6. fejezet - Polimeráz láncreakció (PCR)

Tartalom

6.1. A PCR lépései
6.1.1. Denaturálás
6.1.2. Anellálás
6.1.3. Polimerizáció/lánchosszabbítás (extenzió)
6.2. A PCR reakció komponensei
6.2.1. PCR templát
6.2.2. PCR enzimek
6.2.3. PCR primerek
6.2.4. Egyéb PCR komponensek
6.3. A PCR termék (amplikon) detektálása és kvantitatív PCR
6.3.1. Agaróz és poliakrilamid gélelektroforézis
6.3.2. Valós idejű (real-time) vagy kvantitatív (q-) PCR
6.4. A PCR az alapkutatásban
6.4.1. A PCR termék (amplikon) klónozása és klónozás PCR-rel
6.4.2. Szekvenálás PCR készülékben
6.4.3. Mutagenezis
6.4.4. Reverz transzkripciós (RT-) PCR
6.4.5. További PCR módszerek (random, fúziós, multiplex, fészkes és inverz)
6.5. PCR az alkalmazott kutatásban
6.5.1. Orvosi diagnosztika
6.5.2. Igazságügyi orvostan (DNS „ujjlenyomat”)
6.5.3. „Ős”-PCR
6.6. További olvasnivaló a fejezethez

6.1. A PCR lépései

A polimeráz láncreakció 1983-as felfedezése óta (ld. 1.5.1. fejezet) mára a modern biológiai kutatások és számos alkalmazott tudományterület nélkülözhetetlen módszerévé vált. A PCR jelentőségét az adja, hogy DNS-polimeráz enzimet használva laboratóriumban, tehát in vitro, molekuláris klónozás nélkül is képesek vagyunk specifikus DNS molekulákat sokszorosítani. A PCR eljárás során egy ciklusban három fázist különböztetünk meg (ld. 6.1. ábra).

  1. Denaturálás: a kettős szálú DNS szétválasztását biztosítja.

  2. Anellálás: szintetikus, rövid DNS oligonukleotidok tapadása (bázispárosodással) a templát szálhoz, amelyek a DNS-polimeráz számára primerként szolgálnak.

  3. Polimerizáció (extenzió): a cél DNS szintetizálása aktivált monomerek (dNTP-k) beépítésével.

A PCR első három ciklusának sematikus ábrázolása

6.1. ábra: A PCR első három ciklusának sematikus ábrázolása. Színkód: piros, a többszörözni kívánt célszekvencia; kék, a teljes DNS szekvencia; fekete, primerek; zöld, újonnan szintetizált DNS. A második ciklusban a 3 fázist megismételve új végtermék keletkezik, amelyeknek egyik vége már egybeesik a kívánt minta végével. Végül láthatjuk, hogy a 3. ciklusban végbemenő folyamatok a célszekvencia (az amplikon) megjelenéséhez vezetnek.

6.1.1. Denaturálás

A DNS replikáció első fázisában a kettőshélixnek szét kell válnia, hogy az egyes szálak templátként tudjanak szolgálni a polimerizáció során. Ez a folyamat a sejten belül enzimatikusan megy végbe, a kettőshélix széttekerésében motorfehérjék, DNS-helikázok vesznek részt. A helikázok ATP felhasználásával a kémiai energiát mechanikai munkává alakítják át, azaz a DNS szálon végighaladva a bázisok közötti H-kötéseket szétbontják. A PCR során a DNS két szálának szétválasztása nem enzimatikusan, hanem termodinamikai úton történik - magas hőmérséklet hatására a bázisokat összetartó hidrogénkötések felszakadnak. A másodlagos kötések széteséséhez szükséges hőmérséklet függ az adott DNS hosszától - minél több bázispárt tartalmaz a polimer, annál magasabb hőfok szükséges a teljes felbomlásához. A PCR első fázisában, a denaturáció során 92-98°C közötti hőmérsékletet használunk. Ez a hőmérséklet tartomány elegendő ahhoz, hogy a DNS templát hosszától (és komplexitásától) függetlenül teljes mértékben szétválasszuk a két szálat. A PCR „hőskorában” ez a magas hőmérsékletű fázis okozta azt a problémát, hogy minden egyes ciklust követően új DNS-polimeráz enzimet kellett a reakcióhoz adni. Ezt a problémát sikerült a Taq-polimeráz használatával megoldani. A Thermus aquaticus baktériumot a Yellowstone Nemzeti Park egyik hőforrásában fedezték fel. A hőforrás vize 50-80°C között ingadozik (a baktériumnak optimális hőmérséklet pedig 72°C-on van), ennek köszönhetően a benne található fehérjék ezekhez a szélsőséges körülményekhez adaptálódtak, így közel 100°C-on sem veszítik el natív szerkezetüket (pontosabban ezen a hőmérsékleten lassan már csökken az aktivitásuk, amit a PCR ciklusok előrehaladtával folyamatosan kompenzálni lehet). A manapság használatos PCR enzimek között több hőtűrő (termofil) és extrém hőtűrő (extremofil) baktériumból származó természetes vagy rekombináns, esetleg további előnyös tulajdonsággal „feljavított” DNS-polimeráz található (ld. 3.1.4. és 6.2.2. fejezetek).

