5.2. Enzimatikus szekvenálás: láncterminációs módszer

Történetileg az első DNS szekvenálási módszert Sanger már 1975-ben kidolgozta (ez volt az ún. „plusz-mínusz” módszer, amelyet itt nem ismertetünk), de az igazi áttörést az 1977-ben publikált láncterminációs (más néven didezoxi-) szekvenálás jelentette. Egyszerűségének és megbízhatóságának köszönhetően hamar elterjedt, és nagyon népszerűvé vált. Nagy előnye volt a kémiai módszerrel összevetve, hogy maga az eljárás kevesebb mérgező vegyszert és radioaktív vegyületet igényelt.

A DNS-t ennél a módszernél klónozni kell, az eredeti módszer szerint egyszálú terméket eredményező vektorba. Erre a célra az M13-alapú bakteriofág vektorok feleltek meg (ld. 7.3.2. fejezet), ma azonban már használhatunk bármilyen kétszálú rekombináns DNS-t is a Sanger-féle szekvenálás céljára, sőt PCR termékeket is közvetlenül szekvenálhatunk. A templátként szolgáló szálról DNS-polimeráz segítségével egy szintetikus primertől kezdődően jelölt új szálat szintetizálunk, de a négyfelé osztott reakcióhoz olyan didezoxinukleotid analógokat használunk, amelyeket ugyan az enzim elfogad szubsztrátként, de láncvégződést (láncterminációt) okoznak. A didezoxinukleotidokról hiányzik a 3'-hidroxil csoport, ezért nem képesek foszfodiészter kötést létrehozni a templátnak megfelelő következő aktivált nukleotiddal, azaz a DNS-polimeráz működése egy ilyen nukleotid analóg beépülése után leáll. A didezoxinukleotidokat a „normál” dNTP-hez képest olyan arányban kell hozzáadni a szekvenáló reakciókhoz, hogy a szintézis egy adott ddNTP jelenlétében a templáton található komplementer nukleotidnak megfelelő összes pozícióban leálljon. Ily módon annyiféle hosszúságú új lánc keletkezik, ahány pozícióban a ddNTP-vel komplementer bázis a templát szálon előfordul. A didezoxiribonukleozid-trifoszfátok szerkezetét az 5.1. ábrán, a random lánctermináció sémáját pedig az 5.2. ábrán mutatjuk be.

DNS-polimeráz lánctermináció didezoxinukleotid jelenlétében

5.1. ábra: A didezoxinukleotid hatására bekövetkező DNS-polimeráz lánctermináció. A ddNTP-hez, a 3’-hidroxil csoport hiánya miatt, nem képes további aktivált nukleotid kapcsolódni a szintézis során, így a DNS polimerizáció megszakad.

5.2.1. Manuális láncterminációs szekvenálás

A manuális szekvenálás eredményének láthatóvá tétele autoradiográfiával történt. A radioaktív jelölés lehetett a primeren, a dNTP-ken (leggyakrabban a dCTP-t jelölték) vagy a ddNTP-ken egyaránt. A módszer hőskorában kizárólag a viszonylag rövid felezési idejű (13,4 nap), béta-sugárzó 32P izotópot használták. Hátránya volt, hogy a jelölt nukleotid minta hamar lefeleződött és csak szigorú biztonsági intézkedéseket betartva lehetett a szekvenálást végezni. Később ezt az izotópot felváltotta az alfa-sugárzó, ezáltal kevésbé veszélyes 35S izotóp (a foszfát-csoport egyik oxigén atomját lehet kicserélni kénre), ami ráadásul sokkal hosszabb felezési idejű (87,5 nap) is. Ennek az izotópnak a hátránya viszont az volt, hogy a gyengébb sugárzás miatt az autoradiogramok előhívása hosszabb időt igényelt. A Sanger-féle láncterminációs szekvenálás sémáját az 5.2. ábrán láthatjuk.

A láncterminációs enzimatikus szekvenálás sémája

5.2. ábra: A láncterminációs enzimatikus szekvenálás sémája. Az ábra alján a szekvenáló létráról olvasható le az újonnan szintetizált DNS lánc nukleotid sorrendje (a primertől kezdve, ami nem látszik) alulról felfelé

Az eljárás azzal kezdődik, hogy a DNS mintát (templát) négyfelé osztják. Az egyes mintákhoz a négyféle dNTP-t és sorra az egyik ddNTP-t adják. Például az első csőbe a négyféle dNTP mellett ddATP is tesznek, így az új szál szintézise a templáton levő timin nukleotidok után random leállhat. A négy reakcióelegy tehát abban különbözik, hogy különböző didezoxi-nukleotidot tartalmaz, de elvileg nem lehet bennük azonos hosszúságú, újonnan szintetizálódott szál. A reakció eredményeként kapott, különböző hosszúságú DNS-fragmentumok végül egy nagyméretű, lap alakú („slab”) denaturáló poliakrilamid-urea elektroforézis gélen választhatók el egymástól. Azért kell a gélhez urea denaturálószert adni, hogy a jelölt új szálon esetleg kialakuló bázispárosodó régiók vagy a jelen levő templát szállal kialakuló duplex DNS (térszerkezete lévén) ne befolyásolja a DNS szálak mobilitását az elektroforézis során.

