4.2. Rekombináns konstrukciók tervezése

A rekombináns DNS molekula egy olyan mesterséges konstrukció, amely két (vagy több) DNS molekulából állítható össze. Az egyik maga a vizsgálni kívánt DNS szekvencia, a másik a hordozó DNS, amely lehetővé teszi a replikációt (és egyes esetekben a génexpressziót is). Tehát ha egy idegen DNS darabot (inszert) egy replikálódni képes DNS szekvenciával (vektor) kapcsolunk össze kovalensen, és bejuttatjuk egy, a vektornak megfelelő gazdasejtbe, akkor az idegen szekvencia is le fog másolódni. A rekombináns DNS-ek nem csak a vektor replikonjának megfelelő gazdasejtekbe, de akár teljes organizmusokba is bejuttathatók. Az utóbbi esetben genetikailag módosított élőlényt (GMO) hozunk létre (ld. 15. fejezet).

Ebben az alfejezetben a molekuláris klónozáshoz szükséges rekombináns DNS elkészítésének fő lépéseiről, a konstrukciók tervezéséről lesz szó. Honnan származhat, és hogyan állítjuk elő a vizsgálandó DNS fragmentumot, az inszertet és a hordozó DNS-t, a vektort. Részletezzük az inszert és a vektor endonukleázokkal történő hasítását; az inszert és a vektor ligálását, a rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek szelektálási lehetőségeit és végül a rekombináns DNS szekvenciájának ellenőrzési módszereit.

4.2.1. Az inszert előállítása

A rekombináns DNS tervezésének első lépése, hogy kiválasztjuk a vizsgálandó DNS szakaszt. Amennyiben a vizsgálandó DNS szekvenciája nem ismert, mert például egy korábban nem kutatott élőlény specifikus funkciójáért felelős génjét keressük, valószínűleg genomiális vagy cDNS könyvtárat kell létrehoznunk (ld. 8. fejezet). Bár manapság technikailag jelentősen kisebb kihívás egy ilyen munka, mint egy évtizeddel ezelőtt, komoly idő és pénz ráfordítással kell számolnunk. Jelentősen egyszerűbb a helyzet, ha olyan élőlény DNS-éről van szó, amely genomját már szekvenálták (ld. 9. fejezet), tehát az adott DNS szakaszok szekvenciája ismert. Ekkor a kiindulási szekvencia információt DNS adatbázisokban találjuk meg (ld. 10.1.2. fejezet). Három lehetőség áll előttünk. Az első, hogy mi előállíthatjuk az inszertet, amennyiben rendelkezésünkre áll genomiális DNS vagy RNS minta a megfelelő szervezetből vagy szövetből. A második lehetőség, hogy szintetizáltatjuk az inszertet, ami mára, bár még mindig elég drága szolgáltatás, az előnyei miatt (minimális munka és időráfordítás) egyre elterjedtebb. A harmadik eset a legolcsóbb változat, amikor egy klón adatbázisból szerezzük be a bennünket érdeklő inszertet tartalmazó kész rekombináns DNS-t (ilyen „klónmegosztó” szolgáltatás például az Addgene, amelybe bárki beteheti az általa elkészített konstrukciót, s azt bárki megkaphatja, csak a szállítási költséget kell kifizetnie). Ebben az esetben a rekombináns DNS-ből restrikciós enzimekkel közvetlenül kivághatjuk, vagy PCR segítségével (ld. 6.4.1. fejezet) „szubklónozhatjuk” az inszertet.

Az inszert előállítása attól is függ, hogy egy gént, gén fragmentumot vagy cDNS-t akarunk klónozni. A cDNS (complementary, azaz komplementer DNS) az mRNS-ről reverz transzkriptáz enzimmel készített másolat. Ez utóbbira akkor van szükségünk, ha vagy cDNS könyvtárat akarunk előállítani (ld. 8.3. fejezet) vagy expressziós konstrukciót akarunk előállítani, azaz a rekombináns fehérje a vizsgálatunk tárgya (ld. 12. és 13. fejezet). Fontos emlékeztetnünk rá, hogy az eukariótában a gének általában intronokat is tartalmaznak, azaz a gén által kódolt mRNS szekvencia nem egyezik meg a gén DNS szekvenciájával, ami tényt figyelembe kell vennünk a DNS konstrukciók tervezésekor.