6.1.2. Anellálás

Az PCR második fázisában történik a rövid DNS primerek templáthoz tapadása, anellálása. Mivel a denaturációhoz használt magas hőmérséklet megakadályozná a DNS primerek megfelelő helyre való tapadását, ebben a fázisban a hőmérsékletet le kell csökkenteni. A megfelelő tapadáshoz szükséges hőmérséklet függ az adott primerek hosszától és szekvenciájától, tehát a reakció során ennek függvényében állítjuk be az anellációs hőmérsékletet. Ha nem megfelelően állítjuk be, akkor attól függően, hogy alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékletet használunk, több problémába ütközhetünk. Először is, ha az optimálisnál alacsonyabb hőmérsékletet állítunk be, akkor a primerek tapadása aspecifikussá válhat, és nem a megfelelő szekvenciájú részhez vagy több helyhez kötődve indul el a DNS polimerizáció, így nem a megfelelő, vagy többféle terméket kapunk (ez a mispriming-nak nevezett jelenség). Ha magasabb hőmérsékletet állítunk be az anellációhoz, akkor a DNS primerünk nem lesz képes kötődni a templát szálhoz. A gyakorlatban tapasztalt ideális hőmérséklet tartomány a DNS primerek kötődésére 55-65°C között van (az anellálási hőmérsékletet megbecsülhetjük az adott oligonukleotid olvadási hőmérsékletének kiszámításával, ld.6.2.3. és 10.3.4. fejezet).

6.1.3. Polimerizáció/lánchosszabbítás (extenzió)

A DNS lánc szintézise, a polimerizáció vagy lánchosszabbítás (extenzió) a DNS-polimeráz elsődleges feladata. Az élővilágban számtalan különböző tulajdonságú DNS-polimeráz enzim található (ld. 3.1. fejezet). A közös jellemzőjük, hogy a templát szálra szintetizált primerekből kiindulva, azok 3’ OH-csoportjára képesek a következő dNTP-t a templátnak megfelelően beépíteni. Az egyes polimeráz enzimek rendelkezhetnek 3’→-5’ és 5’→3’ exonukleáz aktivitással, amelyek közül az első tulajdonság a hibajavításért, míg a második elsősorban az RNS primerek elbontásáért felelős (ld. 3.1. fejezet). A különböző polimerázok templátról történő másolási hűsége is nagyban különbözhet egymástól, ezért fontos hogy a PCR során olyan enzimmel dolgozzunk, aminek megfelelő a hatékonysága.

A PCR harmadik fázisában hőtűrő baktériumokból izolált, illetve manapság már rekombináns módszerekkel előállított polimerázok végzik a DNS szintézisét. Ezeknek az enzimeknek a megfelelő működéséhez optimális hőmérséklet szükséges, ami 70-80°C között van. A módszer mindhárom fázisában fontos a megfelelő időintervallum beállítása (elég idő kell mind a teljes kettős szálú DNS szétnyílásához, mind a primerek megfelelő helyre való letapadáshoz), de főként a polimerizációs fázisban kell odafigyelni, mivel minél hosszabb DNS szakaszt akarunk felerősíteni, annál több időre van szüksége az enzimnek. Általánosságban számolhatunk úgy, hogy 1 perc alatt a DNS-polimeráz ezer nukleotidot épít be, de ma már kaphatóak ennél gyorsabb enzimek is.

A DNS termék mennyisége nagyban függ a ciklusok számától. A láncnövekedés mértéke elméletileg exponenciális, amit a következő egyenlettel lehet leírni:

Nt = Nk(1+H)n-2

Nk kiindulási célszekvenciák számából n ciklust követően szintetizálódott Nt (teljes) célszekvenciák száma a totális végtermék (amit amplikonnak is nevezünk), H hatékonyság mellett. Ideális esetben H = 1, azonban a DNS-polimeráz több ciklust követően veszít a hatékonyságából, valamint a reakció során fogyó reagensek következtében a polimerizáció hatékonysága az idővel csökken. Végül figyelembe kell venni azt is, hogy a PCR molekuláris sajátsága miatt a reakció első két ciklusában még nem keletkezik a kívánt méretű DNS szál (ld. 6.1. ábra).

Látható, hogy a PCR folyamán egy ciklus alatt a különböző fázisokhoz eltérő hőmérséklet szükséges, ezért az automatizált PCR készülék egy programozható termosztát (ld. 6.2. ábra). (A polimeráz láncreakcióról még ld. 11.1.2., 11.2.3. , 16.2.1. fejezetek és a 18.5. animáció. )

6.2. ábra: PCR készülék