5. fejezet - DNS szekvenálás

Tartalom

5.1. Kémiai szekvenálás: radioaktív végjelölt templát
5.2. Enzimatikus szekvenálás: láncterminációs módszer
5.2.1. Manuális láncterminációs szekvenálás
5.2.2. Automata fluoreszcens szekvenálás
5.3. Új-generációs szekvenálás
5.3.1. Piroszekvenálás
5.3.2. Illumina/Solexa szekvenálás
5.3.3. SOLiD (Sequencing by Oligonucleotid Ligation and Detection)
5.3.4. TSMS (True Single Molecule Sequencing: Valódi egymolekulás szekvenálás)
5.3.5. SMRT (Single Molecule Real-time: Egymolekulás valósidejű) szekvenálás
5.4. További olvasnivaló a fejezethez

A DNS molekula felfedezését követően intenzíven foglalkoztatta a tudományt, hogy a különböző fajok vagy fajon belüli egyedek DNS-e milyen mértékben mutat egyezést vagy eltérést. Mi az, ami befolyásolhatja különböző tulajdonságok meglétét vagy hiányát, illetve bizonyos betegségek kialakulását. Ezért egyre fontosabbá vált olyan módszerek kifejlesztése, melyek segítségével meg lehet határozni a DNS szekvenciáját. Definíció szerint a DNS szekvenálás az a folyamat, melynek során meghatározzuk egy DNS molekula nukleotid sorrendjét. Napjainkban a DNS szekvenálás a molekuláris biológia egyik legmeghatározóbb eszközévé vált. A modern szekvenáló technikákkal már számos élőlény teljes genomját, köztük az emberét is sikeresen meghatározták (ld. 9. fejezet).

Az 1970-es évektől kezdve két módszert fejlesztettek ki, amelyek közül a Sanger-féle láncterminációs (enzimatikus) módszer szinte egyeduralkodóvá vált. A fluoreszcens detektálás megjelenésével és automatizálásával könnyebbé és gyorsabbá vált a DNS szekvenálás. Végül az ezredfordulón jelentek meg a teljesen más mechanizmuson alapuló, még nagyobb hatékonyságú és olcsóbb ún. új-generációs szekvenáló módszerek (next-generation sequencing), amelyek az információszerzés mennyiségét tekintve újabb forradalmi változást indítottak el a molekuláris biológiába. Jelenleg ezeket a módszereket és az automata láncterminációs szekvenálást párhuzamosan használja a géntechnológia. A fejezetben ezeket a módszereket tekintjük át.

5.1. Kémiai szekvenálás: radioaktív végjelölt templát

Az eljárást kidolgozóiról Maxam-Gilbert-féle szekvenálásnak is nevezzük. 1977-től ez volt az első széles körben elterjedt szekvenáló eljárás. Manapság azonban már nem igazán használják, mert kiszorult a Sanger-féle módszer kidolgozását követően.

A módszer a DNS kémiai módosításán és az azt követő specifikus bázis mentén történő hasításon alapult. A DNS szálak 5’-végét radioaktív 32P-tal jelölték (polinukleotid-kináz enzimmel, ld. 3.4.3. fejezet), majd a két komplementer szálat gélelektroforézissel izolálták. Ezután négy részre osztották a mintát és négyféle kémiai kezelés hatására, meghatározott nukleotidok vagy nukleotid párok mentén (A+G, G, C+T, C) törések keletkeztek a DNS-ben. A négyféle reakció: a purinok (A+G) hangyasavval depurinálhatóak; a guanin dimetil-szulfáttal metilálódik; a pirimidinek (C+T) hidrazinnal metilálódnak; a hidrazinhoz adott NaCl gátolja a timin metilálódását, így csak a citozinok módosulnak. A reakció lezajlása után mindegyik mintához forró piperidint adnak, aminek a hatására a cukor-foszfát gerinc elhasad. A reagensek koncentrációját úgy állították be, hogy átlagosan egy DNS molekula csak egyszer módosult. Végül denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis segítségével elválasztották a különböző méretű, akár egy bázis különbségű DNS-fragmentumokat, melyek azonosítása autoradiográfiával történt. A gélben lévő négy reakciósor mintáinak nukleotid sorrendjére a sávok helyzetéből lehetett következtetni.