6.2. A PCR reakció komponensei

Az in vitro DNS sokszorosításhoz a fent leírtak szerint számos komponensre van szükség. Ezeket részletezzük ebben a fejezetben, elsősorban praktikus szempontokat előtérbe helyezve.

6.2.1. PCR templát

A kívánt célszekvencia felerősítéséhez szükséges templát DNS számos forrásból származhat. A molekuláris biológiai alapkutatás során számtalan célból végezhetünk PCR reakciót, például rekombináns fehérjét kódoló gén felerősítésére (expressziós konstrukció készítéséhez), vagy taxonómiai azonosításhoz (pl. „környezeti” PCR). Az első esetben templátként különböző szövetekből vagy szervekből származó RNS-ről készült cDNS-t használhatunk (ld. 6.4.4.). Ha nem áll rendelkezésünkre megfelelő minőségű cDNS (akár cDNS könyvtár, akár saját magunk által totál RNS preparátumról készített cDNS), akkor az egyes DNS konstrukciókhoz használt templátot meg is rendelhetjük valamely biotechnológiai cégtől vagy a non-profit rekombináns DNS „klónmegosztó” szervezettől, az Addgene-től.

 A faj alapú azonosításokhoz ma már elengedhetetlen a PCR használata. A mikrobiológia ennek a módszernek a segítségével képes különböző forrásból származó mintákban előforduló baktériumokat nagy pontossággal azonosítani. Az orvosi diagnosztikában például a páciensből származó mintákból felerősített PCR termék segítségével lehet megmondani, hogy a fertőzést milyen kórokozó okozhatta (legyen az akár egysejtű eukarióta, akár baktérium, akár vírus). Az igazságügyi orvostanban a DNS-t minta alapján lehet egy apasági perben a biológiai apát, egy bűnügyben pedig az elkövetőt (amennyiben DNS-t tartalmazó biológia mintát hagy hátra a tett színhelyén) azonosítani.

A PCR, mint DNS amplifikációs módszer óriási előnye, hogy a templát DNS-nek nem kell tisztított preparátumnak lenni, azaz sejt- vagy szövetminta, DNS-t tartalmazó bármilyen, akár „koszos” minta PCR templátként szolgálhat. Ügyelnünk kell azonban egyes mintákban (pl. vér, talaj) a „PCR inhibitorok” jelenlétére. Ezeknek a negatív hatását számos módon lehet csökkenteni (pl. a vér esetében hozzáadott BSA-val vagy Chelex gyantával).

6.2.2. PCR enzimek

A forgalomba került, magas hőmérsékletet elviselő, röviden hőstabil DNS-polimeráz enzimek száma az utóbbi két évtizedben megtöbbszöröződött. Ezeket leggyakrabban hőforrásokban élő baktériumokból, mélytengeri, vagy óceánaljzaton élő hipertermofil ősbaktériumokból izolálják.

A hőtűrő baktériumokból izolált enzimeket rendszerint klónozzák, annak érdekében, hogy rekombináns fehérjeként nagyobb mennyiségben és nagyobb tisztasággal tudják előállítani megfelelő baktériumokban, például E. coli-ban. Ilyen enzim a Taq-polimeráz tulajdonságaival rendelkező Amplitaq→, amelyet szintén a Cetus szabadalmaztatott, és még ma is ideális rövid DNS szakaszok többszörözésére. Ugyanakkor probléma, hogy az eltérő gyártóktól kapható ugyanolyan fajta enzimek is eltérnek egymástól a felerősíthető termék hosszában, mennyiségében és másolási pontosságában. A Taq-polimeráz hátránya az alacsony másolási pontosság (1 hiba/104 bp), aminek az az oka, hogy az enzim nem rendelkezik 3’→5’ hibajavító exonukleáz aktivitással. Széles körben elterjedt a Vent- és a Pfu-polimeráz enzimek, amelyek 3’→5’ exonukleáz aktivitású DNS-polimerázok. A Vent DNS-polimerázt a Thermococcus litoralis, míg a Pfu DNS-polimerázt a Pyrococcus furiosus hipertermofil, mélytengeri hidrotermális kürtőkben elő Archea baktériumokból klónozták. Az utóbbi a jelenleg ismert legnagyobb másolási hűséggel működő polimeráz enzim (~10-6 hiba/bp). Előnyük még, hogy magas hőmérsékleten jóval alacsonyabb a felezési idejük a Taq enzimhez képest. A 3’→5’ exonukleáz aktivitású enzimek kiemelkedő másolási hűségüknek köszönhetően jóval hosszabb láncú DNS szekvenciák többszörözésére is alkalmasak, mint a Taq enzim, ugyanakkor általában lassabb a lánchosszabbító sebességük.