4.2.1.1. Genomiális DNS inszert

Ha a génnel akarunk dolgozni, akkor vagy az adott faj genomiális könyvtárára van szükségünk vagy genomiális DNS-t kell izolálnunk. A genomiális könyvtárból kikereshetjük a bennünket érdeklő klónt valamilyen hibridizációs eljárással (kolónia- vagy plakk-hibridizáció; ld. 8.2. fejezet), de ma már sokkal egyszerűbb két specifikus primer segítségével a specifikus DNS-t génkönyvtárból vagy az általunk izolált genomiális DNS-ből származó templátról PCR-rel amplifikálni (ld.6. fejezet). A PCR primerek 5’ végébe beépíthetünk restrikciós endonukleáz felismerőhelyeket, így a klónozás a továbbiakban egy lépésben megvalósítható lesz (ld. 6.4. ábra a 6.4.1. fejezetben)

Ahogy korábban már bemutattuk, a legcélravezetőbb klónozási stratégia a direkcionális klónozás (ld. 2.2. fejezet). A PCR-t követően agaróz gélben futtatjuk a mintát, és izoláljuk a DNS terméket, ha az a DNS létrához viszonyítva a megfelelő méretű. Az izolálást követően olyan restrikciós endonukleázokkal hasítjuk az inszertet, amelyek felismerő helyét a primerekkel beépítettük az amplifikált DNS-be. Az inszertünk a hasítást követően ragadós végű lesz, azaz egy komplementer szekvenciájú, ragadós végű DNS darabbal össze tud tapadni (lehetséges tompa véget eredményező restrikciós enzimet is használni, de a tompa-végű DNS-ek ligálása, mint az korábban már említettük, nehezebb feladat). Végül újból megtisztítjuk a DNS- egy szilika oszlopon, hogy elválasszuk az enzimektől és apró nukleotid törmeléktől, és ezzel elkészítettük a ligálásra kész inszertet.

4.2.1.2. mRNS izolálás és cDNS inszert

Amennyiben a gén által kódolt fehérje a vizsgálataink tárgya, akkor az esetek többségében csak cDNS szintézis vagy esetleg szintetikus DNS jöhet szóba. Kivétel, ha be tudunk szerezni (vagy mi készítünk) egy cDNS könyvtárat, amiből vagy expressziós szkríneléssel keressük meg a szekvenciánkat tartalmazó klónt (ld. 8.3. fejezet) vagy PCR-rel állítjuk elő az inszertet.

Ha cDNS-t akarunk előállítani, tudnunk kell, hogy milyen sejtekben, szövetekben expresszálódik nagyobb mennyiségben az adott mRNS. Kiválasztjuk a megfelelő szövetet vagy sejtkultúrát, amiből először totál RNS-t izolálunk. Az RNS izolálásra számtalan módszer és kit áll rendelkezésre, amelyek közül itt csak egy klasszikus módszert említünk. Ennél a módszernél az RNS izolálás során egy lépésben történik a sejtfeltárás és a szerves-vizes fázis alapú extrakció guanidium izotiocianát-fenol-kloroform oldattal. A vizes fázis tartalmazza a totál RNS-t, amit DN-ázzal kell kezelni a kromoszomális DNS szennyezés eltávolítása érdekében. Ha cDNS könyvtárkészítés a célunk, a totál RNS-ből mRNS-t kell izolálni, ami nehéz feladatnak tűnik, mivel az mRNS a sejt teljes RNS készletének csak néhány százaléka. Azonban, legalábbis az eukarióta mRNS-eknek van egy tulajdonsága, a poli-A farok, amelyet kihasználhatunk egy egylépéses affinitás kromatográfiás tisztítási eljáráshoz. Oligodezoxitimidint (oligo-dT) kötünk kovalensen egy szénhidrát mátrixhoz (pl. oligo-dT cellulóz), s a teljes RNS készletből csak az mRNS-ek kötődnek az oszlophoz. A cDNS-t reverz transzkriptáz enzimmel (ld. 3.1.5. fejezet) állítjuk elő, oligo-dT primert alkalmazva.

