7.2. Plazmid vektorok

7.2.1. A plazmidok általános jellemzői

Az első plazmidot az 1940-es évek elején azonosították egy Shigella baktérium fajból. A plazmidok rövid, néhány kbp és 200 kbp közötti méretű, extrakromoszomális, kettős szálú cirkuláris DNS molekulák, amelyek az organizmus kromoszómájától függetlenül képesek replikálódni (azaz replikonok).

Replikációjukat a baktérium kromoszómájának replikációjához szükséges enzimek egy része végzi (DNS-polimeráz I, DNS-polimeráz III, stb.). A replikáció kezdőpontját itt is a replikációs origó jelöli ki. Az origó környékén található szekvenciák szabályozzák a kópiaszámot. A legtöbb plazmid a kromoszomális DNS-ek általános bidirekcionális replikációs mechanizmusától eltérően unidirekcionálisan másolódik (azaz az origótól csak egy replikációs villa indul el). A ma használatos plazmid vektorok replikációja független a sejtosztódástól, ún. relaxált kontroll alatt áll. Ilyen például a pMB1 plazmidban található replikon. (Ezt a plazmidot először egy klinikai mintából izolálták 1974-ben). Az eredeti szekvenciájú pMB1 replikont tartalmazó vektorok kópiaszáma sejtenként 15-20. Az E. coli plazmidok között több különböző replikon szekvenciát is találtak (ColE1, p15A, pSC101). Két különböző szekvenciájú, különböző típusú replikont tartalmazó plazmid egymás mellett stabilan fenntartható ugyanabban a sejtben. Az azonos replikációs origót hordozó plazmidok azonban egymással inkompatibilisek, ezekből csak egyféle fordulhat elő egy sejtben (kivéve, ha két különböző antibiotikummal kettős szelekciót alkalmazunk a két azonos replikonnal rendelkező plazmid esetén).

Minthogy a plazmidok replikációja nem függ fehérjék expressziójától (a szükséges enzimek hosszú életidejűek a sejtben), a gazdasejt fehérjeszintézisének kloramfenikollal való gátlásával el lehet azt érni, hogy a sejt nem lesz képes a kromoszomális DNS-ét replikálni, de a plazmid szintézise tovább folyik. Ezzel az eljárással, melyet amplifikálásnak nevezünk, tovább növelhető egy plazmid kópiaszáma.

A plazmidokat funkcionális szempontból több csoportba oszthatjuk. Az elsőbe az ún. konjugatív plazmidok tartoznak, mint pl. az E. coli F-faktora (fertilitási-faktor), amelyek a baktériumok közötti ivaros szaporodást, a konjugációt biztosító episzómák (kromoszómán kívüli genetikai elemek). A konjugáció során a két baktérium az F-faktor-kódolta pilin oligomer fehérjéből álló piluson keresztül kapcsolódik össze. A plazmidok nagy másik csoportjába tartoznak a már említett rezisztencia géneket hordozó plazmidok, amelyek szintén képesek horizontális géntranszferrel más egyedekbe átjutni és biztosítani az adott antibiotikummal szemben ellenállóságot. A harmadik plazmid csoport az E. coli baktériumra jellemző, általuk termelt és más E. coli vonalakra (és más baktériumokra) ható toxinokat kódol.

Ebben a fejezetben néhány „klasszikus” plazmid-alapú vektort és vektorcsaládot fogunk bemutatni, további plazmid vektorokról a későbbi fejezetekben lesz szó.

7.2.2. A pBR322 vektor

Az első széles körben ismertté vált E. coli kompatibilis klónozó vektort 1977-ben állították elő a Kaliforniai Egyetemen, amelyet pBR322 névre kereszteltek el (BR a feltaláló Bolivar Rodriguez monogramja). Ez a vektor 4361 bázispárból áll, megtalálható benne egy ampicillin és egy tetraciklin rezisztencia gén, valamint egy természetes E. coli plazmidból, a pMB1-ből származó replikációs origó. A plazmidon belül 40 egyedi restrikciós hasítóhely található, amelyekbe inszertet lehet beépíteni. 11 klónozó hely a tetraciklin rezisztenciát, míg 6 darab az ampicillin rezisztenciát kódoló régióban található, így az inszert beépülésére az adott rezisztencia gén funkcióvesztése mellett lehet szelektálni. (Ebben a vektorban még nem volt multiklónozó hely) (ld. 7.2. ábra).