Helyspecifikus mutációval a polimeráz enzimek pontossága, hőstabilitása tovább fokozható. Például a Pfu polimerázt úgy módosították, hogy a polimeráz doménjéhez egy kettős-szálú DNS-kötő domént fuzionáltattak, ezzel megnövelve az enzim pontosságát és hatékonyságát (ez a Phusion DNS-polimeráz). (A hőstabil DNS-polimerázokkal a 3.1.4. fejezet is foglalkozott.)

Bizonyos DNS-polimerázok, megfelelő körülmények mellett, RNS reverz transzkripciójára is képesek; ilyen enzim a Thermus thermophilus-ból izolált Tth DNS-polimeráz. Ennek az enzimnek a használatával nem szükséges külön reverz transzkriptáz enzimet adni a reakcióhoz, amennyiben RNS mintából indulunk ki és RT-PCR (ld. 6.4.4. fejezet) vagy kvantitatív, valós idejű PCR-t (ld. 6.3.2. fejezet) végzünk. A végtermék tisztaságának növelése érdekében egyes DNS-polimerázokat úgy módosítottak, hogy csak a denaturációs hőmérsékleten aktiválódjon. Ezt a módszert hívjuk „Hot Start” PCR-nek. Történhet az ideiglenes inaktiválás ellenanyaggal is, amely a DNS-polimerázhoz kapcsolódik, majd a denaturációs hőmérsékleten elválik tőle, és visszafordíthatatlanul denaturálódik. A Hot Start PCR-rel működő enzimek között igen széles a választék, ilyen DNS-polimeráz például az AmpliTaq Gold néven forgalmazott módosított Taq-polimeráz.

6.2.3. PCR primerek

A PCR során történő DNS sokszorosításhoz szintetikus (dezoxi)oligonukleotid primereket használunk. A reakcióhoz egy ún. "forward" (5’-) és egy "reverse" (3’-) primer szükséges. Az első a felerősíteni kívánt DNS szakasz 5’-végén a komplementer szálhoz fog anellálni, míg az utóbbi az átírandó DNS szakasz 3’-végével komplementer. A mindennapi géntechnológiai alkalmazás során általában 18-25 nukleotid hosszúságú primereket érdemes tervezni, ennél hosszabb primerek már nem növelik jelentősen a reakció fajlagosságát. A primerek szekvenciájának a 3’-végtől legalább 10 nukleotid távolságra tökéletesen komplementernek kell lennie a templát szállal, a primer 5’-végen viszont nem feltétel a komplementaritás (ezt a lehetőséget lehet kihasználni például a PCR termék vektorba történő beépítése során, ld. 6.4.1. )

A primerek tervezése során több szempontot figyelembe kell venni. Először is a két tervezett primer (forward, reverse) ne legyen egymás komplementere, még részlegesen sem. Ekkor ugyanis ún. primer dimerek jönnek létre, mivel a két primer kapcsolódását követően a DNS-polimeráz az egyiket templátként használva rövid szakaszokat szintetizál. A primer dimerek kialakulása nagyban csökkenti a helyes PCR termék keletkezését. Ügyelni kell arra is, hogy a tervezett primeren belül ne alakuljon ki másodlagos szerkezet, például hajtűkanyar, mert az erősen gátolja a templát DNS-re való kötődését. A reakció során az alkalmazott primer koncentráció is döntő fontosságú, mivel túl alacsony koncentráció esetén csökken a letapadás esélye az anellálás során, míg túl magas primer mennyiséget alkalmazva nem kívánt, aspecifikus termékeket is kaphatunk. Az anellálás hőmérsékletének meghatározásához kiemelkedően fontos a primerek szekvenciája. A templáthoz kötődés jellemző tulajdonság a Tm, más néven olvadási hőmérséklet. Ez a paraméter jelzi azt a hőmérsékletet, ahol a kettős szálú DNS-ek fele szétválik. Ennek meghatározásához figyelembe kell venni a primerek hosszát és nukleotid tartalmát. Körülbelül 20-40 nukleotid hosszúságig a következő egyszerű formulával (ún. Wallace-szabály, ld. 10.3.4. fejezet) számolhatjuk ki az olvadási hőmérsékletet:

Tm(°C) = 4(G + C) + 2(A + T)

A képlet szerint a guanin-citozin (G-C) bázispárok 4°C-kal, míg az adenin-timin (A-T) bázispárok 2°C-kal járulnak hozzá az olvadási hőmérséklethez. A primerek olvadáspont számításáról további részletek találhatók a 10.3.4 fejezetben. A PCR reakció alatt az anellációhoz szükséges hőmérsékletet (Ta) általában a Tm-nél 5°C-kal alacsonyabban határozzuk meg. A tervezés során ügyelni kell arra, hogy a két primer anellációs hőmérséklete ne térjen el nagyon egymástól, így a PCR során mindkét primer kapcsolódási esélye közel azonos lesz.

6.2.4. Egyéb PCR komponensek

A megfelelő PCR-hez a fent leírtakon kívül számos más reagens is szükséges. Az egyes DNS-polimerázok helyes működéséhez az adott enzimhez optimális puffert kell használni, amit általában a megvásárolt enzimhez adnak. A DNS-polimerázokhoz kapható különböző pufferoldatokban általában Tris-HCl és valamilyen só, például NaCl, KCl található. Az oldatok pH-ja általában 8,5 körül van, ami majd a reakció során (a magasabb hőmérsékleten) ~7,2-re csökken. A kereskedelmi forgalomban lévő pufferoldatok általában tízszer töményebbek a végső koncentrációkhoz képest, így hígítani kell őket a reakció összemérésekor. A pufferoldatok ezen kívül tartalmazhatnak egyéb, a reakció hatékonyságát növelő anyagokat. Például redukálószereket (pl.: ditiotreitolt), detergenseket (pl: Triton X-100) vagy más ún. erősítő szereket, például: glicerint, zselatint vagy DMSO-t. Ezek az anyagok főleg a DNS-polimerázt stabilizálják, növelik a hatásfokát, de magas koncentrációban gátolhatják is a PCR reakciót.

A reakcióhoz szükséges még mind a négy fajta dezoxiribonukleotid (dNTP), egyenlő arányban, ugyanis az eltolt dNTP arány negatívan befolyásolhatja az amplikon keletkezését. A dNTP-k egyfelől a DNS szintéziséhez szükséges aktivált monomerek, másrészt energiaforrásként szolgálnak a DNS-polimeráz motor funkciójához (a polimeráz végighalad a templáton, tehát nem csak kémiai, hanem mechanikai munkát is végez). Kereskedelmi forgalomban kiváló minőségű dNTP keverékekhez juthatunk hozzá, 2-10 mM koncentrációjú törzsoldatban. A PCR során általában 50-200 mM koncentráció között dolgozunk

A DNS-polimerázok helyes működéséhez az enzimnek szüksége van valamilyen kétértékű kationra. A legideálisabb a Mg2+, de a fehérje képes Mn2+ mellett is működni, igaz nem a legjobb hatásfokon. Emellett ezek az ionok a dNTP-kel komplexet képezve szolgálnak szubsztrátként az enzim számára. Megjegyzendő, hogy sokszor a kétértékű kation koncentrációja befolyásolja az amplikon mennyiségét és specifitását is, ezért nem minden pufferoldatban van benne előre a Mg2+,mi is hozzáadhatjuk a reakcióhoz, amennyiben azt optimalizálnunk kell.