A reakcióelegyeket külön futtatják a négy ddNTP stop nukleotidnak megfelelően. Egy adott reakció csak egyféle ddNTP-t tartalmaz, például a ddCTP-t tartalmazó elegy mindig a citozinok, a ddGTP-t tartalmazó pedig a guaninok elhelyezkedését mutatja meg, így a négy mintából összeáll a DNS szekvenciája (lényegében mindegy, hogy az újonnan szintetizált vagy a komplementer templát szál szekvenciáját „olvassuk le”). Az elektroforézist követően a sávokat autoradiográfiával teszik láthatóvá. A nukleotidok sorrendjének leolvasása az egyes mintáknak megfelelő oszlopoknál alulról felfelé történik (ezt nevezzük szekvenáló létrának). Ha a legrövidebb (a gélen a legnagyobb mobilitású) csík a didezoxi-citidines reakcióelegynél található, akkor a DNS szekvenciája C-vel folytatódik a primer után (bár a gyakorlatban a primer utáni első néhány nukleotid általában nem detektálható). Ha a következő csík a didezoxi-guaninos elegynél látható, akkor a szekvencia guaninnal folytatódik. A leolvasás így megy tovább, amíg még a csíkok megbízhatóan elválnak egymástól (500-1000 nukleotid hosszúságig).

5.2.2. Automata fluoreszcens szekvenálás

Az automata fluoreszcens szekvenálás kidolgozása és az automata szekvenátorok megjelenése (a technika kidolgozása Leroy Hood nevéhez fűződik) tette lehetővé a genom projektek megszületését, mivel nagymértékben felgyorsította a Sanger-féle szekvenáló reakciók futtatását (ld. 5.3. ábra).

5.3. ábra: Egy automata fluoreszcens DNS szekvenátor (a Biomi Kft.-nek köszönjük a fotót)

További újítás volt, hogy a reakció „fokozása” érdekében egy PCR készülékben zajlik a láncszintézis, ezáltal kevesebb templáttal lehet indítani a reakciót, illetve több jelölt új DNS fragmentum keletkezik, így a detektálás is könnyebbé válik. Az automata fluoreszcens szekvenálás során radioaktív jelölések helyett kizárólag fluoreszcens festéket alkalmaznak. A fluorofórt vagy a ddNTP-kre vagy a szekvenáló primerekre lehet bevinni. Ma leggyakrabban a BigDye nevű, négyféle fluoreszcens tulajdonsággal (ez négyféle hullámhosszon megjelenő emittált fényt jelent) rendelkező ddNTP analógokat használják (ld. 5.4. ábra).

A módszer egyszerűségét az adja, hogy négy reakcióelegy helyett elegendő eggyel dolgozni, köszönhetően a négyféle eltérő fluoreszcens festékkel jelölt didezoxi-nukleotidoknak. A jelölt DNS fragmentumokat kapilláris gélelektroforézissel választják szét. Az eltérő méretű fragmentumok kimutatása fluoreszcencia-spektroszkópiával történik. A gélt UV-lézerrel világítják meg (bele van építve a detektorba), és amikor áthalad egy jelölt oligonukleotid, akkor az emittált fény amplitúdóját négyféle hullámhosszon egy detektor érzékeli. Az adatokat végül számítógéppel lehet analizálni, amely azonnal megmutatja a nukleotidok sorrendjét (kromatogram vagy szekvenogram). Négy szín reprezentálja a különböző nukleotidokat: piros = T, zöld = A, sárga = G, kék = C. Egy automata szekvenálás eredményét (szekvenogram) az 5.5. ábra mutatja be.

5.4. ábra: A BigDye fluoreszcens ddNTP analógok szerkezete

5.5. ábra: Automata fluoreszcens láncterminációs szekvenálás eredménye (kromatogram vagy szekvenogram)

Szekvenátortól függően egyszerre akár 96 mintát is tudnak szekvenálni kapilláris géllel, és egy futással körülbelül 900-1000 nukleotidig lehet leolvasni a szekvenciát. Enyhe hátránya a módszernek, hogy a lánctermináló nukleotidok beépülése a DNS fragmentumokba eltérő mértékű lehet, így egyenetlen alakú és magasságú csúcsokat lehet kapni az elektronikusan kiértékelt kromatogramon. Ezeket a problémákat úgy próbálják meg kiküszöbölni, hogy módosított DNS-polimeráz enzim rendszert és festéket alkalmaznak, amely minimalizálja az egyenlőtlen beépülés okozta hibákat. További elvárás minden DNS szekvenáló projekt esetében, függetlenül a módszertől, hogy mindkét DNS szálat szekvenálni kell, mivel így, ha a két független információ a komplementaritásnak megfelelő lesz, biztosak lehetünk benne, hogy a templát valós szekvenciáját olvastuk le, vagyis fejtettük meg.

Manapság több biotechnológiai cégtől is vásárolhatunk láncterminációs szekvenáló kitet, amely tartalmazza a szekvenáláshoz szükséges reagenseket, így a reakciót magunk is el tudjuk végezni, csak a futtatáshoz veszünk igénybe szolgáltatást. Alternatív megoldás, hogy csak a szekvenálandó templátot (és esetleg oligonukleotid primert) küldjük el a szolgáltatónak, akitől egy szekvencia kromatogramot kapunk vissza. (A láncterminációs szekvenálásról még ld. 18.4. animáció. )