7. fejezet - Vektor-gazda rendszerek

Tartalom

7.1. A vektorok általános jellemzői
7.1.1. Klónozó és expressziós vektorok
7.1.2. Antibiotikum rezisztencia gének
7.2. Plazmid vektorok
7.2.1. A plazmidok általános jellemzői
7.2.2. A pBR322 vektor
7.2.3. A pUC vektorcsalád
7.2.4. Fágmidok
7.3. Bakteriofág vektorok
7.3.1. λ-fág vektorok
7.3.2. M13-alapú vektorok
7.4. Kozmidok
7.5. Mesterséges kromoszómák (PAC, BAC, YAC, HAC)
7.6. Élesztő és egyéb eukarióta vektorok és gazdasejtek
7.7. További olvasnivaló a fejezethez

Korábban bemutattuk, hogy rekombináns DNS előállításához szükségünk van egy hordozó DNS vázra, a vektorra, amibe in vitro a molekuláris klónozás tárgyát, az inszert DNS-t beépíthetjük (2.2. és 4.2. fejezetek). A klónozás in vivo részéhez a rekombináns DNS-t megfelelő gazdaszervezetbe kell juttatnunk (génbevitel, ld. 4.3. fejezet). Ebben a fejezetben a vektorok típusait ismertetjük. A vektor legfőbb tulajdonsága, hogy képes önálló szaporodásra valamilyen gazdaszervezetben, azaz egy replikon. A replikációhoz szükség van egy replikációs origóra és az azt körülvevő szabályozó szekvenciákra. A replikon milyensége dönti el, hogy az adott vektor milyen gazdasejtben képes szaporodni. Vektorokat eredetük szerint plazmidokból, bakteriofágokból, vírusokból, transzpozonokból és kromoszómákból (bakteriális, élesztő, sőt humán kromoszómák) lehet előállítani, géntechnológiai úton. A plazmidok és a fágok hasznos tulajdonságainak ötvözéséből születtek meg a kevert típusú kozmid és fágmid vektorok.

A gazdasejteket tekintve a mindennapi géntechnológiai gyakorlatban a Gram-negatív Escherichia coli baktérium a legelterjedtebb gazdaszervezet. Klónozni gyakorlatilag csak E. coli sejtekben szoktunk. Egyes alkalmazásokhoz (például fehérjék túltermeltetésére) kutatási és ipari célra más baktérium fajokat is használnak, mint pl. a Gram-pozitív Bacillus subtilis, de ebben a jegyzetben csak E. coli gazdatörzsekkel foglalkozunk. A bakteriális rendszer előnye, hogy sokféle vektor típushoz használható, egyszerű és relatíve olcsó a laboratóriumi fenntartása, gyorsan szaporodik (optimális körülmények között 20 perc alatt osztódik), és mivel az emberi vastagbél bioflórájának tagja, ezért nem allergén. Ugyan léteznek patogén E. coli törzsek is (pl. az O104:H4), a géntechnológiai gyakorlatban elsősorban használt K-12-es törzs és több száz genetikai variánsa igen biztonságosnak tekinthetők, az emberi bélcsatornában nem képesek szaporodni. A géntechnológiában használatos legfontosabb E. coli K-12 altörzseket, genotípusukat és jelentőségüket, valamint a fontosabb genetikai markereket a 7.1. táblázatban és 7.2. táblázatban foglaljuk össze (nem mindegyik fenotípussal foglalkozunk a jegyzetben, ezekről mikrobiológiai kézikönyvekben, illetve ezen a weblapon található további információ). A K-12 törzs mellett a B törzs néhány variánsát is használjuk a géntechnológiában, pl. a fehérjeexpresszióhoz a BL21-et és szárnazékait. Ezekről részletesebben a ld. 12.2.2.2. fejezet olvashatnak.

Az eukarióta gazdasejtek közül a laboratóriumi tenyésztést tekintve az élesztő áll legközelebb az E. coli sejtekhez. Különböző géntechnológiai célokra használunk még rovarsejteket, növényi és állati sejteket is, amelyekkel a jegyzet későbbi fejezeteiben foglalkozunk. Fontos megjegyezni, hogy az eukarióta gazdasejtek esetében gyakorlatilag minden esetben ún. „shuttle” (ingázó) vektorokat használunk, amelyek kétféle gazdában is szaporodni tudnak (bináris = kettős replikonnal rendelkeznek). Ennek az az oka, hogy mint azt már említettük, a molekuláris klónozás, a rekombináns DNS elkészítése minden esetben E. coli gazdában történik, s a már felszaporított konstrukciót juttatjuk be az eukarióta gazdába.