Amennyiben egy expressziós konstrukció elkészítése a cél, közvetlenül a totál RNS-ről is írhatunk át cDNS-t amelyet PCR-rel sokszorosíthatunk (RT-PCR, ld. 6.4.4. fejezet). A PCR-hez ebben az esetben is olyan primereket célszerű tervezni, amelyek a tapadó régión kívül tartalmaznak egy restrikciós endonukleáz felismerőhelyet az 5’ túlnyúló végükön.

4.2.2. A vektor előkészítése

Nagyon sokféle klónozó és expressziós vektor áll rendelkezésünkre. Fontos tudnunk, hogy „csak” klónozni akarunk E. coli sejtekben vagy más gazdasejttel is dolgozni akarunk, mivel a vektorok replikonjai specifikusak a gazdasejtekre. Amennyiben a rekombináns DNS konstrukciónkat több gazdába is be akarjuk juttatni, akkor bináris (shuttle: „ingázó”) vektort kell használnunk, ami két gazdában is képes replikálódni. Figyelembe kell venni a rendelkezésre álló klónozóhelyeket, a szelekciós markereket, esetleg további szabályozó elemek jelenlétét vagy hiányát az alkalmazni kívánt vektorban. A céljainknak legmegfelelőbb vektort kiválasztjuk (ld. 7. fejezet), a vektor DNS-t felszaporítjuk és előkészítjük az inszert befogadására.

Az üres, vagyis inszertet még nem tartalmazó vektorból nagyobb mennyiségre van szükségünk. Ehhez E.coli baktériumokba transzformálunk egy kis mennyiségű DNS-t, majd miniprepet készítünk (ld. 4.1.1.2. ). A vektor DNS-t ezután az inszert készítésekor használt restrikciós endonukleázokkal hasítjuk (pl. itt is BamHI és XhoI), így az is ragadós végű lesz, komplementer az inszert DNS 5’- és 3’-végével. Ezzel a vektor is készen áll a már említett direkcionális klónozásra. Ha csak egyfajta restrikciós endonukleázzal hasítunk, fennáll a veszélye a vektor önzáródásának vagy konkatamerek képződésének. Ezért a hasított vektort alkalikus foszfatázzal (CIAP) kezeljük, ami eltávolítja a linearizált vektor DNS 5’-végéről a foszfát csoportot (ezzel megakadályozhatjuk a vektor-önzáródást). A vektort ezt követően gélből izoláljuk (ld. 4.1.2.4. fejezet).

4.2.3. Ligálás

A ligálás az a folyamat, melynek során két kompatibilis, ragadós vagy tompa végű DNS molekulát összekapcsolunk. Ezzel a lépéssel építjük be a vizsgálni kívánt DNS szekvenciát, az inszertet a vektorba. A ligálás körülményeit gondosan kell megválasztani, hogy sikeres legyen. Először meg kell bizonyosodnunk arról, milyen koncentrációjú az inszert és vektor DNS oldatunk.

Elvileg megbecsülhető, hogy milyen valószínűséggel jönnek létre rekombináns molekulák, ha egyféle enzimmel nyitottuk fel a cirkuláris vektort és ugyanazok a ragadós végek találhatók az inszertünk két végén. Az ún. effektív végkoncentráció kiszámolható:

j = 51,1 x [Ms]½

(Ms: molekulatömeg; tehát pl. egy linearizált pBR322 fág j értéke 32 μg/ml). Ha a vektor koncentrációja jóval kisebb, mint az effektív koncentráció (c<<j), akkor a cirkularizáció kerül túlsúlyba (azaz üres vektorok keletkeznek), ellenben ha magasabb (c>>j), akkor elsősorban konkatemerek jönnek létre. A teoretikusan legtöbb rekombináns DNS kb. 1:2,5 vektor:inszert koncentrációaránynál keletkezik, tehát ebben az esetben kb. 2-3-szoros inszert felesleg jelenlétében érdemes ligálni. Ha a vektor önzáródást kivédtük a 4.2.2. fejezetben ismertetett módon, az inszert felesleget 3-4-szerese emelhetjük.

