3.4. Végmódosító enzimek

3.4.1. Terminális transzferáz

A biotechnológiai gyakorlatban borjú csecsemőmirigyéből izolált terminális transzferáz enzim homopolimer ragadós végek kialakítására használható (“farkazás”). Az enzim gyakorlatilag egy templát-függetlenDNS-polimeráz. Ahogy fent említettük, a tompa végű ligálás hatásfoka igen alacsony, amin segíteni lehet ragadós vég mesterséges kialakításával. A tompa véget eredményező hasítás után a terminális transzferáz aktivitását kihasználva például poli(G) “farkat” lehet a DNS-re szintetizálni dGTP hozzáadásával, ami egy hasonló reakcióban előkészített, de dCTP hozzáadásával kialakított, immár ragadós végű DNS darabhoz ligálható (ld. 3.7. ábra).

A terminális transzferáz enzim aktivitása.

3.7. ábra: A terminális transzferáz enzim aktivitása. A terminális transzferáz aktivitása használható tompa végű DNS molekulák módosítására, mivel templát nélkül is képes polinukleotid lánc szintézisére. Az ábrán bemutatott példán dGTP hozzáadásával az enzim poli(G) láncot szintetizál a DNS 3’-végére, amely könnyen ligálható a komplementer szálon poli(C) farkat tartalmazó molekulával.

3.4.2. Alkalikus foszfatáz

A végmódosító enzimekhez sorolható a hidrolázok közé tartozó alkalikus foszfatáz is. Általánosságban az alkalikus foszfatáz funkciója foszfátcsoport eltávolítása különböző makromolekulákról (nukleinsavak, fehérjék, alkaloidok). Az alkalikus foszfatáz által katalizált folyamatot defoszforilálásnak nevezik (ld. 3.8. ábra).

A molekuláris biológiai gyakorlatban leggyakrabban borjúbélből izolált alkalikus foszfatázt használnak (CIAP: Calf Intestinal Alcaline Phosphatase) a DNS 5’-végén levő foszfát-csoport eltávolítására. A plazmid vektorba való klónozás során az egyik lehetséges hibaforrás, hogy a felnyitott plazmid üresen ligálódik össze (“önzáródás”). A foszfátcsoport eltávolítása ezt akadályozza meg, növelve ezzel az inszertet tartalmazó konstrukciók számát és csökkentve az úgynevezett “üres vektor” hátteret.

Az alkalikus foszfatáz által katalizált reakció

3.8. ábra: Az alkalikus foszfatáz által katalizált reakció. Klónozáskor az üres plazmid önzáródásának kivédésére alkalmazható az alkalikus foszfatázzal való kezelés, amely monofoszfát észterek (mint pl. az 5’-foszforilált DNS) defoszforilálását katalizálja.

3.4.3. T4 polinukleotid-kináz

A T4 polinukleotid-kináz (PNK) az ATP g-foszfát csoportjának a DNS szabad 5’-hidroxil végére történő átvitelét katalizálja. (A DNS-ről hiányozhat az 5’ foszfát-csoport előzetes defoszforiláció miatt, vagy ha például az oligonukleotid primereket kémiai szintézissel állították elő.) A PNK ezen kívül ADP jelenlétében képes a foszfát csoport cseréjére is (ld. 3.9. ábra). A reakció felhasználható oligonukleotidok, DNS vagy RNS 5’-végének jelölésére (g-32P) ATP használatával.

A T4 polinukleotid-kináz enzim működése

3.9. ábra: A T4 polinukleotid-kináz enzim működése. A) A T4 polinukleotid kináz (PNK) az ún. “forward” reakció során a polinukleotid szál 5’-végére viszi át az ATP g-foszfát csoportját. Radioaktív ATP-t alkalmazva a reakcióval foszfát-jelölt (P*) nukleotidot lehet előállítani. B) A kicserélődési reakció akkor megy végbe, ha feleslegben ADP-t adunk a reakcióhoz. Ekkor az enzim első lépésben a nukleinsav 5’-foszfátját viszi át az ADP-re, majd a jelölt ATP g-foszfátját a nukleinsavra.