-ligáz IV).

A laboratóriumi gyakorlatban leggyakrabban a T4 bakteriofággal fertőzött E. coli-ból izolált T4-ligázt használják. Hatásmechanizmusának lényege, hogy képes a DNS egy szálán található “lyukakat” foszfodiészter kötés létrehozásával betömni (ld. 3.6. ábra). Kicsit bonyolultabb eset, ha egy restrikciós hasítás eredményeként kapott két DNS véget szeretnénk újra összekapcsolni, vagy egy plazmidba szeretnénk új inszertet ligálni. Ekkor az enzimnek két foszfodiészter kötés szintézisét kell elvégeznie. Aktivitásához ATP-re van szüksége (ellentétben az E. coli DNS-ligázzal, amely érdekes módon energiaforrásként NAD-ot használ). Ezen kívül az is feltétele a sikeres reakciónak, hogy a ligálandó két DNS vég egymáshoz megfelelően közel kerüljön, mert az enzim csak a szintézist végzi, a DNS két végét nem tartja egymás közelében. Ragadós végek esetén egyszerűbb a helyzet, mert a véletlenszerűen egymáshoz közel kerülő végek gyengén (a bázispárok hidrogénkötésein keresztül) összekapcsolódhatnak, és ha ez a kölcsönhatás elegendő ideig fennáll, a ligáz hozzá tud kapcsolódni a DNS-hez, és létrehozza a hiányzó foszfodiészter kötéseket (kondenzációs reakcióval). Tompa végek esetén nincs lehetőség az említett átmeneti kölcsönhatás kialakulására, ezért a ligálási reakció hatékonysága ebben az esetben alacsony (az enzimkoncentráció növelésével javítható). Megjegyzendő, hogy ellentétben a T4 DNS-ligázzal, az E. coli DNS-ligáz a tompa végek összekapcsolására nem képes.

A laboratóriumban a ligálási reakció egyik legfontosabb faktora a hőmérséklet. Az enzim hőmérsékleti optimuma 25oC, ezen a hőmérsékleten azonban csökken a DNS végek átmeneti kölcsönhatásának esélye. Ezért a ligálást tipikusan alacsonyabb hőmérsékleten, 16oC-on végzik, de a túlnyúló DNS végektől függően akár arra is szükség lehet, hogy 4-8oC-on történjen a reakció. Ilyenkor a szokásos néhány perc helyett több óra szükséges a hatékony ligáláshoz.

A DNS ligáz mechanizmusa

3.6. ábra: A DNS-ligáz mechanizmusa. A DNS ligázok által katalizált reakcióknak három alapvető lépése van. 1) Elsőként kovalens enzim-AMP intermedier jön létre pirofoszfát keletkezése mellett (feltéve, hogy ATP a kofaktor), az enzim egy lizin aminosaván keresztül. 2) Következő lépésként az adenil-csoport (AMP) a DNS szabad 5’-foszfát csoportjának adódik át, és 3) aktiválja azt. Végül a 4.) lépésben a 3’-hidroxil csoport nukleofil támadóként reagál az aktivált 5’-foszfát csoporttal, így összekötve a foszfátgerincet AMP felszabadulása mellett.