A pBR322 vektor térképe

7.2. ábra: A pBR322 vektor térképe. A replikációs origón kívül (ori) látható a két antibiotikum rezisztencia gén (AmpR és TcR), valamint a bennük található 6, illetve 11 restrikciós endonukleáz felismerő hely.

7.2.3. A pUC vektorcsalád

A pUC klónozó vektorcsalád is a Kaliforniai Egyetemen látott napvilágot (az UC rövidítés a University of California névből ered). Sikerét egy igen ötletes tulajdonságának köszönheti, ami jócskán leegyszerűsítette a klónozás sikerét bizonyító másodlagos szelekciót (az elsődleges szelekció az antibiotikum rezisztencia, viszont annak eldöntésére, hogy üres vektor vagy rekombináns DNS került a gazdasejtbe, szükségünk lehet egy másodlagos szelekcióra is).

A pUC18 vektor térképe

7.3. ábra: A pUC18 vektor térképe. A replikációs origó (ori) mellett ampicillin rezisztencia gént (AmpR), a kék-fehér szelekciót biztosító β-galaktozidáz (LacZα) α-fragmentumát kódoló gént és az utóbbin belül egy multiklónozó helyet (MCS) tartalmaz.

A pUC vektor család multiklónozó helyei

7.4. ábra: A pUC vektor család két tagjának (pUC18 és pUC19) multiklónozó helyei, amelyek egymáshoz képest reverz irányban helyezkednek el

A pUC vektor egy 2686 bp méretű plazmid, ami a pMB1 replikációs origón kívül tartalmaz még egy ampicillin rezisztencia gént, valamint a β-galaktozidáz (lacZ) enzimet kódoló gén egy darabját (lacZ’). Ennek a génnek köszönhető a másodlagos, ún. kék-fehér szelekció (ld. lentebb). További előnye, hogy a pMB1 replikon szekvenciájának módosításával a kópiaszám 500-700-ra növekedett. A vektorcsaládon belül a pUC18 és a pUC19 abban különböznek, hogy a multiklónozó helyük (MCS) egymáshoz képest reverz módon helyezkedik el (ld. 7.3. ábra és 7.4. ábra).

7.2.3.1. A „kék-fehér” szelekció

A kék-fehér szelekció segítséget nyújthat annak eldöntésében, hogy a létrehozni kívánt rekombináns plazmid tartalamazza-e az inszertet. Azok a baktérium telepek, amelyekben sikeresen klónozott, inszertet tartalmazó plazmid van, fehérek lesznek, az üres vektort tartalmazó telepek viszont kékek. A látványos teszt molekuláris alapja a β-galaktozidáz enzim működésében rejlik és az ún. a-komplementáción alapszik. A β-galaktozidáz négy azonos alegységből álló fehérje, és csak ebben a formában aktív. Az egyes alegységek két peptidre bonthatók szét (egy rövidebb N-terminális LacZ a-fragmentumra és egy nagyméretű LacZ w-fragmentumra), aminek következtében felbomlik a homotetramer szerkezet, és az enzim inaktív lesz. Ha a két peptidet újra összekeverjük (vagyis az w-fragmentumot kiegészítjük az a-fragmentummal, amit genetikai kifejezéssel a-komplementációnak hívunk), spontán kialakul az aktív enzimszerkezet.

A szelekció során az enzimnek ezt a spontán összeszerelődési képességét használjuk ki oly módon, hogy az a-fragmentumot a plazmid kódolja, míg az w-fragmentumot a gazdasejt genomja. Mivel a cél az inszert beépülésének a vizsgálata, a vektorban a multiklónozó hely (MCS) az a-fragmentumot kódoló szakaszba van beépítve. Vagyis sikeres klónozás esetén az a-fragmentumot kódoló szakasz elromlik, és az a-fragmentum nem tud kifejeződni. Ebben az esetben tehát az IPTG-vel való indukció eredményeként az inszert által kódolt fehérje fog expresszálódni, és a telepek fehérek lesznek. Az üres vektort tartalmazó baktériumok IPTG indukció hatására az enzim mindkét fragmentumát szintetizálják, ami azt eredményezi, hogy egy kromogén szubsztrát, az 5-bróm-4-klór-3-indolil-ß-D-galaktozid (X-gal) jelenlétében kék színű baktérium telepek keletkeznek. (ld. 7.5. ábra).