7.1. táblázat: E. coli K-12 altörzsek

7.2. táblázat: Néhány fontos E. coli genetikai marker

7.1. A vektorok általános jellemzői

A vektorok az egyes gazda szervezetek DNS információjának módosításához használt általános géntechnológiai eszközök, a klónozandó DNS (az inszert) hordozómolekulái.

Milyen tulajdonságokkal kell rendelkezni egy DNS molekulának, hogy vektor céljára használhassuk? Önálló replikációra kell képesnek lennie. Kicsi méretűnek kell lennie, mivel akkor könnyű dolgozni vele a laboratóriumban; az ideális méret 2-5 kbp (1,4-3,5 MDa). Egyedi restrikciós helyekkel kell rendelkeznie, s végül kell tartalmazni legalább egy szelekciós marker gént.

7.1.1. Klónozó és expressziós vektorok

A vektorokat felhasználásuk alapján két nagy csoportra oszthatjuk. Az első csoportba a klónozó vektorok tartoznak, melyeket specifikus DNS információ tárolására, sokszorosítására használhatunk fel. Ezek a vektorok a gazdaszervezetre jellemző replikonnal kell, hogy rendelkezzenek A „jó vektorok” alapkövetelménye, hogy az organizmus DNS állományának replikációjától függetlenül képesek sokszorozódni, ebből kifolyólag több kópiában is előfordulhatnak. Minden vektornak, amelybe mesterségen kívánunk idegen DNS információt építeni, rendelkeznie kell klónozó hellyel. A legtöbbször ezek ún. multiklónozó (poliklónozó) helyek (MCS: Multiple Cloning Site), amelyek a vektorban csak egyszer előforduló, egymás mellett elhelyezkedő különböző restrikciós endonukleáz felismerő helyek. Szelekciós marker génként a legtöbb vektorban antibiotikum rezisztencia gént használnak.

A második nagy csoportba az expressziós vektorok tartoznak. Ezek a DNS konstrukciók olyan szabályzó elemeket tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik, hogy a bennük tárolt DNS információ (az inszert) képes legyen fehérjeként kifejeződni, expresszálódni. Az expressziós vektoroknak tartalmazniuk kell a klónozó hely előtt egy promóter régiót, ami lehetővé teszi a transzkripciót és ami leginkább meghatározza az expresszálandó fehérje mennyiségét. A promóter működésének szabályozhatósága kulcsfontosságú a gyakorlatban - ennek segítségével elkerülhetjük az „idő előtti” fehérje expressziót, illetve azt kívánalmainknak megfelelően indíthatjuk el. Az egyik legismertebb és leginkább alkalmazott szabályzó mechanizmus az E. coli lac operon elemeire épül, amelynek lényege röviden, hogy a génexpresszió csak allolaktóz jelenlétében indul be. A gyakorlatban az allolaktózt metabolikusan nem bontható analóg molekulával, izopropil β-D-tiogalaktoziddal (IPTG-vel) helyettesítjük.

7.1.2. Antibiotikum rezisztencia gének

A plazmidok felfedezésekor hamar fény derült arra, hogy ezek az extrakromoszomális elemek gyakran tartalmaznak antibiotikum-rezisztencia géneket, amelyek horizontális géntranszferrel nem csak a fajon belül, de különböző fajok között is vándorolhatnak. A gyakorlatban az antibiotikum-rezisztencia géneket szelekciós marker génekként használjuk. Ha a vektor rendelkezik valamely antibiotikum-rezisztencia génnel, az adott antibiotikumot tartalmazó táptalajon csak azok az egyedek lesznek életképesek, amelyekbe bekerült a vektor DNS (azonban az antibiotikum az üres és az inszertet tartalmazó vektor között nem szelektál, arra például a „kék-fehér” szelekció alkalmas (ld. 7.2.3.1).