A reakció elegybe a két DNS-en kívül a DNS-ligáz enzimet és puffert kell adni. Enzimként leggyakrabban a T4 bakteriofágból származó DNS-ligázt használjuk, amely a foszfodiészter kötés létrehozásához szükséges energiát ATP-ből nyeri (az ATP-t általában az enzimmel együtt vásárolt puffer tartalmazza). Előnye ennek az enzimnek az E.coli saját DNS-ligázával szemben, hogy tompa végű DNS-eket is össze tud ligálni (ld. 3.3. fejezet). Az enzimreakció lezajlása után E.coli sejtekbe kell juttatnunk a cirkularizálódott rekombináns DNS-t, transzformálással. Ezt követően agar táptalajt tartalmazó Petri-csészékre szélesztjük a transzformált baktérium kultúrát (kb. 200 µl). Mivel a vektorok mindig tartalmaznak valamilyen antibiotikum rezisztencia gént, ezért az agarba antibiotikumot keverve szelektálhatóak azok a baktérium sejtek, amelyek felvették a plazmidot. Mivel az üresen összezáródott, inszertet nem tartalmazó, de az antibiotikum rezisztencia gént hordozó plazmidot tartalmazó baktérium-telepek is megjelenhetnek a lemezen, a rekombináns DNS-ek kiválasztásához egy másodlagos szelekcióra is szükségünk lesz, amire példa a később ismertetendő ún. „kék-fehér” szelekció (ld. 7.2.3.1. fejezet).

A rekombináns klónokból néhányat egy steril pipettahegy vagy fogpiszkáló segítségével 3-5 ml-es térfogatú táplevesbe oltunk. Ezekből miniprepet készítünk. A tisztított rekombináns DNS-t nagyon fontos újból ellenőriznünk, hogy valóban tartalmazza-e a megfelelő inszertet. Ezért azzal a két endonukleázzal kezeljük, amelyekkel a klónozás elején a vektor felnyitottuk. Ha agaróz gélben futtatjuk az emésztést követően a DNS mintát, akkor sikeres konstrukció esetén két DNS sávot kell látnunk. Az egyik a linearizált üres vektor, a másik pedig az inszert DNS a megfelelő méretnél. A gélen mintát vihetünk fel negatív kontrollként az üres vektor két adott (itt BamHI és XhoI) restrikciós enzimmel emésztett elegyéből, pozitív kontrolként pedig az izolált inszertből is.

A 4.15. ábrán példaként egy expressziós vektor konstrukció elkészítésnek sémáját, fő lépéseit mutatjuk be:

  • a fentieknek megfelelően előállítjuk az inszertet (ebben az esetben cDNS-t készítünk reverz transzkripció, majd PCR segítségével; további részletek a 6.4.4.és a 8.3.1. fejezetekben)

  • előkészítjük a vektort (ebben az esetben egy expressziós vektort használunk)

  • in vitro ligáljuk a vektort és inszertet

  • a rekombináns DNS-t gazdasejtbe juttatjuk transzformálással (ld. 4.3.1. fejezet)

  • a rekombináns DNS-t felvett sejteket felszaporítjuk és a rekombináns fehérjét expresszáljuk (ld. 12.2. fejezet).

Egy expressziós konstrukció elkészítésének sémája

4.15. ábra: Egy expressziós konstrukció elkészítésének sémája. A példa egy expressziós vektorba ligált cDNS inszert előállításának lépéseit mutatja: inszert elkészítése, vektor előkészítése, ligálás, transzformálás, sejtnövesztés és fehérje expresszió

4.2.4. TA/Topo-klónozás

A TA- vagy más néven Topo-klónozás egy olyan klónozási technológia, melynek során sem DNS-ligázra, sem restrikciós endonukleázokra nincs szükség. A TA-klónozás alapja, hogy az inszertet olyan DNS-polimerázzal amplifikáljuk, aminek hiányzik az 5’→3’ hibajavító nukleáz aktivitása, viszont van templát független polimeráz aktivitása (terminális-transzferáz aktivitása) és meg tudja hosszabbítani egy nukleotiddal a DNS szálak 3’-végét. Ilyen enzim a Taq-polimeráz, amely preferenciálisan egy adenin nukleotidot ad hozzá a láncvégekhez. Szükségünk van még egy speciális vektorra is. A TA-klónozó vektorok linearizált, 3’-túlnyúló timin ragadós végeket tartalmaznak, amelyek bázispárosodnak az inszerten lévő 3’-túlnyúló adeninnal. A linearizált vektor 3’-végéhez a vakcínia vírus DNS-topoizomeráz I enzimet kovalensen hozzákapcsolták, amely elősegíteni a két DNS szál ligálódását (ld. 4.16. ábra). A konstrukciókat a transzformálást követően itt is a kék-fehér szelekció elvén lehet szelektálni (ld. 7.2.3.1. fejezet).