A „kék-fehér” szelekció molekuláris háttere

7.5. ábra: A „kék-fehér” szelekció molekuláris háttere. A csonkolt β-galaktozidáz enzim (sárga) IPTG jelenlétében a gazdasejtben termelődik, de inaktív marad, míg a vektorban kódolt enzim a-fragmentum (piros) ki nem egészíti, és aktívvá nem teszi. Ez az a-komplementáció jelensége. Az aktív enzim az X-gal szubsztrátot bontja, és kék csapadék keletkezik, ami kék színűvé teszi a telepet is. Ha az inszerció sikeres, akkor az enzim fragmentum nem termelődik, így a kolónia fehér színű marad.

7.2.4. Fágmidok

A fágmidok, mint képzett szó fonalas (bakterio)fág ésplazmid kombinációjára utalt. Ebből adódóan jellemzői az előbbi kettő tulajdonságainak keveréke. A fágmidok a gyakorlatban klónozó vektorként használhatók. Egyrészről tartalmaznak egy plazmid replikációs origót, másrészről megtalálható bennük az f1 fágból származó f1 origó is. Ez utóbbi a fonalas (fibrózus) fágokra jellemző és biztosítja azt, hogy a fágmidről egyszálú DNS is átíródjon, majd az virionba pakolódva, a későbbi gazda organizmusba átvihető legyen. A fág részecskébe csomagoláshoz szükség van ún. segítő (helper) plazmidokra is, amelyek az egyszálú DNS replikációját biztosítják és a virionba való pakoláshoz szükséges géneket kódolják. A fágmidok, a fibrózus fágokhoz hasonlóan nem lítikusak, tehát kiszabadulásukkor nem esik szét a gazdasejt, hanem a sejtet folyamatosan új vírusrészecskék kiválasztására készteti. A fonalas fágok, s ebből adódóan a fágmidok fertőző képességéhez az is szükséges, hogy a gazdasejt rendelkezzen pilussal. A fágmidok tehát kizárólag olyan gazdasejttel alkalmazhatóak, amelyben megtalálható vagy F-faktor, vagy annak valamilyen változata. A fágmidokat korábban szekvenálásra, valamint irányított mutagenezishez alkalmazott konstrukciókhoz használták, mivel egyszálú templátot lehet róla egyszerűen előállítani (maga a rekombináns fágmid a fág részecskében egyszálú).

Az egyik legismertebb klónozó fágmid a pBlueScript (pBS) vektor, amely a pUC vektorcsaládra nagyon hasonlít (ld. 7.6. ábra). Egyrészt tartalmaz egy plazmid és egy f1 replikációs origót. Ezen kívül ampicillin rezisztencia gént kódol, valamint 21 restrikciós endonukleáz kompatibilis MCS-t, amely a pUC vektor családra jellemző β-galaktozidáz α-peptidet kódoló régióján belül található. Utóbbinak köszönhetően az inszert beépülése nyomon követhető a kék-fehér szelekció segítségével. Megemlítendő még, hogy a poliklónozó hely két végén egy-egy T7 illetve T3 fág-specifikus promóter található, amelyekről az adott promóterre specifikus RNS-polimerázzal in vitro transzkripciót lehet végezni az inszert mindkét száláról.

A pBlueScript fágmid vektor térképe

7.6. ábra: A pBlueScript fágmid vektor térképe. A vektor tartalmazza, mind a plazmid (ori), mint a fonalas fágokra jellemző f1 replikációs origót. Ezen kívül található benne egy ampicillin (AmpR) rezisztencia gén, valamint a "kék-fehér" szelekciót biztosító β-galaktozidáz (LacZα) fragmentum kódoló régiója, és ez utóbbin belül egy MCS. A klónozott gén kifejeződését T7, illetve T3 promóterrel is el lehet indítani