Az egyik legelterjedtebb antibiotikum az ampicillin, ami az elsőként felfedezett penicillin félszintetikus változata (ld. 7.1. ábra). Az ampicillin, elődjéhez hasonlóan, béta-laktám antibiotikum, amely kötődik és ún. öngyilkos szubsztrátként gátolja a sejtfal peptidoglikán szintézisben szerepet játszó transzpeptidáz enzimet, és ezáltal gátolja a baktérium növekedését. Szerkezeti sajátsága, hogy egy aminocsoport kapcsolódik a penicillin alapstruktúrájához (aminopenicillin), így néhány Gram-negatív baktérium fehérjeburokkal védett membránján is át tud hatolni, ezzel szélesebb baktériumölő spektrummal rendelkezik. Egy másik penicillin változat a karbenicillin (karboxipenicillin), ami a fent leírt ampicillinhez képest a Gram-negatív baktériumok felé szélesebb hatásspektrummal bír. Annak ellenére, hogy a karboxipenicillinek a béta-laktamáz enzimekkel szemben kevésbé ellenállóak, a könnyen degradálódó ampicillinhez képest jóval stabilabbak. Mindkét gátlószer elleni rezisztenciát a már fent említett béta-laktamáz enzim biztosítja, amely képes elhasítani a béta-laktám-gyűrűt, ezáltal hatástalanítja a molekulát.

7.1. ábra: Az ampicillin szerkezete

A kloramfenikol antibiotikumot 1949-ben állították elő először. Alkalmazása igen elterjedt, mert gyártása olcsó és nagyon hatékony baktérium-növekedést gátló szer, hatásspektruma széles. Bakteriosztatikus képességének molekuláris háttere, hogy a transzláció során a riboszóma komplex 50S alegységéhez köt, így gátolja a fehérjeszintézist. A laboratóriumi gyakorlatban használt kloramfenikol rezisztencia gén egy kloramfenikol-acetiltranszferáz enzimet kódol, amely úgy képes inaktiválni az antibiotikumot, hogy arra két darab acetil-csoportot köt, így a szer már nem képes kifejteni a hatását.

Egy másik fehérjeszintézis gátló antibiotikum a tetraciklin, amelyet a Streptomyces baktériumok termelnek és egy széles spektrumú poliketid típusú természetes antibiotikum. A kloramfenikollal ellentétben az aminoacil-tRNS mRNS-riboszóma komplexhez való kötődését gátolja a 30S alegységhez kötődve. A tetraciklin rezisztenciát egy 40 kDa-os membránfehérje biztosítja, amely aktív módon kipumpálja az antibiotikumot a sejtből.

A kanamicin nevű antibiotikumot a Streptomyces kanamyceticus baktérium termeli, és a tetraciklinhez hasonlóan a prokarióta riboszóma 30S alegységéhez köt, és ott transzlációs hibát indukál, amellyel gátolja a fehérjék átíródását. A kanamicinnel közeli rokon molekula a neomicin. Mindkét antibiotikum aminoglikozid típusú szer, továbbá mindkettő hatékonyan gátolja főképp a Gram-negatív, kisebb részben a Gram-pozitív baktériumok növekedését. Inaktiválásukat egy acetil-transzferáz enzim végzi, amely egy vektorban kódolva biztosítja a rezisztenciát.

A sztreptomicin nevű antibakteriális szert, ahogyan nevéből is kiderül, a Streptomyces griseus nevű baktérium bioszintézisének természetes termékeként fedezték fel 1943-ban. Gyógyászati felhasználásban a tuberkulózis kezelésében vált igen népszerűvé. A kanamicinhez és neomicinhez hasonlóan ez az antibiotikum is az aminoglikozidok közé tartozik, és a fehérjeszintézist gátolja. Hatását a 30S riboszóma alegység 16S rRNS-éhez kötve fejti ki. Ennek következtében kodon elcsúszás alakul ki, ami végső soron a baktérium halálához vezet. A rezisztencia génje sztreptomicin-6-foszfotranszferáz enzimet kódol, ami az antibiotikumot foszforilálva gátolja annak működését.

Az utolsóként bemutatott antibakteriális molekula a zeocin, amely egy glikopeptid, és mikróba ölő képessége abban rejlik, hogy a kettősszálú DNS-be interkalálódva, kettősszál-törést okoz. Ezen tulajdonságának köszönhetően széles spektrumú antibiotikum. A sejten kívül a zeocin réz-ionnal komplexet képezve inaktív formában van, míg a sejten belül a redukáló környezetben a réz-ion leválik a glikopeptidről és így aktívvá válik. A zeocin-rezisztencia gén egy Streptoalloteichus hindustanus nevű organizmusból származó 14 kDa molekulatömegű fehérjét kódol, ami megköti az antibiotikumot, és így az nem képes a DNS-t hasítani.