Az ún. TA-klónozás sémája.

4.16. ábra: Az ún. TA-klónozás sémája. A vakcínia vírus DNS-topoizomeráz enzime egyaránt funkcionál restrikciós enzimként és ligázként. Egy speciális szekvenciát ismer fel a dupla szálú DNS-en: 5´-CCCTT-3'. Az enzim a replikáció során ennél a szekvenciánál hasítja a DNS foszfodiészter kötését az egyik szálon egy túlnyúló timint hagyva, majd a szuperhelikális DNS feszültsége lecsökken, és az enzim újra ligálja a láncot a 3’ timin foszfát csoportjánál. Az elvágott szál 3’-végének foszfátja és a topoizomeráz tirozinje között kovalens kötés alakul ki. Ha a vektort és az inszertet összekeverjük, akkor a PCR termék 5’-végi OH- csoportja támadja a foszfotirozil kötést, elősegítve a ligáz reakciót és a topoizomeráz leválását. A kereskedelemben kapható vektorokat linearizálva lehet megvásárolni, topoizomerázzal kötve. Így a vektort 5 perc alatt ligálja a megfelelő kompatibilis végű PCR termékkel.

4.2.5. Ligálás-független klónozás

Ennél a módszernél sincs szükség DNS-ligázra és restrikciós enzimre. A módszer egyes DNS-polimerázok (pl. T4, Pfu) 3’→5’ exonukleáz aktivitására épül, amelynek köszönhetően hosszú, ragadós végek keletkeznek az inszerten és a linearizált vektoron egyaránt. Az inszertet PCR reakcióval amplifikáljuk. A primereket úgy kell megtervezni, hogy legalább 15 nukleotid hosszúságú túlnyúló véggel rendelkezzenek, melyek majd kompatibilisek lesznek a vektor túlnyúló végeivel. Az inszertet tartalmazó vektor ligálás nélkül is transzformálható kompetens sejtekbe, ahol az endogén DNS-ligáz hozza létre a foszfodiészter kötéseket. A primer túlnyúló végeiből hiányzik valamelyik nukleotid, pl. a dCMP. Ebben az esetben egy 3’→5’ exonukleáz aktivitású polimeráz dGTP jelenlétében a 3’-végtől kezdve eltávolítja a nukleotidokat, amíg nem találkozik az első citozinnal a templáton, ahova beépítheti a guanin nukleotidot (ld. 4.17. ábra).

4.17. ábra: A ligálás-független klónozáshoz előkészített inszert

A vektort is hasonló módon kell előkészíteni, de előbb hasítani kell egy restrikciós endonukleázzal (pl. tompa véget kialakító enzimmel), amelynek környezetében ugyanolyan távolságra helyezkedik el az első gunanin nukleotid, mint az inszert esetében a citozin nukleotid. A vektort is kezeljük a 3’→5’ exonukleáz aktivitású polimerázzal dCTP jelenlétében, így komplementer ragadós véget fogunk kapni.

4.2.6. Restrikciós hasítás nélküli ligálás rekombinációval (attB, attP)

Ez a módszer a helyspecifikus rekombináció elvén alapszik, ahol a DNS szakasz kivágódását vagy beépülését rövid, specifikus bázissorrendű szakaszok teszik lehetővé. Ilyen például a λ-fág attB és baktérium attP (attachment site) régiói. Az inszertbe a primerrel visszük be ezeket a szakaszokat. Ezt a reakciót a Invitrogene cég BP-klonáz enzime katalizálja (a klónozó rendszert Gateway-nek nevezték el). A Cre-Lox rendszerrel könnyedén ki lehet alakítani deléciót, inszerciót, inverziót és transzlokációt sejten belül attól függően, hogy a Lox helyek hogyan helyezkednek el. A P1 bakteriofág Cre-rekombináz enzime elhasítja a DNS-t, ha LoxP (34 nt) felismerési szekvenciát talál, és rekombinációt katalizál. Ez a módszer főleg transzgenikus élőlények létrehozásához használatos (ld. 14.3.2. fejezet). A Gateway klónozásról további részleteket a 14.3.2. fejezetben olvashatnak.